Noi riconosciamo con gratitudine il gruppo di biologia delle cellule Beta all'UMass diabete centro di eccellenza per le discussioni e consigli utili. Isolotti pancreatici umani sono stati forniti dal NIDDK-finanziato integrato isolotto distribuzione programma (IIDP) alla città della speranza. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) e dall'associazione americana del diabete concedere n. 1-15-BS-003 (LCA) in collaborazione con l'ordine dell'amaranto.

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dal comitato di uso e UMass Medical School istituzionale Animal Care. Gli studi umani dell'isolotto sono stati determinati mediante la UMass Institutional Review Board a non qualificarsi per revisione IRB o esenzione perché non implicano l'uso di soggetti umani.
1. isolotto isolamento e coltura
<ol><li>Isolotti di isolare e separare dalla contaminazione del tessuto esocrino e duttale utilizzando il metodo di vostra scelta. Nota: Questo metodo è stato ottimizzato utilizzando isolotti isolati di insufflazione ductal collagenosi e Ficoll separazione12 (roditore) o post-shipment isolotti dal programma integrato di distribuzione dell'isolotto (IIDP13; umani). Gli isolotti sono state raccolte a mano con una micropipetta P200.</li>
	<li>Per ottimizzare la morfologia dell'isolotto, consentire isolotti recuperare una notte nel mezzo di isolotto completa di 10 mL (RPMI con 10% FBS, penicillina/streptomicina e glucosio 5,5 mmol/L) in una camera umidificata contenente 5% CO2 a 37 ° C. Anche se questo passaggio non è necessario per ottenere le sezioni, le isolette sono più intatte dopo un periodo di recupero (Vedi Figura 2).</li>
</ol>2. isolotto fissazione
<ol><li>Utilizzando una punta di basso-associazione P200, accuratamente circa 250 isolotto equivalenti (IEQ)13 utilizzando una griglia calibrata sotto un microscopio stereoscopico in una provetta da 1,5 mL basso associazione microfuge. Basso-associazione consigli e tubi riducono la perdita dell'isolotto.</li>
	<li>Consentire isolotti a depositarsi sul fondo del tubo del microfuge. Rimuovere il surnatante maggior parte con una punta di pipetta P200, facendo attenzione a non per rimuovere qualsiasi isolotti.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta in una centrifuga di Benna oscillante fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di soluzione di formalina al 10% o paraformaldeide 4% appena fatte. Difficoltà a temperatura ambiente per 30 minuti. Per i risultati testati in questo metodo, questi metodi di fissazione erano indistinguibili. Più breve fissazione può anche essere possibile; si consiglia di ottimizzare la durata della fissazione per il risultato desiderato.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo con una punta di P200.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS. Centrifugare la provetta fino a quando la velocità raggiunge i 200 x g e quindi fermare la rotazione. Eliminare il surnatante. Ripetere il lavaggio con PBS, per un totale di due lavaggi.</li>
	<li>Procedere immediatamente alla fase successiva.</li>
</ol>3. preparazione del disco dell'isolotto (Figura 1)
<ol><li>Al primo utilizzo, sciogliere il gel (ad esempio, Histogel) a 70 ° C e fare le aliquote in 1,5 mL microfuge tubi per immagazzinaggio a lungo termine. Aliquotare il volume non è critico, poiché le aliquote possono essere riutilizzate.</li>
	<li>Caldo il gel (circa 100 µ l per campione) a 70 ° C inserendo microfuge provetta contenente l'aliquota di gel in un blocco di calore impostato a 70 ° C.</li>
	<li>Trasferimento dell'agarosi blu perline (10 µ l per ogni campione) in una provetta pulita microfuge 1,5 mL. Risospendere accuratamente le perle prima di pipettaggio. Nota: Perline blu sono mescolati con gli isolotti di assistere nell'identificazione visiva del materiale incorporato nel pulsante di agarosio e il blocco di paraffina. Il numero di perline blu utilizzato non è fondamentale per il risultato, ma evitare eccessiva Perline (> 5 x il numero di isolotti) per consentire una distribuzione ottimale degli isolotti in sezioni.</li>
	<li>Lavare le perle blue con 1mL di PBS, due volte. Per ogni lavaggio, girare le perline 1 min a 800 x g. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le perline a (n+ 2) x 10 µ l di PBS, dove n è il numero di provette; ad esempio, per 2 provette dei campioni, il volume di PBS per aggiungere ai talloni sarebbe 40 µ l.</li>
	<li>Centrifugare la provetta microfuge contenente isolotti (breve rotazione a 200 x g) e rimuovere la maggior parte del surnatante. Tagliare la punta di una punta di una micropipetta 10 µ l con forbici o una lama e aggiungere 10 µ l di perline in ogni provetta dell'isolotto, utilizzando una punta pulita per ogni campione. Non mescolare (per evitare di perdere gli isolotti).</li>
	<li>Centrifugare a isolotti e perline (breve rotazione a 200 x g). Rimuovere tanto PBS come possibile con un integrale punta micropipetta 10 µ l.</li>
	<li>Marcare i vetrini microscopio per identificazione dei campioni. Due o tre campioni possono essere preparati su ogni diapositiva. Porre il vetrino sul banco vicino il blocco di calore con gel riscaldato. Tagliare le punte di tre-cinque 20 consigli di micropipetta obbligatoria bassa µ l per campione con una lama di rasoio o forbici. Caricare due P20 Micropipette con punte di taglio per consentire il rapido passaggio da uno a altro.</li>
	<li>Utilizzando la micropipetta prima, aggiungere 15-20 µ l di gel caldo al tubo microfuge isolotti/perline; miscelare immediatamente, evitando bolle; e applicare la miscela liquida di agar/isolotti/perline alla diapositiva per formare un < disco 1 cm di diametro. Posizionare il disco vicino al bordo della diapositiva, lasciando spazio per l'anello esterno gel (passo successivo). Tocca la diapositiva delicatamente un paio di volte a risolvere gli isolotti e perline.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta seconda, aggiungere 20 µ l di gel caldo alla provetta del campione. Utilizzando il prima micropipetta, mix nuovo gel con qualsiasi isolotti/perline restanti, ri-riscaldamento del blocco di calore se inizia a solidificare, quindi applicare questa miscela alla diapositiva, che circondano il disco originale. Ripetere, se necessario, con ulteriori suggerimenti pre-tagliati, fino a quando il disco è la dimensione desiderata e lo spessore. Nota: La gestione del disco gelificato è più facile se l'anello esterno è leggermente più spessa. Di solito, 3 x 20 µ l del gel è sufficiente. Questo passaggio minimizza la perdita di isolotti da tubo lavaggi e aggiunge isolotto-poveri agarosio all'esterno del disco per facilitare la gestione dei dischi.</li>
	<li>Preparare individualmente ogni disco e tenere traccia accurata di ordine del campione se posizionando più dischi su ogni diapositiva.</li>
	<li>Porre i vetrini su una superficie piana di ghiaccio bagnato, con un coperchio, per 10 minuti o fino a quando il gel si solidifica. È più difficile da far scorrere il disco fuori il vetro se si asciuga.</li>
	<li>Biopsia di etichetta elaborazione/incorporamento cassette per tessuti con la matita, uno per ogni campione. Asciugare la parte posteriore della diapositiva per evitare di bagnare la carta blu.</li>
	<li>Utilizzando il bordo non tagliente di una lama di rasoio, premere delicatamente il disco in ogni direzione per liberarlo dal vetro. Quando scivola facilmente, spingere lentamente il disco dal vetrino da microscopio sulla carta tessuto blu. Posizionare il disco, il lato piatto verso il basso, direttamente sulla carta.</li>
	<li>Mantenere il disco piatto, piegare la carta intorno al disco per evitare qualsiasi movimento, inserire il CD in carta piegata nella cassetta e chiudere la cassetta. Se il disco non scorre in modo pulito il vetro, aggiungere più gel e/o ritorno lo scivolo di ghiaccio per un paio di minuti.</li>
	<li>Immergere la cassetta in PBS in un becher. Processo per lo stesso giorno per morfologia ottimale di inclusione a paraffina.</li>
</ol>4. inclusione in paraffina
Nota: Processo il gel dell'isolotto dischi a blocchetti di paraffina usando una serie di disidratazione abbreviato come descritto di seguito. Questa tecnica è stata ottimizzata utilizzando un processore automatizzato, ma l'elaborazione manuale dovrebbe produrre risultati simili.
<ol><li>Immergere le cassette in 85% di etanolo per 15 minuti.</li>
	<li>Immergere le cassette in etanolo al 95% per 15 minuti.</li>
	<li>Immergere le cassette in etanolo al 100% per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Immergere le cassette in xilene per 15 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Immergere le cassette in paraffina fusa per 10 minuti.</li>
	<li>Trasferire cassette al fresco paraffina fusa per 10-30 minuti.</li>
	<li>Aprire la cassetta con cautela e scartare la carta blu. Rimuovere il disco di gel, tenendo traccia della superficie piana che si opponeva alla carta. Incorporare il disco in uno stampo piccolo, con la superficie piatta (isolotto-contenenti) verso il basso, parallelo alla superficie di taglio. Per la spina, attentamente rimuoverlo dal cassetto e incorporarlo in uno stampo piccolo con la punta rivolta verso la superficie di taglio.</li>
</ol>5. paraffina sezionamento e colorazione
<ol><li>Etichettare i vetrini in sequenza se le sezioni di serie sono necessari.</li>
	<li>Hanno 5 µm paraffina sezioni tagliate da un esperto istotecnico. Per massimizzare la resa, salvare tutte le sezioni contenenti materiale. In genere, raccogliendone 20 sezioni, cattura della maggior parte del materiale.</li>
	<li>Memorizzare sezioni a temperatura ambiente. Le sezioni sono suscettibili di immunofluorescenza (ad es., insulina, glucagone e DAPI) e le macchie istologiche sistematiche (ad es., H & E). Ottimizzare la fissazione per altri antigeni, se necessario.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse di dichiarare.

Questo metodo di incorporamento gel a base di disco modificato fornisce un semplice, poco costoso e un modo efficace per generare un rendimento elevato degli isolotti per ogni sezione. Costruire il disco gel su una superficie di vetro piano facilita spalmare isolotti in una distribuzione uniforme su un'area ben definita. Diffondere gli isolotti in un disco piatto offre il vantaggio di immissione molti isolotti nel piano della sezione, ottimizzando il rendimento e permettendo minori isolotti essere utilizzato. Lo spessore...

Isole di Langerhans, la sola fonte di insulina, di circolazione sono un tessuto critico per gli investigatori studiando il diabete mellito. Da qualsiasi dato organismo, isolotti hanno dimensione variabile, frequenza di tipo cellulare e architettura1,2,3. La strategia convenzionale di studiare in vivo struttura e composizione endocrina delle cellule degli isolotti pancreatici è sezionando pancreas tessuto4,5. Poiché gli isolotti comprendono solo una piccola frazione del totale contenuto cellulare pancreatica, gli studi molecolari sono svolti su isolotti isolati. Ex vivo dell'isolotto cultura esperimenti di verifica risposta a nutrienti, modulazione genica (trasfezione, trasduzione), o trattamenti sperimentali forniscono comprensione importante nei meccanismi che modulano la funzione, la proliferazione e sopravvivenza delle cellule endocrine 5 , 6.
Ex vivo esperimenti isolotto spesso sono analizzati utilizzando gli studi molecolari degli isolotti interi o studi istologici o molecolari delle cellule dell'isolotto disperso coltivate in monostrato5,6. L'analisi molecolare degli isolotti interi introduce l'avvertimento serio di mescolanti tipi di cellule, che possono produrre risultati falsi-negativi o falsi positivi quando estrapolati per qualsiasi tipo di cellula individuale. Dispersione delle cellule sul coprioggetto per post-cultura microscopia permette la misura di esito di cellula-tipo-specifico, ma sconvolge architettura dell'isolotto, che può alterare la risposta ad intervento e preclude l'identificazione dei risultati legati al architettura. Inoltre, generalmente solo un singolo risultato può essere misurato; ad esempio, per misurare la proliferazione delle cellule beta e la morte delle cellule beta nelle stesse condizioni, due esperimenti separati devono essere eseguite. Questi approcci sono anche ciechi alla variabilità inter-isolotto, un'area di crescente interesse nel campo. Le cellule dell'isolotto ordinamento tramite flusso cytometry per studi molecolari specifici del tipo di cellula o di cella singola RNA studi sono eleganti ma costoso, richiede tempo, limitato da abbondanza di tessuto, eradicare l'architettura e non ben si adatta ad analisi di routine delle cellule cultura 5 , 7. formazione immagine confocal di intero-monta immunostained isolotti fornisce dati intatti-architettura di alta qualità, ma è alta intensità di manodopera, e i dati ottenuti da ciascun campione sono limitati ai risultati identificabili in un singolo immunostaining8.
La capacità di generare sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti interi post-cultura consentirebbe di affrontare molte di queste preoccupazioni. Tessuto dell'isolotto ad alto costo, basso-abbondanza da modelli genetici unici o da donatori di organi umani, o isolotti stato post in vivo o in vitro manipolazione sperimentale, sono preziosi. Come ottenere di più sezioni di paraffina dalle isolette stesse consentirebbe analisi multiple di cellula-tipo-specifico, architettura intatta dallo stesso esperimento.
Le tecniche esistenti per generare pellet dell'isolotto per il sezionamento sono imperfette. Istologia-ottimizzato dell'agarosi sono un gel acquoso basso punto di fusione che è ampiamente usato nell'elaborazione di campioni istologici e citologici inclusi campioni di tessuto piccolo o frammentati che sono difficili da processo9. Un isolotto l'incorporamento di approccio è quello di sospendere gli isolotti in agarosio in un tubo del microcentrifuge, centrifugare a pellet il materiale, recuperare la spina di agar, poi elaborare e incorporare per il sezionamento10,11. Estrarre il campione solidificato dalla parte inferiore del tubo è che richiede tempo e difficile, portando a occasionali frammentazione del campione e rischio di lesioni personali. Gli isolotti sono concentrati nella punta della spina, che conduce alla distribuzione inadeguata dell'isolotto in sezioni ottenute da questo metodo. Il fondo rotondo della spina complica l'incorporamento tale che una regione dell'isolotto-poveri può essere presentata per il sezionamento. Nel complesso, questo metodo porta a bassa resa e distribuzione ragruppata isolotto nelle sezioni risultante.
Questo nuovo metodo è un approccio semplificato e migliorato per la preparazione di sezioni dell'isolotto. Gli isolotti sono concentrati in un piccolo volume e poi messo sulla superficie liscia di un vetrino da microscopio per formare un piccolo disco, con gli isolotti in un unico piano. Il disco Histogel-isolotto è successivamente trattato per inclusione in un protocollo di infiltrazione di xilene e ridotta disidratazione a paraffina. L'approccio precedente, che si concentra sugli isolotti nella parte inferiore di un tubo di microfuge, avviene anche come termine di paragone. Questa nuova tecnica migliora il rendimento degli isolotti per ogni sezione, la distribuzione degli isolotti in ogni sezione e richiede meno tempo per trasferire i blocchi dell'isolotto a cassette. Questa tecnica è utile per i biologi dell'isolotto o altri gli scienziati che studiano i piccoli pezzi di tessuto che desiderano massimizzare produttivo utilizzano di un tessuto basso-abbondanza misurando i risultati multipli su un singolo campione nella sua architettura di tessuto nativo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

Gli esperimenti usando isolotti pancreatici isolati sono importanti per la ricerca sul diabete, ma gli isolotti sono costosi e di abbondanza limitata. Isolotti contengono una popolazione di cellule miste in un'architettura strutturata che gli impatti funzione e isolotti umani sono ampiamente variabile nella composizione di tipo cellulare. Attuali metodi utilizzati di frequente per studiare isolotti coltivati includono studi molecolari su isolotti interi, tipi di cellule dell'isolotto disparati lumping insieme, o microscopia o studi molecolari su cellule disperse dell'isolotto, interrompendo l'architettura dell'isolotto. Per in vivo gli studi dell'isolotto, paraffina pancreas sezionamento è una potente tecnica per valutare i risultati di cellula-specifico nell'ambiente del pancreas nativo. Studiando la post-cultura isolotti dalla divisione di paraffina sarebbe offrono diversi vantaggi: rilevamento di risultati multipli sulla stessi isolotti (potenzialmente anche lo stessa esatta isolotti, utilizzando sezioni di serie), le misure di cellula-tipo-specifico e mantenimento nativo isolotto-cellula e cellula-substrato interazioni sia durante l'esposizione sperimentale che per l'analisi. Tuttavia, le tecniche esistenti per l'incorporamento isolato isolotti post-cultura sono inefficienti, che richiede tempo, soggetta a perdita di materiale e generalmente producono sezioni con numeri di isolotto inadeguata per essere utili per quantificare i risultati. Impianti di preparazione delle cella blocco del laboratorio di patologia clinica sono inaccessibili e poco pratico per i laboratori di ricerca di base. Abbiamo sviluppato un metodo di banco migliorato, semplificato che genera sezioni con resa robusta e distribuzione degli isolotti. Fissi isolotti sono risospese in gel di agarosio istologico caldo e pipettati in un disco piatto su un vetrino standard, tale che gli isolotti sono distribuiti in un aereo. Dopo disidratazione standard e incorporamento, più (10 +) 4-5 µm sezioni possono essere tagliati dallo stesso blocco dell'isolotto. Utilizzando questo metodo, analisi istologiche ed immunofluorescenti possono essere eseguite sul topo, ratto e isolotti umani. Si tratta di un approccio efficace, poco costoso, risparmio di tempo per valutare i risultati specifici del tipo di cellula, architettura intatta da isolotti coltivati.

Un disegno schematico illustrato i passaggi per preparare il disco gel è illustrato nella Figura 1. Questo risultati del metodo di disco gel nelle sezioni della paraffina che contengono un numero sufficiente di isolotti distribuiti in un unico piano per consentire significativa quantificazione dei risultati. La figura 2 Mostra il basso ingrandimento immagini delle sezioni risultante per illustrare il numero di isolotti catturato...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K Views.  UMass Medical School. Ex vivo dell'isolotto pancreatico studi sono importanti per la ricerca sul diabete. Le tecniche esistenti per studiare isolotti coltivati nella loro architettura 3-dimensionale nativo sono che richiede tempo, inefficiente e utilizzati raramente. Questo lavoro descrive un metodo nuovo, semplice ed efficiente per la generazione di sezioni di paraffina di alta qualità di isolotti tutta coltivati.

Video: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murino pancreatica isolamento Islet

Ricerca

Biologia

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...