Questo protocollo è stato originariamente sviluppato presso Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle da Xiaolan Ye e Michael Petrascheck presso il Laboratorio di Linda Buck. La versione di cui sopra è stato preparato per rendere l&#39;intera procedura a disposizione della comunità più ampia. Ringraziamo Carol Taylor, Sarah LeBoeuf e Andy Tomacelli per leggere criticamente il protocollo. Si tratta di manoscritto # 2866 da The Scripps Research Institute. Il laboratorio Petrascheck è finanziato dal programma Novartis ADI.

Descrizione: Il protocollo è diviso in quattro parti. Parte 1 descrive come preparare i batteri alimentazione. Parte 2 descrive come preparare la cultura worm. Parte 3 descrive come punteggio la durata della vita. Parte 4 mostra alcuni risultati rappresentativi, e parte 5 descrive come preparare le soluzioni richieste. Esperimenti di durata richiedere diverse settimane per essere completato. Per ogni passo della settimana protocollo, giorno e ora del giorno è incluso per facilitare la pianificazione. La fase L4 (giorno 0) viene utilizzata come punto di riferimento per l&#39;intero protocollo. 1. Preparazione di batteri alimentazione Questa sezione descrive la preparazione dei batteri alimentazione. Le specifiche E. coli ceppo usato per alimentare C.elegans si chiama OP50. Prima di questo protocollo, per evitare la contaminazione incrociata della cultura verme con altri batteri, il ceppo OP50 è stato fatto Carbenicillin / ampicillina resistenti 21. Preparare la OP50 4-5 giorni di anticipo. Tutti i materiali a contatto con OP50 devono essere sterili. Giorno -7: Giovedi (settimana 1): Seminare 5 ml di TB contenente 100 mg / ml Ampicillina e 0,1 mg / ml amfotericina B con un unico OP50 colonia e incubare per una notte a 37 ° C in un agitatore batterica. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1). Mattina 8:30. Seminare presto per lasciare il tempo sufficiente per la cultura di raggiungere la saturazione <ol><li> Diluire la cultura durante la notte di OP50 1:2000 in 300 TB ml contenente 50 mg / mL di ampicillina. Incubare la coltura batterica in uno shaker per 8-12 ore a 37 ° C fino a saturazione. Non permettere che la cultura di crescere più di 14 ore. </li><li> Trasferire il OP50 in una sterile, pre-ponderato tubo di centrifugazione. Agglomerare le OP50 tramite centrifugazione per 10 min a 3500 rpm (2200 xg) in una centrifuga da tavolo. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet OP50 in acqua sterile e ri-pellet per centrifugazione. Ripetere questa lavare due volte. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con attenzione tutta l&#39;acqua residua. L&#39;acqua non dovrebbe essere lasciato nel tubo. Pesare il tubo di centrifugazione che contiene il pellet e sottrarre il peso del tubo di centrifugazione vuoto al fine di determinare il peso del pellet. </li><li> Accuratamente risospendere il pellet in S-completo ad una concentrazione di 100 mg / ml. Senza grumi dovrebbe essere lasciato. </li><li> La concentrazione di 100 mg / mL OP50 dovrebbe corrispondere a 2 x 10 10 batteri / ml. Utilizzare uno spettrometro foto per determinare il numero di batteri per ml se la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per mL è noto. Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione di alimentazione OP50 a 2 x 10 10 batteri / ml. </li><li> Conservare il OP50solution a 4 ° C fino a quando non viene utilizzato per la cultura worm. </li></ol> 2. Preparazione di una cultura Worm sincrono Questa sezione descrive la preparazione della cultura worm. Il suo obiettivo è quello di generare un età sincrono popolazione di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento con candeggina al punto 5 devono essere sterili. Le piastre sono mantenuta a 20 ° C, salvo diversamente indicato. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1), 16:00: trasferimento degli animali ad un piatto fresco <ol><li> Prendete un piatto 5-10 NGM vecchio giorno in cui la maggioranza della popolazione è composto da larve di vermi L1 fame. </li><li> Sterilizzare una spatola metallica da poco che il riscaldamento nel corso di un becco Bunsen. Lasciate raffreddare. Utilizzare la spatola raffreddato a tagliare pezzi di agar dalla piastra contenente i vermi affamati. Trasferire alcuni di questi pezzi su un piatto fresco 10 teste di serie centimetri NGM con OP50. Incubare per ca. 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggioranza della popolazione è costituito da vermi adulti gravido. Il tempo necessario per gli animali L1 fame di crescere e diventare adulti gravido può variare da ceppo a ceppo. </li></ol> -3 Giorni: Lunedi (settimana 2) 10:00: Stabilire una popolazione sincrona <ol start="3"><li> Raccogliere i vermi dalla piastra 10 cm per lavarli via il piatto con 5-10 ml di acqua sterile. Trasferire il worm / soluzione di acqua in un tubo da 15 ml. </li><li> Lavare i vermi per centrifugazione 2 minuti in una centrifuga da tavolo a 1200 rpm (280 xg). Gettare il surnatante e aggiungere 10 ml di acqua. Ripeti. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di candeggina appena preparato / soluzione di NaOH (2,5 candeggina mL, 1 mL 10N NaOH, 6.5 mL H 2 O). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando il worm rompere. Assicurati di vortice delicatamente ogni minuto. Monitorare l&#39;andamento della reazione sotto il microscopio da dissezione. </li><li> Non appena tutti gli adulti sciogliere, aggiungere 5 ml di M9 tampone per neutralizzare la reazione. </li><li> Lavare le uova tre volte con 10 mL di tampone M9 per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavare le uova una volta con 10 mL S-completo per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL S-completo e trasferire la soluzione di un nuovo tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di S-completo per un volume finale di 40 ml. Agitare delicatamente il tubo durante la notte a temperatura ambiente su un nutator o dispositivo simile. </li></ol> -2 ° giorno: Martedì (settimana 2), ore 12:00: Seed gli animali in piastre <ol start="10"><li> Nell&#39;ambito di applicazione dissezione, verificare se i vermi nati durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella S-soluzione completa contando il numero di worm in 10 microlitri gocce utilizzando un ambito dissezione. Contare almeno 10 gocce per ogni campione. </li><li> Risospendere i vermi ad una concentrazione di 80-100 worm / mL in S-completo. Aggiungi Carbenicillin (stock 100 mg / mL) a una concentrazione finale di 50 mg / ml e amfotericina B (stock 250 mcg / mL) ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml. Agitare su un nutator. Se la preparazione di grandi quantità di worm, utilizza una nunclon 600 mL recipiente con coperchio del filtro. </li><li> Alle 2:30 pm aggiungere il OP50 preparato nella parte 1 ad una concentrazione finale di 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 batteri / mL). Riportare la OP50 a 4 ° C. </li><li> Trasferire 120 microlitri della soluzione del worm/OP50 in ciascun pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti. Usa Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente. Assicurarsi di mantenere i vermi in sospensione durante il pipettaggio. </li><li> Sigillare la piastra con un nastro sigillante per evitare la contaminazione e l&#39;evaporazione. Agitare la piastra su micropiastra shaker per 2 minuti e incubare per 2 giorni a 20 ° C fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. </li></ol> Day 0: Giovedi (settimana 2) prima di mezzogiorno: Sterilizzare gli animali con l&#39;aggiunta di Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Per sterilizzare gli animali aggiungere 30 ml di una soluzione 0,6 mM magazzino FUDR in ciascun pozzetto. Questo passo porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP50 da 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 9 batteri / mL). Sigillare la piastra con sigillanti a nastro e agitare per 2-3 minuti su una piastra di microtitolazione shaker. Se l&#39;OP50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno -2, è importante che il FUDR si aggiunge prima di mezzogiorno. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li></ol> Giorno 1: Venerdì (settimana 2): Aggiungi farmaci per la cultura <ol start="16"><li> Entro le ore 9:00 la maggior parte degli animali devono essere gravide e le uova contengono diversi ciascuno. Aggiungere i farmaci il cui effetto sulla durata di vita è da verificare presso la concentrazione desiderata. Se sciogliere la droga in DMSO le concentrazioni finali di DMSO non deve superare lo 0,6%, come DMSO concentrazioni superiori allo 0,6% C.elegans accorciare la durata della vita. Dopo l&#39;aggiunta del farmaco, sigillare le piastre con nastro isolante e agitare per 2-3 minuti su una micropiastra shaker. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> L&#39;aggiunta di questi farmaci può occasionalmente uccidere alcuni animali per piastra, specialmente se si usa un altro solvente che l&#39;acqua. Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza degli animali morti. In generale, ci dovrebbe essere inferiore a 10 animali morti per 96 pozzetti. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore. </li></ol> 4 ° giorno: Lunedi (settimana 3): Modifica sigillanti <ol start="18"><li> Per consentire ossigeno fresco per entrare nella cultura rimuovere il sigillante, attendere 1 minuto e richiudere il piatto. Agitare la piastra per 2-3 minuti su un agitatore micropiastra. Ripetere una volta alla settimana. </li></ol> 5 ° giorno: Martedì (settimana 3): Aggiungi OP50 nuovo per evitare la fame <ol start="19"><li> Aggiungere 5 ml di mg / ml 100 OP50 soluzione che è stata preparata in parte 1 a ciascuno dei 96 pozzetti per evitare la fame. </li></ol> 3. Punteggio di vita. Questa sezione descrive come la sopravvivenza della popolazione verme sincronizzata della parte 2 viene monitorata fino a quando gli animali sono morti. Per osservare gli animali nel Piastre a 96 pozzetti, utilizzare un microscopio rovesciato con un obiettivo 2x o 2.5x. Record di dati di sopravvivenza per tre volte alla settimana; Lunedi, Mercoledì e Venerdì. Utilizzare il movimento per stabilire se gli animali sono vivi o morti. Forte luce, la luce blu soprattutto, induce gli animali a muoversi. Non rimuovere gli animali morti dal test. Occasionalmente, gli animali che non si muoveva e sono stati determinati morti nel conteggio precedente potrebbe passare più tardi. <ol><li> Al giorno 0, all&#39;inizio dell&#39;esperimento contare il numero totale di vermi in ogni pozzetto. Censore pozzi che contengono più di 18 animali l&#39;analisi come animali in questi pozzi non avrà abbastanza OP50 e mostrerà effetti della restrizione dietetica. </li><li> Al fine di aumentare la possibilità che gli animali muovono scuotere il 96 pozzetti su una micropiastra shaker per 2 minuti. prima del conteggio. </li><li> In ogni conteggio data di registrazione della sessione, e il numero di animali chesi muovono come animali vivi. Movimento nel liquido è molto più facile che su terreni solidi e può essere indotta da luci forti. L&#39;utilizzo di un ingrandimento superiore può aiutare a posto movimenti molto sottili come quelli della punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso l&#39;unico movimento osservato negli animali molto vecchi. </li><li> Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> Ripetere il passo 2-4 ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali sono morti. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati. Questa sezione mostra un esempio di come tenere registri relativi ai dati durata generate da questo test e alcuni risultati rappresentativi. La figura 1A mostra un esempio di come registrare i dati vita durante questo test. Un foglio Excel viene utilizzato per tenere traccia della sopravvivenza delle popolazioni di ogni bene. Per ogni bene è coordinare nel piatto, ceppo, droga, la concentrazione del farmaco e il numero totale di animali vivi il giorno 0 (X0) è registrato all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Registrare la data, così come il numero di vivere e di animali morti tre volte la settimana per seguire la sopravvivenza delle popolazioni diverse in ciascun pozzetto. Per tracciare il grafico dei risultati, calcolare la frazione di animali vivi per ogni giorno e la trama come una funzione del tempo in giorni. P-valori devono essere calcolati utilizzando pacchetti statistici come STATA o software simili. La durata media di C.elegans dipende dalla temperatura. Figura 1B mostra che le variazioni di temperatura dipendenti in vita sono accuratamente riprodotti dal microtitolazione base durata del test 22. Allo stesso modo, il test micropiastra riproduce cambiamenti nella vita da mutanti segnalato per durata della vita che si differenziano dagli animali selvatici N2 tipo 23-24 25 (Fig. 1C). Il test può anche essere usato per fare dichiarazioni più quantitativa. In media Fig1D durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine 7. Ogni punto di dati rappresenta la durata media di 7-12 popolazione, ognuno vive in un altro bene. Anche se il numero di animali per bene è relativamente bassa (5-15 animali) il ben-to-bene variazione è relativamente piccolo come si può vedere dalle barre di errore. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La micropiastra basato durata saggio riproduce accuratamente cambiamenti nella vita riportati in letteratura. (A) Esempio di dati raccolti in un foglio di calcolo excel. Durante ogni sessione di conteggio data, coordinate del bene e del numero di animali vivi e morti è stato registrato. All&#39;inizio dell&#39;esperimento, il numero totale di animali in ciascun pozzetto è stata determinata. (B) Curva di sopravvivenza di tipo selvatico (N2) gli animali cresciuti a 20 ° C e 25 ° C. (C) Le curve di sopravvivenza dei ceppi portatori di mutazioni che influenzano la durata della vita. Tutti e quattro i ceppi sono stati analizzati in parallelo a 20 ° C. (D), curva dose-risposta Mirtazepine N2 animali trattati. Media durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine. Barre di errore indicano la SEM di 8 pozzi per condizione. 5. Materiali. M9 tampone, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g di KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6.0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 900 ml </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Metalli in tracce soluzione <ul><li> 1,86 g di Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g di CuSO 4 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave e conservare al buio. </li></ul> S-basale medio, 1000 ml <ul><li> 5,9 g di NaCl </li><li> 50 ml di fosfato di potassio 1M, pH 6.0 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Lasciar raffreddare la soluzione e si aggiunge 1 ml di colesterolo 5 mg / ml (sciolto in Et-OH). </li></ul> Citrato di potassio 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g tripotassico citrato </li><li> 26,3 acido citrico monoidrato </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-completo di media, 1000 ml <ul><li> 977 mL S-basale </li><li> 10 ml 1M citrato di potassio pH 6 (sterile) </li><li> 10 ml Trace metalli soluzione (sterile) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 3 ml 1M MgSO 4 (sterile) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 NaCl </li><li> 2.5g peptone(A partire dalla caseina, pancreas digerire) </li><li> Agar 17g </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 975 ml e un bar mescolando </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> 0,5 mL di 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 1 mL di Colesterolo 5 mg / ml in etanolo </li><li> 1 mL di 1M MgSO 4 (sterile) </li><li> Potassiumphosphate 25 mL di tampone, pH 6,0 (sterile) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Triptone </li><li> 24 g Estratto di lievito </li><li> 4 mL di glicerolo </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> aggiungere 100 ml di 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mm Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Sciogliere in 670 mL sterili S-completo, fanno 10 ml o 45 ml aliquote. </li><li> Conservare a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 ml di acqua sterile deionizzata </li><li> Sterile filtrato e aliquota </li><li> Conservare a -20 ° C. </li><li> Utilizzare ad una concentrazione finale di 50 mg / ml </li></ul> 250ug / ml di amfotericina B, 4 mL <ul><li> 1mg amfotericina B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Conservare a -20 ° C </li><li> L&#39;uso ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml </li></ul>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato permette di misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Come mostrato nella sezione risultati rappresentativi si replica modo affidabile i risultati precedenti e fornisce informazioni quantitative. Da questo test siamo riusciti a screening oltre 89.000 molecole per il loro effetto sulla durata della vita C.elegans. Ai fini della droga di screening, che misura la durata della vita in un formato da 96 pozzetti micropiastra ha diversi vantaggi rispetto al classico saggio solido media. Si riduce il lavoro necessario per la preparazione dei media, la quantità di spazio di incubazione e la quantità di farmaco richiesto. Il formato a 96 pozzetti e la configurazione microscopia permettono l&#39;automazione del test per intero proiezioni elevato throughput. Durante lo sviluppo del test più valori per ogni variabile e loro combinazioni sono stati testati per i loro effetti sulla durata della vita C.elegans. Questi test inclusi diversi concentrazione OP50 variano da 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), diverso numero di vermi per pozzetto vanno da 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worm / pozzetto), i volumi di cultura diversa che vanno dal 40-150 microlitri per bene (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e cambiamenti nella composizione del buffer. Se alimentato con un Carbenicillin resistente OP50, né Carbenicillin né amfotericina B in concentrazioni indicate sono risultate influenzare C.elegans durata. Agitazione continua dolce delle lastre, come spesso consigliato nella cultura C.elegans liquido, è stato trovato dispensabile per piccoli volumi utilizzati in questo test. Agitando delicatamente ma è necessario se micropiastre con i più grandi pozzi devono essere utilizzati. I valori indicati in questo protocollo sono stati accuratamente selezionati sulla base di confronto statistico delle diverse condizioni testate. La caratteristica più sorprendente di questo saggio è probabilmente il fatto che C.elegans possono essere tenuti in piastre a 96 pozzetti che sono sigillati con nastro adesivo. Side-by-side paragoni non hanno evidenziato alcuna differenza nella durata della vita degli animali coltivate in piastre non sigillati, in piatti sigillati con un sigillante di plastica, o in lastre sigillate con sigillanti che permettono lo scambio d&#39;aria. In tutte e tre le condizioni, gli animali hanno sviluppato molto omogeneo da L1 agli adulti gravide entro 65 ore e ha mostrato durata della vita molto simili. Gli animali cresciuti in parallelo su NGM sviluppato leggermente più veloce, ma questa differenza era indipendente dalla presenza o meno di un sigillante. Il protocollo presentato è basato su batteri vivi, ma può essere adattato per i batteri morti. Tuttavia, in un test di liquido un batterio singolo sopravvissuti possono rapidamente si moltiplicano e ripopolare la cultura. Nelle nostre mani, l&#39;unico modo affidabile per uccidere i batteri nella misura in cui essi possono essere utilizzati per la coltura liquida è per trattamento prolungato dei batteri con raggi gamma. Un punto importante da considerare nella progettazione di un esperimento di vita è il potere di rilevazione. Dipende dalla dimensione dell&#39;effetto, l&#39;effetto del farmaco di interesse deve essere testato in pozzi multipli. In un saggio tipico di 4 farmaci trattati e 4 pozzetti di controllo, che corrisponde approssimativamente a 40-50 animali ciascuno, dovrebbe essere sufficiente per rilevare un aumento del 30% nel ciclo di vita in più del 95% degli esperimenti. Aumenta del 14% vengono rilevati solo nel 60% dei casi e richiedono pertanto pozzi più replicare. La ricchezza di dati di durata generati da questo test può essere usato per sviluppare o sperimentare ceppo specifico Gompertz modelli parametrici 1. Questi modelli Gompertz sono utili per determinare la potenza di rilevazione e di stimare il numero di falsi positivi e negativi per i grandi schermi. Abbiamo verificato le previsioni di questi modelli in esperimenti non vedenti e li ha usati per stimare il numero di falsi negativi in ​​schermi di grandi dimensioni (risultati non pubblicati). In sintesi, possiamo anticipare che il test presentati saranno di grande utilità per identificare piccole molecole che estendono la durata della vita di C.elegans e di studiare i meccanismi alla base.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Also called Fungizone</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Use as positive control at 50&amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternative positive control at 10 &amp;#x03BC;M final concentration</td></tr><tr><td>Sealing Tape</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, non-sterile</td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td></tr><tr><td>Nunclon flask</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>used for large volumes</td></tr></tbody></table>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Durata della vita è un processo biologico regolato da diversi percorsi genetici. Una strategia per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento è quello di studiare gli animali che le mutazioni in porto i componenti di età-regolamentazione percorsi. Se queste mutazioni turbare la funzione del tempo regolamentare percorso e quindi modificare la durata di tutto l&#39;organismo, forniscono importanti intuizioni meccanicistica 1-3. Un&#39;altra strategia per studiare la regolazione della durata della vita è quella di utilizzare piccole molecole per perturbare età regolamentazione percorsi. Fino ad oggi, un certo numero di molecole sono conosciuti per prolungare la durata della vita nei vari organismi modello e sono utilizzati come strumenti per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento 4-16. Il numero di molecole individuate finora è piccola rispetto alla genetica &quot;toolset&quot; che è disponibile a studiare la biologia dell&#39;invecchiamento. Caenorhabditis elegans è uno dei modelli di principio utilizzati per studiare l&#39;invecchiamento grazie alla sua ottima genetica e la durata breve di tre settimane. Più recentemente, C.elegans è emerso come organismo modello per schermi fenotipo farmaco a base 5,7,16-20 a causa delle sue ridotte dimensioni e la sua capacità di crescere nelle piastre di microtitolazione. Presentiamo qui un test per misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Il test è stato sviluppato e utilizzato con successo per lo screening grandi biblioteche per le molecole che si estendono C.elegans durata 7. L&#39;affidabilità del test è stata valutata in prove multiple: in primo luogo, misurando la durata di vita di animali di tipo selvatico cresciuto a diverse temperature, in secondo luogo, misurando la durata di mutanti con durata di vita alterati, in terzo luogo, misurando i cambiamenti nella durata della vita in risposta a diverse concentrazioni del Mirtazepine antidepressivo. Mirtazepine ha già dimostrato di prolungare la durata della vita in C.elegans 7. I risultati di questi test mostrano che il saggio è in grado di replicare i risultati precedenti da altri test ed è quantitativa. Il formato micropiastra rende questo saggio durata compatibile con i sistemi automatizzati di gestione dei liquidi e consente l&#39;integrazione in piattaforme automatizzate.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In questo protocollo vi presentiamo un metodo per misurare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Durata della vita in 96 piastre microtitolazione bene.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.4K Views.  The Scripps Research Institute. In questo protocollo vi presentiamo un metodo per misurare Caenorhabditis elegans Durata della vita in 96 piastre microtitolazione bene.

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Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Ricerca

Genetica

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochimica

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus allowing a single investigator to screen more treatments or conditions over the same amount of time without loss of data quality. The method requires common equipment found in most laboratories working with C. elegans and is thus simple to adopt. The approach centers on assaying independent samples of a population at each observation point, rather than a single sample over time as with traditional longitudinal methods. Scoring entails adding liquid to the wells of a multi-well plate, which stimulates C. elegans to move and facilitates quantifying changes in healthspan. Other major benefits of the Replica Set method include reduced exposure of agar surfaces to airborne contaminants (e.g. mold or fungus), minimal handling of animals, and robustness to sporadic mis-scoring (such as calling an animal as dead when it is still alive). To appropriately analyze and visualize the data from a Replica Set style experiment, a custom software tool was also developed. Current capabilities of the software include plotting of survival curves for both Replica Set and traditional (Kaplan-Meier) experiments, as well as statistical analysis for Replica Set. The protocols provided here describe the traditional experimental approach and the Replica Set method, as well as an overview of the corresponding data analysis.

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

Here we describe the Replica Set method, an approach to quantitatively measure C. elegans lifespan/survival and healthspan in a high-throughput and robust manner, thus allowing screening of many conditions without sacrificing data quality. This protocol details the strategy and provides a software tool for analysis of Replica Set data.

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologia

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Dosaggio ad alto rendimento per misurare l'assunzione di cibo e la durata della vita di Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autore in primo piano: Esplorare la relazione tra lipotossicità e HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Comportamento

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Medicina

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Misura Stress ossidativo Resistenza<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96 pozzetti micropiastre

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Il metodo Set di Replica: Un approccio High-throughput per quantitativamente misura Caenorhabditis elegans durata della vita

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Misura Stress ossidativo Resistenza