Ringraziamo Sergei Demin e Tatyana Karamysheva per il loro aiuto nella preparazione dei cromosomi e FISH su Anopheles. Ringraziamo anche David Severson per averci fornito Aedes e Culex DNA genomico cloni BAC e Melissa Wade per la modifica del testo. Questo lavoro è stato sostenuto da due sovvenzioni dal National Institutes of Health: 1R21 AI88035-01 a Maria V. Sharakhova e 1R21 AI094289-01 a Igor V. Sharakhov.

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	<li>Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V., Verrity, J. F., Abbington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome Mapping Research Developments. , (2008).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly.">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome biology. 8, R5 (2007).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Non fluorescente ibridazione in situ su cromosomi mitotici di zanzare è stata eseguita per la prima volta nel 1990 da A. e K. Kumar Rai 17. In questo studio, 18S e 28S DNA geni ribosomali, clonato nel plasmide insieme uno, sono stati collocati i cromosomi di 20 specie di zanzare. La sonda di DNA è stato marcato radioattivamente e ibridizzati ai cromosomi gangli cerebrali. Tra i tre generi di zanzare, una tecnica FISH è stato sviluppato solo per i cromosomi mitotici dalla linea cellulare di Ae. aegypti 10,18,19 e non è mai stata eseguita su cromosomi mitotici dalle zanzare dal vivo. Recentemente, abbiamo messo a punto una tecnica semplice ed affidabile per ottenere alta qualità di preparazioni cromosomiche da ID di larve di 4 ° instar 9. Questo metodo permette un elevato numero di cromosomi da ottenere in una diapositiva e può essere usato universalmente per tutte le specie di zanzare. La necessità di usare sta solo larve non, pupa o adultoGES di zanzare, per la preparazione del vetrino è probabilmente l&#39;unica limitazione del metodo. Il metodo FISH standard a 12 è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo di genomica BAC clone e IGS rDNA come sonde per i cromosomi mitotici di Aedes, Culex e Anopheles. In aggiunta a queste specifiche applicazioni, i protocolli FISH qui descritte possono anche essere utilizzati per altri scopi. Il protocollo FISH avanzata, che utilizza C 0 t frazioni di DNA per bloccare ibridazione non specifica, può essere applicato anche per l&#39;ibridazione di cloni BAC o qualsiasi altri frammenti di DNA grandi regioni eterocromatiche di Anopheles. Regioni eterocromatiche si arricchiscono di elementi trasponibili e ripete le altre, e le sonde di queste regioni producono normalmente forte background sui cromosomi 3. Utilizzo senza etichette C 0 frazioni di DNA t contribuirà a ridurre l&#39;ibridazione non specifica della sonda ai cromosomi. La versione semplice della FISH protocol può essere utilizzato per qualsiasi rDNA o sonde di DNA ripetute sui cromosomi mitotici di zanzare e altri insetti. Inoltre, può anche essere applicato per la ibridazione di DNA clone BAC in specie con basso contenuto di DNA ripetitivo in regioni eucromatiche come Anopheles o Drosophila. Il protocollo qui proposto contribuirà ad ottenere altamente cromosoma finiti a base di gruppi di genoma per le zanzare e può essere ampiamente utilizzato per applicazioni diverse citogenetici in altri gruppi di insetti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> MZ6 stereomicroscopio Leica </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Uno stereomicroscopio diverso può essere utilizzato </td></tr><tr><td> Olympus CX41 fase microscopio </td><td> Olimpo </td><td> CX41 </td><td> Un microscopio diversa fase può essere utilizzata </td></tr><tr><td> Olympus BX61 microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> BX61 </td><td> Un microscopio fluorescente differente può essere utilizzata </td></tr><tr><td> Thermobrite Diapositiva Denaturazione / ibridazione di sistema </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Serve come un blocco di riscaldamento e camera umida </td></tr><tr><td> Aghi di dissezione </td><td> ScienceTools Belle </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Needle titolari </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici per dissezione </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 satinato doppia micro scivola </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto 22x22 millimetri microscopio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Mastice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Alcohol 200 Proof </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido propionico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio citrato diidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio acetato triidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris di base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (formalina tamponata neutra) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 99% formammide </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Destrano solfato sale sodico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x tampone SSC </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM YOYO-1 ioduro (491/509) Soluzione </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade Prolong reagente Oro </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA polimerasi I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 nucleasi </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsina </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> DNA di sperma di salmone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> US biologica </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Sangue e Cultura Maxikit cellulare </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Kit Qiagen Construct Grande </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è una tecnica normalmente utilizzata da molti laboratori per determinare la posizione cromosomica di sonde di DNA e RNA. Una importante applicazione di questo metodo è lo sviluppo di mappe fisiche alta qualità utili per migliorare le assemblee genoma di vari organismi. Il modello naturale strisce di cromosomi politenici mitotico e fornisce una guida per l&#39;ordine preciso e l&#39;orientamento delle supercontigs genomici. Tra i tre generi, vale a dire zanzara Anopheles, Aedes e Culex, una consolidata cromosoma base tecnica di mappatura è stata sviluppata solo per Anopheles, i cui membri possiedono cromosomi politenici leggibili 1. Come risultato di sforzi mappatura del genoma, 88% di An. gambiae genoma è stato collocato in posizioni precise cromosoma 2,3. Due generi di zanzare Aedes e altri, Culex, sono scarsamente polytenized b cromosomiecause di sovrarappresentazione significativo di elementi trasponibili nei loro genomi 4, 5, 6. Solo il 31 e il 9% delle supercontings genomici sono stati assegnati senza ordine o l&#39;orientamento di cromosomi di Ae. aegypti 7 e Cx. quinquefasciatus 8, rispettivamente. Preparazione cromosoma mitotico per queste due specie precedentemente limitato a gangli cervello e linee cellulari. Tuttavia, i vetrini preparati cromosoma dai gangli cerebrali di zanzare di solito contengono un basso numero di piastre in metafase 9. Inoltre, sebbene una tecnica FISH è stata sviluppata per i cromosomi mitotici da una linea cellulare di Ae. aegypti 10, l&#39;accumulo di più riarrangiamenti cromosomici nei cromosomi 11 linee cellulari li rende inutili per la mappatura del genoma. Qui si descrive una tecnica semplice ed affidabile per ottenere alta qualità di preparazioni cromosomiche mitotiche da dischi immaginali (ID) di larve di 4 ° instar che cun essere utilizzato per tutti i tre generi di zanzare. Un protocollo FISH standard 12 è ottimizzato per l&#39;utilizzo di cloni BAC di DNA genomico come una sonda su cromosomi mitotici di Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus, e utilizzando un distanziatore intergenica (IGS) regione del DNA ribosomiale (rDNA) come sonda sul An. cromosomi gambiae. Oltre alla mappatura fisica, la tecnica sviluppata può essere applicata a citogenetica popolazione e la tassonomia cromosoma / sistematica di zanzare ed altri insetti gruppi.

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Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Tra i tre generi di zanzare, vale a dire<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, E<em&gt; Culex</em&gt;, Fisici tecniche di mappatura del genoma sono stati stabiliti solo per<em&gt; Anopheles</em&gt;, I cui membri possiedono leggibili cromosomi politenici. Per la generi di<em&gt; Aedes</em&gt; E<em&gt; Culex</em&gt;, Tuttavia, la mappatura citogenetica rimane difficile a causa della scarsa qualità dei cromosomi politenici. Qui vi presentiamo un protocollo universale per ottenere alta qualità di preparazioni di cromosomi mitotici ed un protocollo FISH ottimizzato per tutti e tre i generi di zanzare.

Fluorescente<em&gt; In situ</emIbridazione&gt; su cromosomi mitotici di zanzare

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

25.5K Views.  Virginia Tech. Tra i tre generi di zanzare, vale a dire Anopheles, Aedes, E Culex, Fisici tecniche di mappatura del genoma sono stati stabiliti solo per Anopheles, I cui membri possiedono leggibili cromosomi politenici. Per la generi di Aedes E Culex, Tuttavia, la mappatura citogenetica rimane difficile a causa della scarsa qualità dei cromosomi politenici. Qui vi presentiamo un protocollo univers...