Lo studio è supportato da US Public Health Service Concessione DK-081527, 072473 e DK-DK-20595 per l&#39;Università di Chicago Diabetes Centro di Ricerca e Formazione (Animal Models core), e un dono da parte della Fondazione Famiglia Kovler.

1. Creazione di slice virtuali di immunoistochimiche Immagini Stained <ol><li> StereoInvestigator aperto. Posizionare il vetrino pulito tenendo il campione nel supporto microscopio e visualizzare in Investigator Stereo cliccando su &quot;acquisizione&quot; e poi &quot;Live Image&quot; (Acquisizione → Foto Live). Determinare livelli di esposizione per ogni canale, nel nostro esempio specifico, il canale 2 è utilizzato per DAPI, Canale 3 per GFP, Channel 4 per RFP, Canale 5 per Cy5, e Canale 6 per Cy7. Utilizzare il &quot;Istogramma Video&quot; finestra, che visualizza l&#39;intensità della fluorescenza, per determinare il livello di esposizione. Appropriata intensità di fluorescenza è raggiunto quando le code di intensità fino alla fine a destra del video istogramma. Livelli di esposizione possono essere modificate nella finestra &quot;Impostazioni fotocamera&quot;. L&#39;istogramma video può essere messo a fuoco con la ruota fuoco microscopio. </li><li> Prima di creare una fetta virtuale, contorno l&#39;esempio facendo clic sullo schermo in un punto lontano dal campione, che segnerà un punto di riferimento, e quindi facendo clic su tutto il contorno del campione. Quando il profilo è completo, fare clic destro e selezionare &quot;Contorno Chiudi&quot; per collegare i punti d&#39;inizio e fine. </li><li> Una volta che il contorno è chiuso, catturare una fetta virtuale per il campione (→ Acquisizione Acquisire fetta virtuale). Quando la finestra di Virtual opzioni Slice aperta, selezionare &quot;High Speed ​​Acquisisci&quot; così come messa a fuoco automatica deselezionando la casella accanto a &quot;Manuale&quot;. Salvare il file. </li><li> La fetta virtuale messa a fuoco preliminare deve essere calibrato, selezionando (tasto destro → Aggiungi a fuoco Site List) e di messa a fuoco manuale diverse sezioni a caso, cioè, i siti, in anteprima Slice virtuale. Quando vari siti sono stati concentrati, avviare il Slice virtuale (tasto destro → Avvia fetta virtuale con messa a fuoco preliminare). Dopo la fetta virtuale per il primo campione è completa, passare al canale successivo e regolare l&#39;esposizione di conseguenza. Ripetere i passaggi 4 e 5 per ogni canale. </li></ol> 2. Computer-assistita analisi bidimensionale Quantificazione degli isolotti <ol><li> Le immagini vengono poi elaborati utilizzando una macro ImageJ denominata &quot;IHCVS&quot;, che si prepara prima le immagini caricate per l&#39;analisi e poi quantifica le caratteristiche di isolotti come la composizione cellulare (cioè ogni area di beta-, alfa-e delta-popolazioni di cellule, e isolotto zona al valore somma). Lo stack viene divisa nei canali separati in ImageJ, dove ogni singolo canale mostra una immagine separata in base alla colorazione immunoistochimica. Ogni immagine viene poi automaticamente thresholded, dopo di che l&#39;immagine a 8-bit in bianco e nero, o una maschera, l&#39;immagine thresholded viene prodotta. Le immagini dei canali separati vengono poi sommati aritmeticamente in una maschera composito e ImageJ incorporato nella analisi di particelle viene eseguita l&#39;immagine composita. </li><li> ROI sono poi identificate escludendo particelle più piccole di una cellula beta singola (&lt;170 micron 2; area calcolata con un diametro di circa 15 micron; Hara et al, 2003).. Il ROI risultante vengono analizzati e quantificati con ImageJ; quantificazione possono includere perimetrale (una distanza che circonda una zona), la circolarità (un grado di rotondità, dove il numero 1,0 raffigura un cerchio perfetto), diametro Feret (la distanza più lunga in uno spazio) e il centro coordinate per ogni regione analizzata in modo che la distribuzione isolotto può essere matematicamente analizzati utilizzando varie combinazioni di questi parametri e tracciati in un grafico 3D, i cui dati saranno utilizzati per la modellazione matematica. Una singola immagine fetta virtuale viene analizzato in 30 secondi. Immagini multiple possono essere analizzati inserendo la elaborazione delle immagini e script di analisi in una sintassi supportata da ImageJ linguaggio macro. Il ciclo si apre tutti i file in una determinata directory, analizza le immagini, e le uscite dei risultati in una nuova posizione come un file di Excel. </li><li> I risultati aggregati vengono salvati in un foglio Excel, la memorizzazione di dati quali area, perimetro, circolarità, diametro Feret, e per ogni centro isolotto isolotto, insieme con i numeri corrispondenti etichettati nell&#39;immagine. </li></ol> Analisi computazionale e l&#39;installazione Istogramma <ol><li> Gli script di Mathematica, che avvia automaticamente una volta avviato, vengono utilizzate per elaborare i dati raccolti foglio di calcolo, pari a centinaia di migliaia di voci. Uno dei processi critici che vengono eseguiti è una analisi in frequenza, che costruisce un istogramma utilizzato per esaminare la distribuzione dimensioni e anche a determinare valori anomali nei dati. Sotto la scritta, zona isolotto totale viene misurato e confrontato con altri parametri, in particolare per i punti di tempo o l&#39;età del pancreas, e poi di conseguenza visualizzate in un grafico. </li></ol> 3. Ricostruzione tridimensionale di immagini bidimensionali immunoistochimiche Stained fetta virtuale Ricostruzione 3D di sezioni virtuali <ol><li> Copiare lo script (&quot;im_jp2_2_tiff&quot;) nella directory (ad esempio, cartella) checontiene le immagini JP2. Eseguire lo script con la shell di Linux digitando &quot;./im_jp2_2_tiff&quot; nella console e quindi premere INVIO. Esecuzione di questo script convertirà automaticamente tutte le immagini JP2 nella directory in file tiff, che è il formato utilizzato per la costruzione e la quantificazione delle tridimensionale stack dal Fette virtuale. (Nota:. Digitare &quot;chmod + x im_jp2_2_tiff&quot; se lo script non viene eseguito, che convertirà il file di testo in uno script in modo che possa funzionare correttamente) </li><li> Quando tutte le immagini catturate sono stati convertiti dal JP2 in file tiff, sono pronti per essere utilizzati per l&#39;analisi in ImageJ. </li><li> Con ImageJ, aprire tutte le immagini per il primo campione (cinque immagini in questo caso: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) e unirle come un&#39;unica immagine (Immagine → Colore → Unisci canali). Ripetere la procedura per ognuno dei campioni. Quando tutti i campioni sono stati combinati come immagini singole, pulire le immagini selezionando regioni indesiderati con il &quot;Poligono Selezioni&quot; strumento e riempimento in (Modifica → Riempi). (Ridimensionare le immagini a una dimensione inferiore, se necessario). Poi convertire ogni immagine in un immagine a colori RGB (Immagine → Tipo → colore RGB). Infine, creare uno stack di immagini (Image Stack → Immagine → per Stack), dopo di che può ulteriormente essere allineato con il &quot;Stack Reg&quot; plugin, se necessario. In definitiva, la fusione dei canali e poi combinando le immagini 3D crea un montaggio di tutte le isole del pancreas intero. Per visualizzare l&#39;immagine, clicca su &quot;Plugin&quot; e poi &quot;visualizzatore 3D.&quot; </li></ol> 4. Isolotto Mapping Raccolta pile Immagine <ol><li> Situare l&#39;intera isole pancreatiche montare sotto il microscopio. </li><li> Aprire il software Slidebook. Accedere alla &quot;Cattura e Focus di controllo&quot; premendo il tasto &quot;Ctrl + Maiusc + E.&quot; In &quot;Control Focus&quot; finestra, ha fissato l&#39;obiettivo a 20X o 40X, a seconda delle dimensioni dell&#39;isolotto. Applicare acqua se si utilizza una immersione in acqua lente obiettiva. </li><li> Per poter utilizzare l&#39;oculare microscopio per individuare isolotti, impostare &quot;Bin&quot; a 2X e impostare il set di filtri per Utente1 nella finestra &quot;Controlli Focus&quot;. &quot;Selezione delle emissioni&quot; dovrebbe essere impostato su 100% Occhi e densità neutra a 1. Fare clic su &quot;GFP ey&quot; e poi &quot;Apri Fluor&quot;. </li><li> Per visualizzare il campione in Slidebook, tornare alla finestra e concentrare i controlli switch &quot;Imposta filtro&quot; a &quot;Live&quot; e clicca su &quot;GFP ds&quot;. Utilizzare il joystick per centrare l&#39;isolotto nella finestra telecamera 1 nel miglior modo possibile. Messa a fuoco ad una profondità da qualche parte vicino al centro dell&#39;isolotto, dove le cellule si possono individuare facilmente. </li><li> Nella &quot;Finestra concentrare i controlli&quot;, selezionare la scheda &quot;Z&quot;. Fare clic su Imposta nell&#39;angolo in alto a sinistra della finestra per impostare la profondità attuale come punto di riferimento. Utilizzare il controllo portata per scorrere fino alla profondità superiore dell&#39;isolotto in cui caratteristiche possono essere individuate in modo chiaro e cliccare su &quot;Set Top&quot;. Scorrere fino alla fine dell&#39;isolotto e cliccare su &quot;Imposta basso&quot;. Fare clic su &quot;Go&quot; per tornare al punto di riferimento. </li><li> Nella finestra di acquisizione, impostare &quot;Bin Factor&quot; a &quot;2X&quot; e impostate &quot;Imposta filtro&quot; a &quot;Live&quot;. Impostare il &quot;Tipo di cattura&quot; a &quot;3D&quot; (e solo 3D). Sul lato destro della finestra, fare clic su &quot;Utilizza posizioni superiore e inferiore.&quot; Fare clic su &quot;Torna al punto di riferimento dopo la cattura.&quot; Impostare &quot;Step Size&quot; a &quot;3&quot;. </li><li> Sotto il &quot;Box Set Filter&quot;, selezionare DAPI DSU, DSU GFP, RFP DSU, e Cy5 Dsu. Per ciascuno di essi, fare clic su &quot;Trova le migliori&quot; sotto &quot;Regola esposizione&quot;, quindi fare clic su &quot;Test&quot; per assicurarsi che l&#39;esposizione scelto è adatto. Fare clic su &quot;Start&quot; per iniziare la cattura. </li><li> Quando la cattura è completa, regolare i livelli e, se necessario modificare il colore visualizzato per RFP al bianco. Salvare la diapositiva e passare alla visualizzazione → Esporta → TIFF serie. Digitare il nome della diapositiva con un trattino alla fine e salvarlo. Decine di singoli file TIFF vengono creati, quindi potrebbe essere utile per mantenere serie di immagini di ogni isolotto in una cartella separata. </li></ol> Mappatura Stack Immagine <ol><li> Aprire Investigator stereo. Visualizzare l&#39;immagine aprendo le pile immagine (File → Pila → Pila immagine Apri immagine). Nel &quot;menu Immagine Scala&quot;, &quot;Distanza tra immagini&quot; impostato a 3,00 micron. Per correggere in binning 2X Slidebook, selezionare &quot;Sostituisci X e Y Scala&quot; e &quot;Utente specificato di Fonte di X e Y&quot; Scaling, e inserire 0,65 per X e Y. </li><li> Centrare l&#39;immagine facendo clic in mezzo l&#39;isolotto di interesse per la &quot;finestra della macro&quot;. Segna almeno una cella utilizzando il marker appropriati. Beta-cellule apparirà verde, le cellule alfa apparirà rosso, e le cellule delta appare bianco; Marker utilizzare 2 (un cerchio vuoto) per marcare beta-cellule, Marker 5 (un triangolo vuoto) per marcare le cellule alfa, e Marker 6 ( un triangolo vuoto) per le cellule delta. Le cellule dovrebbero essere segnati al centro del loro nucleo, che apparirà blu se il campione è stato colorato con DAPI. </li><li> Una volta almeno una cella è stata segnata, visualizzare la &quot;vista ortogonale&quot; utilizzando l&#39;icona nel menu in alto. Controllare &quot;Z-Filter&quot; e &quot;simmetrica&quot;. La gamma di should essere impostato a 15,00. A partire dal livello 0,0 Z, scorrere l&#39;isolotto con la rotellina del mouse e contrassegnare ogni cella con il marker appropriati. Ogni cella deve essere contrassegnato solo una volta al centro della sua profondità. Dopo aver finito la marcatura ciascuno dei livelli-Z, la casella di controllo &quot;Z-filtro&quot; può essere selezionata. Questo mostrerà tutti i marcatori da tutti i Z-livelli. </li><li> Quando ogni cellula è stata segnata, salvare il file come un file &quot;DAT&quot;, quindi andate su File → Esporta Tracing. Salva il tracciato come file &quot;TXT&quot;. Fare clic su &quot;Nuovo file di dati&quot; per cancellare il lavoro prima di tentare di mappare nuove isole. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La preparazione di sezioni virtuali di un campione pancreas immunoistochimiche colorato permette di esaminare tutte le cellule endocrine (alfa, beta e delta-cellule) nel pancreas intero, sia insieme come isolotti (Figura 1A) e singolarmente, in canali separati ( Figura 1B). Con l&#39;aiuto di programmi informatici e gli script, una analisi della massa di dati su larga scala possono essere eseguite su tali sezioni virtuali. In particolare, l&#39;analisi delle particelle di maschere composito (Figura 1C) è uscita come una tabella statistica contenente parametri come zona isolotto, il perimetro (la distanza che circonda una zona), la circolarità (un grado di rotondità, dove 1.0 rappresenta un cerchio perfetto), e diametro Feret (la distanza più lunga in uno spazio) per ogni isolotto rilevato (Figura 1D). L&#39;analisi su larga scala di questi risultati le immagini nella produzione del numero totale delle isole e istogrammi distribuzione delle dimensioni, nonché un confronto dettagliato di alfa, beta-e delta-cell aree. Inoltre, ogni fetta è presa virtuale ad una profondità di circa 5 micron, e tutte le singole sezioni 2D virtuali sono ulteriormente impilate per creare una ricostruzione 3D del campione del pancreas intero. Mappatura isolotto dimostra un altro esempio non solo di catturare isolotti in 3D, ma anche di dettagliate computer-assistiti di analisi. Mappatura isolotto consiste nella cattura di isolotti distinti (Figura 2A) e la successiva marcatura di alfa, beta-e delta-cellule a diversi Z-piani (Figura 2B) per visualizzare un isolotto in 3D (Figura 2C, D). Automatizzata analisi matematica di isolotti mappate mostra la loro composizione cellulare e architettura, tra cui cellula-cellula distanze (2E Figura) e le probabilità cumulativa di cellula-cellula distribuzioni distanza (Figura 2F). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Larga scala la cattura e l&#39;analisi della distribuzione delle isole utilizzando fetta virtuale. A. virtuale vista fetta di una sezione del pancreas umano. a. La colorazione immunoistochimica per l&#39;insulina (verde), glucagone (rosso), la somatostatina (bianco) e DAPI (blu). b. Convertite a 8-bit maschera dopo soglia automatica. Una zona in scatola è ingrandita nella Visto BB di ogni canale. a. delta-cellule, b. beta-cellule, c. alfa-cellule, e d. fuse immagine composita. L&#39;analisi delle particelle C. intervento su maschera composito. Si noti che ogni struttura isolotto tra piccoli ammassi cellulari è numerato (evidenziato in blu). Tabella D. Le statistiche dei vari parametri misurati per le singole strutture, che hanno ID che corrispondono ai tag mostrato in C. <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 2. Analisi di immunoistochimica fetta virtuale. A. grafico a dispersione 3D della figura 1 mostrano la distribuzione dimensione e la forma di ogni isola da parametri quali area, circolarità e del diametro di Feret. B. grafico a dispersione in 3D di Figura 1 che mostra composizione cellulare delle isole e le dimensioni. C. distribuzione delle dimensioni Isolotto di tutta l&#39;analisi sezione umano dalla Figura 1 montato su una distribuzione lognormale densità di probabilità. D. Analisi matematica dei rapporti di composizione cellulare (beta-cellule nel verde, alfa-cellule in rosso e delta-celle in blu) per ogni bin isolotto diametro effettivo di Figura 1. E. a. Isolotto distribuzione delle dimensioni di analisi immunoistochimica campionamento casuale (a sinistra). Isolotto distribuzione delle dimensioni di analisi fetta virtuale (a destra). b. Log-normale confronto trama di analisi immunoistochimica campionamento casuale (rosso) e slice virtuali (blu). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Islet mappatura e l&#39;analisi matematica di composizione cellulare e architettura. R: cattura dello schermo che mostra un unico piano focale da una pila di immagini 3D ricostruito di un isolotto umano caricato in Stereo-Investigator (beta-cellule in verde, alfa-cellule in rosso, delta-celle in bianco, e nuclei in blu) . B: le immagini a fluorescenza (a sinistra) e corrispondenti dati mappati (a destra) in tre differenti piani focali mostrato ad un intervallo di 10 micron. C: vista Rappresentante dei dati isolotto 3D ricostruito la mappatura. D: ricostruzione 3D dei quarti di fette isolotto sulla base delle coordinate ottenute dalla mappatura isolotto. E: Analisi Matematica di composizione cellulare e architettura. Left. Frequenza relativa di cellula-cellula distanze tra due cellule in una popolazione singola cella. A destra. Frequenza relativa di cellula-cellula distanze tra due diverse popolazioni cellulari. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) prova. A sinistra. Probabilità cumulativa di cellula a cellula-distribuzioni distanza per alfa-to-alfa, beta-to-beta e delta-to-delta cellule. A destra. Distanze KS per la corrispondente tre probabilità cumulativa.

<ol>
	<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li><li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l., Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture+-+a+comparative+study.">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li><li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice.">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li><li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas.">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li><li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il computer-assistita su larga scala di visualizzazione e quantificazione qui presentati permettersi quattro punti chiave per gli studi delle isole pancreatiche: (1) Una grande analisi di campioni del pancreas fornisce una visione completa della distribuzione complessiva dimensioni e l&#39;architettura isolotto isolotto. (2) La ricostruzione 3D e analisi matematica di composizione cellulare e architettura facilitare ulteriormente l&#39;esame della disposizione spaziale delle cellule endocrine all&#39;interno di un isolo...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Olympus </td>
<td>IX-81
</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereo Investigator</td>
<td>Program</td>
<td>MicroBrightField</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MIP-GFP mice</td>
<td>Mice</td>
<td>Jackson Laboratory</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
<td>Program</td>
<td>Wolfram</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
<td>Program</td>
<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture

Le isole pancreatiche è un unico micro-organo composto da cellule endocrine che secernono diversi ormoni come il beta-cellule (insulina), alfa-cellule (glucagone) e delta-cellule (somatostatina) che sono incorporati nel tessuto esocrino e comprendono 1 - 2% del pancreas intero. Vi è una stretta correlazione tra il corpo e il peso del pancreas. Totale delle cellule beta massa aumenta proporzionalmente anche per compensare la richiesta di insulina nel corpo. Ciò che sfugge a questa espansione proporzionale è la distribuzione delle dimensioni delle isole. Grandi animali come gli esseri umani condividono simili distribuzioni isolotto formato con i topi, suggerendo che questo micro-organo ha un certo limite dimensioni per essere funzionale. L&#39;incapacità del pancreas grande animale per generare isolotti proporzionalmente maggiore è compensata da un aumento del numero di isolotti e da un aumento della proporzione di più grandi isole nella loro distribuzione complessiva dimensioni isolotto. Inoltre, isolotti mostrano una plasticità impressionante nella composizione cellulare e architettura tra le diverse specie e anche all&#39;interno della stessa specie in diverse condizioni fisiopatologiche. Nel presente studio, si descrivono nuovi approcci per l&#39;analisi dei dati di immagine biologici al fine di facilitare l&#39;automazione dei processi analitici, che permettono l&#39;analisi di grandi raccolte di dati eterogenei e nello studio di tali processi dinamici biologici e strutture complesse. Tali studi sono stati ostacolati a causa di difficoltà tecniche di campionamento imparziale e generando grandi insiemi di dati da catturare con precisione la complessità dei processi biologici di biologia isolotto. Qui si mostrano i metodi per raccogliere imparziale &quot;rappresentante&quot; dei dati all&#39;interno della limitata disponibilità di campioni (o ridurre al minimo la raccolta del campione) e le impostazioni standard sperimentali, e di analizzare con precisione la complessa struttura tridimensionale dell&#39;isolotto. Assistita da computer di automazione consente la raccolta e l&#39;analisi di grandi set di dati e assicura anche imparziali di interpretazione dei dati. Inoltre, la quantificazione precisa della distribuzione delle dimensioni delle isole e coordinate spaziali (ad esempio X, Y, Z-posizioni) non solo porta ad una visualizzazione accurata della struttura di isole pancreatiche e la composizione, ma ci permette anche di identificare i modelli durante lo sviluppo e l&#39;adattamento alle condizioni di alterazione attraverso modelli matematici. I metodi sviluppati in questo studio sono applicabili gli studi di molti altri sistemi e organismi pure.

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Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Metodi computer-assistita romanzo di grandi appalti e l&#39;analisi di campioni di pancreas immunoistochimiche colorati sono descritte: (1) l&#39;acquisizione di Virtual Fetta di tutta la sezione, (2) analisi di massa di dati su larga scala, (3) Ricostruzione di sezioni 2D virtuale , (4) la mappatura delle isole 3D, e (5) Analisi Matematica.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Chicago. Metodi computer-assistita romanzo di grandi appalti e l'analisi di campioni di pancreas immunoistochimiche colorati sono descritte: (1) l'acquisizione di Virtual Fetta di tutta la sezione, (2) analisi di massa di dati su larga scala, (3) Ricostruzione di sezioni 2D virtuale , (4) la mappatura delle isole 3D, e (5) Analisi Matematica.

Video: Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Ricerca

Biologia

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murino pancreatica isolamento Islet

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

Quantificazione in situ di cellule beta pancreatiche Messa in topi

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...