Dr. P. Lindström è riconosciuto per la fornitura di topi ob / ob. J. Lehtonen è riconosciuto per l&#39;assistenza con la produzione video e J. Gilbert aiuto con l&#39;editing. Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti del Diabetes Research Institute Foundation (AP), la Juvenile Diabetes Research Foundation (AP e UA), la Commissione europea (FP-7, convenzione di sovvenzione n.: CP-IP 228933-2) (JS e UA), le Fondazioni Kempe, Università di Umea e il Consiglio svedese della ricerca a UA

1. Preparazione del campione e Scansione 1,1 Preparazione del campione La seguente procedura viene eseguita essenzialmente come descritto in precedenza 7. <ol><li> Raccolto il pancreas. Utilizzare ghiacciata PBS al fine di evitare la degradazione proteolitica. </li><li> Fissare il tessuto nel 4% PFA in PBS in ghiaccio per 2-3 ore. Accertarsi che i lobi sono &quot;sparsi&quot; durante la fissazione. Questo facilita l&#39;identificazione dei punti di riferimento anatomici dopo la ricostruzione. </li><li> Lavare in eccesso di PBS per 30 min. </li><li> Disidratare il pancreas stepwise in metanolo (33, 66%, 100%), 15 min / step. Ciò riduce al minimo la formazione di bolle durante la sbianca (vedere fase 5) e previene la distruzione cellulare durante congelamento-scongelamento (vedere fase 7). </li><li> Incubare il tessuto appena preparato in MeOH: H 2 O 2: DMSO sbianca buffer in un rapporto 02:01:03 a RT per 24 ore per estinguere la fluorescenza tissutale endogena. Per i più grandi campioni, lo scambio di nuove bleachitampone ng e incubare per un altro 24 h. </li><li> Lavare in MeOH eccesso, ON. </li><li> Congelamento-scongelamento per almeno 5 cicli di -80 ° C - RT per facilitare la penetrazione anticorpo. </li><li> Reidratare graduale torna TBST (33, 66%, 100%), 15 min / step. </li><li> Blocco in TBST con 10% di siero (preferibilmente dalla stessa specie in cui si genera l&#39;anticorpo secondario), 5% DMSO e 0,01% Naaz per 12-24 ore a RT </li><li> Incubare con anticorpi primari in tampone bloccante per 48 ore, a temperatura ambiente, si estendono a 72 ore per grandi campioni (anticorpi usati qui sono elencati nella tabella dei reagenti). </li><li> Lavare in TBST eccesso, ON. </li><li> Incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per 48 ore, a temperatura ambiente, estendere a 72 ore per i più grandi campioni. </li><li> Lavare in TBST eccesso, ON. </li></ol> 1,2 La procedura seguente descrive come montare il campione in agarosio e allegarlo al supporto personalizzata di esempio fatto (vedi Figura 7) Prima OPT scansione. <ol><li> Separare i lobi splenica, duodenale e gastrica secondo la figura 3A in Hörnblad et al 3. La relazione tra i lobi è ulteriormente chiarita in Hörnblad et al 11. </li><li> Preparare 1,5% (w / v) di agarosio a bassa temperatura di fusione in dH 2 O, filtro, lasciare raffreddare a 37 ° C e lavare il tessuto in dH 2 O per lavare via il detergente e rimuovere bolle prima agarosio-embedding su ghiaccio. </li><li> Tagliare un blocco di agarosio racchiude il campione e lasciato uno spacer cm ~ tra il campione e la base di agarosio. Ritagliare bordi taglienti (≤ 90 °) del blocco agarosio per ridurre dispersione della luce. </li><li> Disidratare il campione stepwise in MeOH (33, 66%, 100%), lasciando il tempo per equilibrare tra ogni passo. Quando il campione affonda è considerato essere equilibrati. </li><li> Cancellare il campione in una soluzione 1:02 di alcol benzilico: Benzyl Benzoate (BABB) fino a che non diventa trasparente. Scambio BABB soluzione e incubare per ulteriori 12 ore. </li><li> Posizionare il campione eliminato nel supporto del campione e fissarlo inserendo due aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori nelle flange del titolare. </li><li> Collocare il campione nello scanner e immergerlo in una vaschetta piena di soluzione BABB compensazione. Quando si confrontano una serie di pancreas stesso ingrandimento dovrebbe essere utilizzato per tutte le scansioni. L&#39;ingrandimento dovrebbe essere ottimizzato per il più grande campione nella serie. </li></ol> 1.3 Posizionamento del campione in AR Il protocollo che segue descrive la procedura per posizionare con precisione un campione utilizzando la COM-AR algoritmo. Questa procedura è applicabile solo quando il ROI include l&#39;intero campione. Per una descrizione dettagliata degli algoritmi, vedere Cheddad et al 2. <ol><li> Acquisire le immagini del campione in due posizioni per il both l&#39;anatomia e canali di segnale. Posizione 1 a 0 ° (associato con l&#39;asse X), mostrano la più grande area di proiezione, e la posizione 2 a 90 ° (associato con l&#39;asse Z). Stiamo utilizzando il canale GFP per visualizzare l&#39;anatomia. </li><li> Applicare l&#39;aspettativa-massimizzazione (EM) algoritmo sulle immagini di anatomia alla soglia del ROI. </li><li> Calcolare i punti COM (ascisse) delle immagini binarie ottenute nella fase 2 sia di 0 ° e 90 ° proiezioni. </li><li> Sovrapporre una linea verticale passante per il punto COM identificato calcolato nella fase 3 a 0 ° e 90 ° immagini del canale di segnale. </li><li> Utilizzare le immagini acquisite nel passaggio 4 come riferimenti per spostare il campione in modo che la linea centrale del campo visivo passa attraverso i punti COM trovati del campione. </li></ol> 1.4 Scansione <ol><li> Regolare il tempo di esposizione per ottenere il massimo rapporto segnale-rumore possibile senza saturazioneTING tutte le aree di proiezione delle immagini. Ripetere l&#39;operazione per tutti i canali da sottoporre a scansione. </li><li> Selezionare il set di filtri per il primo canale di fluorescenza da analizzare. Emissioni da fluorofori λ più brevi possono eccitare fluorofori con più λ e quindi causare foto sbiancamento. Per ridurre al minimo questa possibilità, eseguire la scansione del fluoroforo con λ più lunga eccitazione prima. </li><li> Aprire l&#39;otturatore per illuminare il campione e raccogliere il segnale di fluorescenza su 360 °, ruotando il campione lungo l&#39;asse verticale per ciascun canale. L&#39;angolo di fase utilizzato per il NIR-OPT di installazione è di 0,9 ° e per lo scanner 3001 Bioptonics 0,45 °. </li><li> Selezionare il filtro appropriato per il canale successivo e procedere come sopra. </li></ol> 2. Elaborazione computazionale e la ricostruzione 2,1 post-acquisizione di rilevamento e correzione errori di allineamento (A-valore di accordatura) In tomografia a proiezione, è in generale necessarioassegnare un valore post-allineamento alle sporgenze per mettere a punto la posizione immagini lungo l&#39;asse di rotazione prima ricostruzione. Tuttavia, una aberrazione piccolo angolo della telecamera verso l&#39;asse ottico può causare non uniformi valori A lungo la lunghezza del campione e quindi indurre distorsioni geometriche. Per evitare tali distorsioni, un metodo di calcolo per trovare l&#39;esatta e unificato post-allineamento valore (valore A) durante l&#39;intero campione può essere applicato 2. <ol><li> Utilizzare una trasformata discreta di Fourier per dividere una proiezione del segnale specifico a 0 ° e 180 ° in 8 blocchi altezza pixel e calcolare lo spostamento lungo l&#39;asse x (valore A) tra ogni blocco. </li><li> Applicare una regressione lineare almeno per calcolare l&#39;angolo θ &#39;, che descrive la pendenza dell&#39;asse x-spostamento lungo la lunghezza del campione, e di trovare un punto di rotazione centrale. </li><li> Correggere per disallineamenti durante la scansione ruotando tutti progeZIONI θ &#39;/ 2 in giro per il centro di rotazione. </li></ol> 2,2 equalizzazione Contrasto limitato istogramma adattativo (CLAHE) Per facilitare l&#39;individuazione e la segmentazione di oggetti (isolotti) mostrano segnali molto deboli, che sono a rischio di essere &quot;thresholded fuori&quot; durante la ricostruzione e / o la segmentazione per le valutazioni quantitative, un algoritmo CLAHE può essere applicato alle immagini di proiezione. L&#39;operazione viene eseguita con CLAHE due trasformazioni intensità principali: <ol><li> Il contrasto locale è stimato e allineate ai non sovrapposte blocchi l&#39;immagine proiettata. </li><li> Le intensità sono poi normalizzati in corrispondenza delle zone di confine tra i blocchi tramite interpolazione bilineare. </li></ol> Il nome contrasto limitata riferisce al limite clip, che è impostato per evitare di saturare pixel nell&#39;immagine. In questo protocollo, il MATLAB built-in funzione &quot;adapthisteq&quot; è stato utilizzato e applicato con la c di default<html> labbro limite di 0,01 e una dimensione di porzione di 256. Nota, la dimensione ottimale piastrella deve essere testato empiricamente e possono variare a seconda del campione analizzato. Maggiori dettagli su l&#39;algoritmo e gli esempi si possono trovare in Hörnblad et al 3. Nota: I passaggi sopra elencati di elaborazione di calcolo (tra cui COM-AR, messa a punto A-Valore e CLAHE, vedere 1,3-2,2) si basano su algoritmi standard e vengono eseguiti in MATLAB (Mathworks). 2,3 ricostruzione tomografica e iso-superficie di rendering <ol><li> Utilizzando un filtro retroproiezione algoritmo, le immagini corrette e normalizzato possono ora essere ricostruita con compensazione disallineamenti unificata e requisito minimo per l&#39;ottimizzazione della gamma dinamica. In questo protocollo, tutte le ricostruzioni sono effettuate con il metodo di proiezione filtrata torna disponibile nel software NRecon (Skyscan), versione 1.6.8 (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Nota, l&#39;ingrandimento di un oggetto con immagini dipende dalla sua distanza dal punto focale della lente a meno geometria della trave parallela è implementata nella configurazione di imaging. Pertanto, quando l&#39;importazione di un set di dati di proiezione al software NRecon è importante includere l&#39;oggetto corretta distanza di sorgente (mm) e la direzione di rotazione dello scanner (per antioraria ingresso &quot;cc&quot; e per l&#39;ingresso in senso orario &quot;cw&quot;) in accompagnamento file di log, per evitare artefatti fascio a cono indotte durante la ricostruzione. </li><li> Per visualizzare e quantificare la pila di sezioni virtuali ottenuti, generare 3D iso-superfici utilizzando un software di elaborazione delle immagini, come Imaris o Volocity. </li></ol> Isolamento delle isole murine e procedure di trapianto sono stati eseguiti a Cella Dati preclinici di elaborazione del Diabetes Research Institute e Core modello traslazionale secondo protocolli esaminati e approvati dall&#39;Università di Miami cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. Il comitato etico per la ricerca sugli animali, nel nord della Svezia, ha approvato tutti gli altri esperimenti che coinvolgono animali.

<ol>
	<li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography.">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li><li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution.">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li><li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+imaging+islets:+recent+advances+and+future+prospects.">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography.">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. 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U., Sock, E., Hill, R. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le tecniche descritte per l&#39;imaging OPT consente l&#39;estrazione di parametri spaziali e quantitativi in ​​tutto il volume del pancreas murino. A causa di limitazioni nella risoluzione ottenibile per questo tipo di immagini si mesoscopica va notato che, come per la maggior parte delle modalità di imaging, più grande è il campione inferiore della risoluzione (Anche se l&#39;uso di una risoluzione CCD superiore dovrebbe aumentare la risoluzione della scansione OPT) . Quindi, per la valutazione dei lobi intatti topo pancreatici, la tecnica al momento non fornisce sola risoluzione cella anche se vicino (circa 15-20 micron) 7. Ancora, per l&#39;estrazione di distribuzione BCM nel pancreas topo protocolli hanno fornito dati che più ben corrispondono a quelli ottenuti dal punto esempio contando morfometria 3,13 Si segnala che, sebbene implementazione del protocollo CLAHE permette di individuare isolotti significativamente più , queste isole sono generalmente più piccole e non contributite sostanzialmente ai complessivi β-cellule volumi. I protocolli immunoistochimici coinvolte sono relativamente lunghe (fino a due settimane), ma le mani reali in tempo per la preparazione dei campioni è breve e quindi la tecnica è adatto per lo studio di grandi coorti di animali 9. Se il potenziale di distribuzioni eterogenee è un punto di riferimento per l&#39;indagine, va sottolineato che occorre prestare attenzione nella procedura relativa fissaggio e montaggio per evitare che il tessuto pancreatico si fissa in senso sfavorevole e un piatto (&quot;stese&quot; ) supporto del tessuto deve essere cercato per agevolare tali valutazioni. Un importante problema quando si esegue OPT COM è che il campione è fissata in corrispondenza dell&#39;asse di rotazione e che non si muove, verticalmente o orizzontalmente, durante la procedura di scansione. Pertanto, è essenziale avere una configurazione meccanica stabile ed un sistema ben funzionante per attaching il campione. Abbiamo risolto il problema con la costruzione di un supporto nuovo (Figura 7). Geometria parallela non era vero per il nostro NIR-OPT o Bioptonics 3001 scanner, che è stato rilevato come spostamento verticale tra la schiena e posizioni anteriori di oggetti periferici nelle immagini registrate proiezione. Regolando l&#39;oggetto a distanza di sorgente nel file di log dello scanner corrispondente (vedi 2.3.1) si potrebbe migliorare sensibilmente la qualità dei nostri dati e correggere le distorsioni geometriche ai bordi più esterni delle immagini di proiezione, che è di particolare importanza quando valutazione più grandi campioni. Nel protocollo attuale, forniamo una proposta di set di filtri che permettono la visualizzazione di tre diversi canali specifici e un canale &quot;anatomia&quot; nelle valutazioni di preparazioni pancreatiche intatti. Ovviamente queste impostazioni può essere modulata per meglio adattarsi alle fluorocromi utilizzati per un determinato studio, anche se, come per tutte le forme di fluorescenzamicroscopia cento, il rischio potenziale del segnale sanguinare-through deve essere attentamente valutato. Lo studio di isolette insulina marcata con fluorocromi eccitati sopra 750 nm non è stato ancora possibile da noi utilizzando la lampada ad alogenuri metallici che il nostro set up utilizza. E &#39;possibile che una telecamera con ancora maggiore efficienza quantica nelle lunghezze d&#39;onda pertinenti in combinazione con fonti alternative di luce (ad esempio diodi laser) potrebbe aumentare il potenziale di NIR-OPT ulteriormente ea permettere l&#39;imaging a lunghezze d&#39;onda ancora più elevati. OPT immagini è una tecnica estremamente versatile per le valutazioni spaziali e quantitative di campione biomedici sul mm cm scala. Anche se i protocolli qui presentati sono stati sviluppati con lo scopo principale del pancreas / diabete di ricerca che dovrebbe essere possibile tradurre la ricerca su altre specie, tipi di campioni e marcatori. Con la possibilità di visualizzare diversi canali distinti in preparazioni pancreatiche intatti, NIR-OPT immagini fLTERIORI ha il potenziale come strumento per valutare la specificità assorbimento di agenti di contrasto destinati non invasivi valutazioni da altre modalità di imaging, purché questi agenti di contrasto possono essere destinate a svolgere anche un fluoroforo rilevabile da OPT.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

L&#39;insulina producono β-cellule sono fondamentali per la capacità del corpo per controllare il glucosio nel sangue omeostasi. Pertanto, le valutazioni di distribuzione del pancreas BCM sono indispensabili per molte aree di ricerca pre-clinica del diabete. Nelle valutazioni dei regimi terapeutici, ad esempio, l&#39;impatto di ablazione genica mirata sulla differenziazione delle cellule del sistema endocrino o su studi di eziologia del diabete in modelli di roditori per la malattia spesso dipendono da tali analisi. Tradizionalmente, questi tipi di valutazioni sono affidati a tempo consumando stereologica approcci che sono difficili da eseguire a causa delle dimensioni e complessa costituzione anatomica del pancreas. La maggior parte di imaging ad alta risoluzione approcci attualmente (tipicamente ottico), non forniscono una profondità sufficiente a consentire la penetrazione di imaging intero pancreas nei roditori. Al contrario, gli approcci di imaging che non si limitano con la loro profondità di penetrazione (tipicamente nucleare) fornire a bassa risoluzione per risolvere la distribuzione completa e BCM sono ostacolatidalla mancanza di mezzi di contrasto adeguati 4,5. Tomografia a proiezione ottica è una modalità di imaging 3D che consente ad alta risoluzione valutazioni di campioni biomedici sulla scala mm a cm 6. Con la presente, le informazioni sulla posizione spaziale e il volume del individuale di insulina esprimere isole di Langerhans possono essere estratte in tutto il volume del pancreas in topi normali e diabetici 3,7-10. Lo scopo di questo studio è di migliorare ulteriormente la capacità di questa tecnica per la valutazione delle β-cellule pancreatiche; loro distribuzione endogena, quando innestato in altri tessuti, la loro relazione con altri costituenti pancreatici (come infiltrarsi tipi cellulari) e in grande preparazioni pancreatiche rispetto al passato. Il vicino infrarosso tomografia ottica di proiezione (NIR-OPT) di installazione In seguito protocolli, uno scanner OPT in base al set up originale descritto da Sharpe <em&gt; 1 et al, atto a imaging nel vicino infrarosso descritto ed utilizzato. Per valutazioni singolo canale del pancreas mouse (es. BCM), SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner può essere utilizzato. Una lampada ad alogenuri metallici che fornisce energia di eccitazione superiore una lampada a mercurio a lunghezze d&#39;onda superiori a 650 nm, fornisce la luce di eccitazione. La luce viene trasferita attraverso una guida di luce liquida. Una utile combinazione di fluorocromi e filtri passa banda per NIR fluorescenza imaging e separazione dei canali sono mostrati in Figura 3. La luce emessa viene rilevata con una telecamera CCD retroilluminato, con alta efficienza quantica nello spettro NIR. La scansione OPT è automatizzata utilizza una piattaforma LabView che controlla la fotocamera e motore passo-passo. Per supportare campioni nella dimensione di pancreas di ratto intatto, uno specchio d&#39;argento rivestito e protetto da una cuvetta grande viene utilizzata. Infine, un porta-campioni che elimina indesiderate movemen verticalits del campione durante la scansione creata.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl Alcohol </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzoato di benzile </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Topo anti-asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Coniglio anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Guinea Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> Anticorpo primario </td></tr><tr><td> Donkey contro GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-Rb DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.076 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.008 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Capra antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.012 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.076 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> Di capra anti-GP Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.039 </td><td> Anticorpo secondario </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stereomicroscopio </td></tr><tr><td> Leica Obiettivo 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera adattatore 1,0 x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 ioduri metallici </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lightsource </td></tr><tr><td> Liquid Light Guide </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52.5 mm </td></tr><tr><td> Specchio </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Tecnologia </td><td> DU934N-BV </td><td> Retroilluminato CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 41022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Tecnologia Chroma </td><td> 49037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sepharose perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose Fast Flow 4 </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Azide di sodio 0,1 M soluzione </td></tr></tbody></table>

near infrared optical projection tomography for assessments of &beta;-cell mass distribution in diabetes research

Adattando OPT per includere la capacità di imaging nel vicino infrarosso (NIR) dello spettro, si illustrano qui la possibilità di corpi immagine più grande di tessuto pancreatico, come il pancreas di ratto, e per aumentare il numero di canali (tipi cellulari) che possono essere studiato in un singolo campione. Approfondiremo l&#39;attuazione di una serie di strumenti di calcolo che forniscono: posizionamento 1 / accurata di un campione (nel nostro caso il pancreas) centro di massa (COM) in corrispondenza dell&#39;asse di rotazione (AR) 2; 2 algoritmi / perfezionati per posta -messa a punto di allineamento che impedisce distorsioni geometriche durante la ricostruzione tomografica 2 e 3 / un protocollo per l&#39;equalizzazione per aumentare l&#39;intensità del segnale ai rapporti di rumore in OPT-based determinazioni BCM 3. Inoltre, si descrive un porta-campioni che minimizza il rischio di movimenti accidentali del campione durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Insieme, questi protocolli consentire una valutazione della distribuzione del BCM e OTHcaratteristiche er, da svolgersi in tutto il volume del pancreas intatta o altri organi (ad esempio, in studi di trapianto di isole), con una risoluzione fino al livello dei singoli isolotti di Langerhans.

Nella presente relazione si descrive un protocollo per l&#39;estrazione e l&#39;elaborazione dei dati di calcolo in BCM pancreas roditori (e altri tessuti) con NIR-OPT (Figura 1). Come illustrato in figura 2, autofluorescense tessuto pancreatico dal campione è notevolmente diminuita come previsto nello spettro NIR. Questo porta ad un aumento significativo segnale medio di rumore (S: N) per la valutazione di isolotti di Langerhans insulina marcata. Dagli adattamenti di OPT all&#39;imaging nella parte NIR dello spettro, come qui descritto, almeno tre canali specifici possono essere visualizzati con sufficiente S: rapporto N per consentire una valutazione di tipi cellulari anticorpo marcato in tutto il volume del pancreas murino con distinta canale di separazione (vedi figura 3 e 4). Applicata all&#39;imaging dei processi diabetogeni e / o valutazioni BCM in generale, la tecnica permette quindi la visualizzazione e la quantificazione deiaree insulina positive relative alle circostante e / o interagendo tipi cellulari (vedi Figura 4). Tali valutazioni sono grazie alla maggiore profondità di penetrazione del tessuto ottenuto nella gamma NIR possibile effettuare in campioni molto più grandi rispetto al passato, compreso il pancreas di ratto, che è 3-5 volte più grande rispetto al suo omologo mouse (vedi Figura 5). Indipendentemente dal fatto che le lunghezze d&#39;onda visibili o NIR sono utilizzati, l&#39;attuazione di CLAHE può facilitare notevolmente OPT valutazioni base di BCM durante diverse condizioni genetiche e fisiologiche aumentando la sensibilità di rilevamento della tecnica (vedere Figura 6). Uno schema per il supporto del campione sviluppata è mostrato in Figura 7. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso che descrive i passaggi critici per OPT analisi basate su BCM in murpancreas ine. Il tempo necessario per valutare un pancreas tipico mouse è 13-14 giorni. La maggior parte del tempo viene consumato durante la lavorazione e la colorazione immunoistochimica del tessuto (10 giorni), la compensazione dei tessuti richiede circa 2 giorni, mentre la durata della scansione dipende dal tempo di esposizione necessario (normalmente circa 1 ora). La successiva elaborazione computazionale viene tipicamente eseguita in un giorno. Nota, il protocollo di colorazione relativamente lungo è ideale per l&#39;elaborazione batch di grandi quantità di campioni. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Figura 2. Segnale rumore rapporto di valutazione della BCM a diverse lunghezze d&#39;onda. Un lobo duodenale pancreas mouse colorati per l&#39;insulina e con un cocktail di anticorpi secondari coniugati con fluorocromo (Alexa 488, 594, 680 e750), è stato utilizzato per determinare S: N coefficienti a lunghezze d&#39;onda diverse. A, Le immagini mostrano il primo fotogramma di proiezione per ogni canale del segnale. B, grafico illustrante la media S: N per ciascun canale di segnale. I coefficienti sono stati determinati come l&#39;intensità isolotto media (basata su 215 isolotti) divisa per l&#39;intensità di fondo (la fluorescenza tessuto endogeno dal tessuto esocrino). C, il grafico mostra S: rapporti di N per le isole individuali in ogni canale normalizzata con l&#39;S: N ottenuti per il canale 594 di Alexa. Un modo ANOVA è stato utilizzato per le analisi statistiche. Livelli di significatività indicati corrispondono agli ** p &lt;0.01. Scala in bar (A) corrisponde a 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Figura3. Separazione dei canali. A, anticorpi secondari coniugati con coloranti Alexafluor elencati nella tabella sono stati immobilizzati separatamente proteinG-sefarosio perline. B, Le perle fluorescenti sono stati poi integrati a diversi livelli in un fantasma agarosio e ripreso utilizzando filtri indicati. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Figura 4. OPT imaging basato multicanale nella ricerca sul diabete. A, OPT base iso-superficie di ricostruzione di un pancreas (12 settimane, lobo duodenale) dal diabetico non obeso (NOD) modello per diabete di tipo 1. Il campione è macchiato di insulina (isole β-cellule, pseudo colore blu); muscolatura liscia α-actina (vasi sanguigni, rossi) e CD3 (linfociti T infiltranti, verde). Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati corrispondenti, Cy3, IRDye-680 e DyeLight-750, rispettivamente. Ilinserti (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;), mostrano i canali dei segnali singoli. B, immagine OPT (blow up vista) di un lobo epatico mouse (lateralis lobus sinistri) innestato con isolotti singenici e ripreso con NIR-OPT due settimane dopo trapianto. Le isole di insulina che esprimono sono pseuodocolored in blu e il muscolo liscio α-actina navi positivi sono in rosso. L&#39;approccio consente valutazioni di trapianto delle isole di distribuzione all&#39;interno della rete vascolare. Barre scala corrisponde a 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Figura 5. NIR-OPT facilita l&#39;imaging di grandi campioni. A, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas di ratto dal modello Zucker Fatty per diabete di tipo 2 (lobo splenico a 9 mesi), che esemplifica la possibilità di provino immagine sul ratto scala pancreas di NIR-OPT. Come determinatoda questa tecnica il lobo visualizzato è ~ 6 volte più grande (v / v) rispetto al suo omologo mouse e ospita 10.139 insulina esprimere isole di Langerhans cui β-volume cellulare costituisce 1,32% del volume totale lobulare. B, corrispondente alla sezione tomografica linea tratteggiata in (A) illustra che le isole di tutte le profondità del tessuto vengono rilevati. C, Iso-superficie di rendering della distribuzione BCM in un pancreas topo (lobo splenico a 8 settimane) hanno mostrato come riferimento dimensione. Il lobo visualizzata ospita 2.490 isolotti di insulina che esprimono la cui β-cellule del volume costituisce il 0,89% del volume totale lobulare. Il pancreas sono macchiati con GP anti-insulina seguita da Alexa594 capra coniugato anti-GP (mouse) e IRDye 680 Donkey coniugata anti-GP (ratto) anticorpi rispettivamente. I campioni in (AC) sono raffigurati in scala e la barra di scala in (C) corrisponde a 2 mm. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Figura 6" fo:cONTENUTO-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Figura 6. CLAHE facilita la rilevazione di isolotti nel pancreas murino per immagini OPT. AC, Rappresentante iso-superficie le immagini di rendering di un OPT C57Bl / 6 pancreas mouse (lobo splenico a 8 settimane) marcato per l&#39;insulina. Iso-superficie ricostruzioni di immagini OPT stati eseguiti prima (A, verde pseudo colorato) e dopo il protocollo CLAHE stato applicato (B, pseudo colore rosso). C, sovrapposizione dei dati non normalizzati in (A) ed i dati CLAHE trasformati in (B). C&#39;-C &quot;, rappresentativa overlay alto ingrandimento dei non normalizzati (A) e CLAHE trasformati (B) le immagini. Come mostrato dalla presenza di&quot; red-solo &quot;isolotti, lo script CLAHE facilita il rilevamento di piccolo segnale e bassa isolotti intensità. Nell&#39;esempio raffigurato il campione attuale (dopo CLAHE trasformazione) harbored 2419 isolette con un volume di 1,74 mm 3 (numeri in base ai dati corrispondenti proiezione non trasformate 1057 isolette with un volume di 1,77 mm 3). D ed E, i dati di esempio di controllo (D) e l&#39;ob / ob modello murino di diabete di tipo 2 12 (E) a 6 mesi che implementano il protocollo CLAHE. Si noti il ​​massiccio aumento generale delle dimensioni delle isole in ob / ob pancreas (E). In (D) e (E) il contorno pancreas (grigio) è basato sul segnale dal autofluorescenza tessuto. Barra della scala in C è di 500 micron di AC. Barra della scala in C &quot;corrisponde 200 micron in C &#39;e C&#39;&#39;. Scala bar E corrisponde a 1 mm (D) e (E). Immagini di (AC) sono adattato da Hörnblad et al 3 e sono stati generati utilizzando il Bioptonics 3001 scanner. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Supporto del campione per il fissaggio dei campioni OPT. Il campione viene fissato inserendo aghi attraverso il distanziatore agarosio attraverso i fori predisposti nelle flange. Il titolare è incernierato al motore passo-passo tramite unforte magnete situato nella sua base. Questa configurazione omette l&#39;uso di colle instabili e impedisce movimenti indesiderati del campione durante la scansione.

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Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &amp;#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Descriviamo l&#39;adattamento della tomografia ottica di proiezione (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; All&#39;imaging nello spettro dell&#39;infrarosso vicino, e l&#39;attuazione di una serie di strumenti di calcolo. Questi protocolli consentire una valutazione della pancreatica β-cellulare di massa (BCM) in esemplari più grandi, aumentare la capacità multicanale della tecnica e aumentare la qualità dei dati OPT.

Near Infrared Tomografia ottica di proiezione per la valutazione delle β-cellule Grande Distribuzione in Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

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Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

16.2K Views.  Umeå University. Descriviamo l'adattamento della tomografia ottica di proiezione (OPT) 1 All'imaging nello spettro dell'infrarosso vicino, e l'attuazione di una serie di strumenti di calcolo. Questi protocolli consentire una valutazione della pancreatica β-cellulare di massa (BCM) in esemplari più grandi, aumentare la capacità multicanale della tecnica e aumentare la qualità dei dati OPT.

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In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared fluorescenza (NIRF) intravascolare Imaging Molecolare della placca infiammatoria, un approccio multimodale per Imaging di aterosclerosi

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

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Medicina

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Doppler Optical Coherence Tomography di circolazione retinica

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Generazione e quantificazione 3-Dimensional di arteriosa lesioni nei topi mediante tomografia ottica di proiezione

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Tissue-simulando Phantoms per valutare il potenziale vicino infrarosso applicazioni di imaging di fluorescenza nella chirurgia del cancro al seno

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

In Vivo, percutanea, Ago Based, Optical Coherence Tomography di masse renali

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia ottica di coerenza di risoluzione ultraelevata Mouse per aiutare l'iniezione intraoculare nella ricerca retinica terapia genica

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part of many experimental procedures where reagents need to be introduced directly into the bloodstream. Unwittingly, the injection can be subcutaneous, possibly altering the scientific outcomes. Utilizing a nanoemulsion-based biological probe with an incorporated near-infrared fluorescent (NIRF) dye, this method offers the capability of imaging a successful tail vein injection in vivo. With the use of a NIRF imager, images are taken before and after the injection of the agent. An acceptable IV injection is then qualitatively or quantitatively determined based on the intensity of the NIRF signal at the site of injection.

Here we present a method to validate tail vein injections in rats by utilizing near-infrared fluorescence imaging data from dyes incorporated into agents or biological probes. The tail is imaged before and after the injection, the fluorescent signal is quantified, and an assessment of the injection quality is made.

Una nuova pratica migliore per la convalida di coda vena iniezioni nel ratto con agenti vicino-infrarosso-Labeled

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Metodo semi-minimo invasivo per indurre l'infarto miocardico nei ratti e la valutazione della funzione cardiaca da parte di un sistema cardiaco funzionante isolato

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated hemoglobin molecules. A probe placed on the skin emits light that is absorbed, scattered, and reflected by the underlying tissue. Detectors in the probe sense the amount of reflected light: this reflects the organ-specific ratio of oxygen supply and consumption - independent of pulsatile flow. Modern devices enable the simultaneous monitoring at different body sites. A rise or dip in the rSO2 curve visualizes changes in oxygen supply or demand before vital signs indicate them. The evolution of rSO2 values in relation to the starting point is more important for interpretation than are absolute values.
A routine clinical application of NIRS is the surveillance of somatic and cerebral oxygenation during and after cardiac surgery. It is also administered in preterm infants at risk for necrotizing enterocolitis, newborns with hypoxic ischemic encephalopathy and a potential risk of impaired tissue oxygenation. In the future, NIRS could be increasingly used in multimodal neuromonitoring, or applied to monitor patients with other conditions (e.g., after resuscitation or traumatic brain injury).

This protocol is designed to assist clinicians to measure regional tissue oxygenation at different body sites in infants and children. It can be used in situations where tissue oxygenation is potentially compromised, particularly during cardiopulmonary bypass, when using non-pulsatile cardiac-assist devices, and in critically ill neonates, infants and children.

Come somministrare la spettroscopia del vicino infrarosso in neonati, neonati e bambini gravemente malati

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...