Questo protocollo è stato originariamente sviluppato presso Fred Hutchinson Cancer Research Center di Seattle da Xiaolan Ye e Michael Petrascheck presso il Laboratorio di Linda Buck. La versione di cui sopra è stato preparato per rendere l&#39;intera procedura a disposizione della comunità più ampia. Ringraziamo Carol Taylor, Sarah LeBoeuf e Andy Tomacelli per leggere criticamente il protocollo. Si tratta di manoscritto # 2866 da The Scripps Research Institute. Il laboratorio Petrascheck è finanziato dal programma Novartis ADI.

Descrizione: Il protocollo è diviso in quattro parti. Parte 1 descrive come preparare i batteri alimentazione. Parte 2 descrive come preparare la cultura worm. Parte 3 descrive come punteggio la durata della vita. Parte 4 mostra alcuni risultati rappresentativi, e parte 5 descrive come preparare le soluzioni richieste. Esperimenti di durata richiedere diverse settimane per essere completato. Per ogni passo della settimana protocollo, giorno e ora del giorno è incluso per facilitare la pianificazione. La fase L4 (giorno 0) viene utilizzata come punto di riferimento per l&#39;intero protocollo. 1. Preparazione di batteri alimentazione Questa sezione descrive la preparazione dei batteri alimentazione. Le specifiche E. coli ceppo usato per alimentare C.elegans si chiama OP50. Prima di questo protocollo, per evitare la contaminazione incrociata della cultura verme con altri batteri, il ceppo OP50 è stato fatto Carbenicillin / ampicillina resistenti 21. Preparare la OP50 4-5 giorni di anticipo. Tutti i materiali a contatto con OP50 devono essere sterili. Giorno -7: Giovedi (settimana 1): Seminare 5 ml di TB contenente 100 mg / ml Ampicillina e 0,1 mg / ml amfotericina B con un unico OP50 colonia e incubare per una notte a 37 ° C in un agitatore batterica. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1). Mattina 8:30. Seminare presto per lasciare il tempo sufficiente per la cultura di raggiungere la saturazione <ol><li> Diluire la cultura durante la notte di OP50 1:2000 in 300 TB ml contenente 50 mg / mL di ampicillina. Incubare la coltura batterica in uno shaker per 8-12 ore a 37 ° C fino a saturazione. Non permettere che la cultura di crescere più di 14 ore. </li><li> Trasferire il OP50 in una sterile, pre-ponderato tubo di centrifugazione. Agglomerare le OP50 tramite centrifugazione per 10 min a 3500 rpm (2200 xg) in una centrifuga da tavolo. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet OP50 in acqua sterile e ri-pellet per centrifugazione. Ripetere questa lavare due volte. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, rimuovere con attenzione tutta l&#39;acqua residua. L&#39;acqua non dovrebbe essere lasciato nel tubo. Pesare il tubo di centrifugazione che contiene il pellet e sottrarre il peso del tubo di centrifugazione vuoto al fine di determinare il peso del pellet. </li><li> Accuratamente risospendere il pellet in S-completo ad una concentrazione di 100 mg / ml. Senza grumi dovrebbe essere lasciato. </li><li> La concentrazione di 100 mg / mL OP50 dovrebbe corrispondere a 2 x 10 10 batteri / ml. Utilizzare uno spettrometro foto per determinare il numero di batteri per ml se la relazione tra la densità ottica e il numero di batteri per mL è noto. Se necessario, regolare la concentrazione della soluzione di alimentazione OP50 a 2 x 10 10 batteri / ml. </li><li> Conservare il OP50solution a 4 ° C fino a quando non viene utilizzato per la cultura worm. </li></ol> 2. Preparazione di una cultura Worm sincrono Questa sezione descrive la preparazione della cultura worm. Il suo obiettivo è quello di generare un età sincrono popolazione di vermi. Tutti i materiali che entrano in contatto con C.elegans dopo il trattamento con candeggina al punto 5 devono essere sterili. Le piastre sono mantenuta a 20 ° C, salvo diversamente indicato. -6 ° giorno: Venerdì (settimana 1), 16:00: trasferimento degli animali ad un piatto fresco <ol><li> Prendete un piatto 5-10 NGM vecchio giorno in cui la maggioranza della popolazione è composto da larve di vermi L1 fame. </li><li> Sterilizzare una spatola metallica da poco che il riscaldamento nel corso di un becco Bunsen. Lasciate raffreddare. Utilizzare la spatola raffreddato a tagliare pezzi di agar dalla piastra contenente i vermi affamati. Trasferire alcuni di questi pezzi su un piatto fresco 10 teste di serie centimetri NGM con OP50. Incubare per ca. 65 ore a 20 ° C fino a quando la maggioranza della popolazione è costituito da vermi adulti gravido. Il tempo necessario per gli animali L1 fame di crescere e diventare adulti gravido può variare da ceppo a ceppo. </li></ol> -3 Giorni: Lunedi (settimana 2) 10:00: Stabilire una popolazione sincrona <ol start="3"><li> Raccogliere i vermi dalla piastra 10 cm per lavarli via il piatto con 5-10 ml di acqua sterile. Trasferire il worm / soluzione di acqua in un tubo da 15 ml. </li><li> Lavare i vermi per centrifugazione 2 minuti in una centrifuga da tavolo a 1200 rpm (280 xg). Gettare il surnatante e aggiungere 10 ml di acqua. Ripeti. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 5 ml di candeggina appena preparato / soluzione di NaOH (2,5 candeggina mL, 1 mL 10N NaOH, 6.5 mL H 2 O). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando il worm rompere. Assicurati di vortice delicatamente ogni minuto. Monitorare l&#39;andamento della reazione sotto il microscopio da dissezione. </li><li> Non appena tutti gli adulti sciogliere, aggiungere 5 ml di M9 tampone per neutralizzare la reazione. </li><li> Lavare le uova tre volte con 10 mL di tampone M9 per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Lavare le uova una volta con 10 mL S-completo per centrifugazione 2 min a 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Rimuovere il surnatante, aggiungere 10 mL S-completo e trasferire la soluzione di un nuovo tubo da 50 ml. Aggiungere 30 ml di S-completo per un volume finale di 40 ml. Agitare delicatamente il tubo durante la notte a temperatura ambiente su un nutator o dispositivo simile. </li></ol> -2 ° giorno: Martedì (settimana 2), ore 12:00: Seed gli animali in piastre <ol start="10"><li> Nell&#39;ambito di applicazione dissezione, verificare se i vermi nati durante la notte. Determinare la concentrazione di vermi nella S-soluzione completa contando il numero di worm in 10 microlitri gocce utilizzando un ambito dissezione. Contare almeno 10 gocce per ogni campione. </li><li> Risospendere i vermi ad una concentrazione di 80-100 worm / mL in S-completo. Aggiungi Carbenicillin (stock 100 mg / mL) a una concentrazione finale di 50 mg / ml e amfotericina B (stock 250 mcg / mL) ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml. Agitare su un nutator. Se la preparazione di grandi quantità di worm, utilizza una nunclon 600 mL recipiente con coperchio del filtro. </li><li> Alle 2:30 pm aggiungere il OP50 preparato nella parte 1 ad una concentrazione finale di 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 batteri / mL). Riportare la OP50 a 4 ° C. </li><li> Trasferire 120 microlitri della soluzione del worm/OP50 in ciascun pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti. Usa Piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente. Assicurarsi di mantenere i vermi in sospensione durante il pipettaggio. </li><li> Sigillare la piastra con un nastro sigillante per evitare la contaminazione e l&#39;evaporazione. Agitare la piastra su micropiastra shaker per 2 minuti e incubare per 2 giorni a 20 ° C fino a quando gli animali raggiungono lo stadio L4. </li></ol> Day 0: Giovedi (settimana 2) prima di mezzogiorno: Sterilizzare gli animali con l&#39;aggiunta di Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Per sterilizzare gli animali aggiungere 30 ml di una soluzione 0,6 mM magazzino FUDR in ciascun pozzetto. Questo passo porta il volume finale in ogni pozzetto a 150 microlitri e riduce la concentrazione finale di OP50 da 6 mg / ml a 5 mg / ml (1x10 9 batteri / mL). Sigillare la piastra con sigillanti a nastro e agitare per 2-3 minuti su una piastra di microtitolazione shaker. Se l&#39;OP50 è stato aggiunto alle 2:30 del giorno -2, è importante che il FUDR si aggiunge prima di mezzogiorno. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li></ol> Giorno 1: Venerdì (settimana 2): Aggiungi farmaci per la cultura <ol start="16"><li> Entro le ore 9:00 la maggior parte degli animali devono essere gravide e le uova contengono diversi ciascuno. Aggiungere i farmaci il cui effetto sulla durata di vita è da verificare presso la concentrazione desiderata. Se sciogliere la droga in DMSO le concentrazioni finali di DMSO non deve superare lo 0,6%, come DMSO concentrazioni superiori allo 0,6% C.elegans accorciare la durata della vita. Dopo l&#39;aggiunta del farmaco, sigillare le piastre con nastro isolante e agitare per 2-3 minuti su una micropiastra shaker. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> L&#39;aggiunta di questi farmaci può occasionalmente uccidere alcuni animali per piastra, specialmente se si usa un altro solvente che l&#39;acqua. Utilizzare un microscopio invertito per verificare la presenza degli animali morti. In generale, ci dovrebbe essere inferiore a 10 animali morti per 96 pozzetti. Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore. </li></ol> 4 ° giorno: Lunedi (settimana 3): Modifica sigillanti <ol start="18"><li> Per consentire ossigeno fresco per entrare nella cultura rimuovere il sigillante, attendere 1 minuto e richiudere il piatto. Agitare la piastra per 2-3 minuti su un agitatore micropiastra. Ripetere una volta alla settimana. </li></ol> 5 ° giorno: Martedì (settimana 3): Aggiungi OP50 nuovo per evitare la fame <ol start="19"><li> Aggiungere 5 ml di mg / ml 100 OP50 soluzione che è stata preparata in parte 1 a ciascuno dei 96 pozzetti per evitare la fame. </li></ol> 3. Punteggio di vita. Questa sezione descrive come la sopravvivenza della popolazione verme sincronizzata della parte 2 viene monitorata fino a quando gli animali sono morti. Per osservare gli animali nel Piastre a 96 pozzetti, utilizzare un microscopio rovesciato con un obiettivo 2x o 2.5x. Record di dati di sopravvivenza per tre volte alla settimana; Lunedi, Mercoledì e Venerdì. Utilizzare il movimento per stabilire se gli animali sono vivi o morti. Forte luce, la luce blu soprattutto, induce gli animali a muoversi. Non rimuovere gli animali morti dal test. Occasionalmente, gli animali che non si muoveva e sono stati determinati morti nel conteggio precedente potrebbe passare più tardi. <ol><li> Al giorno 0, all&#39;inizio dell&#39;esperimento contare il numero totale di vermi in ogni pozzetto. Censore pozzi che contengono più di 18 animali l&#39;analisi come animali in questi pozzi non avrà abbastanza OP50 e mostrerà effetti della restrizione dietetica. </li><li> Al fine di aumentare la possibilità che gli animali muovono scuotere il 96 pozzetti su una micropiastra shaker per 2 minuti. prima del conteggio. </li><li> In ogni conteggio data di registrazione della sessione, e il numero di animali chesi muovono come animali vivi. Movimento nel liquido è molto più facile che su terreni solidi e può essere indotta da luci forti. L&#39;utilizzo di un ingrandimento superiore può aiutare a posto movimenti molto sottili come quelli della punta della faringe. Tali movimenti sottili sono spesso l&#39;unico movimento osservato negli animali molto vecchi. </li><li> Ritorna piastre ai 20 ° C incubatore </li><li> Ripetere il passo 2-4 ogni due o tre giorni fino a quando tutti gli animali sono morti. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati. Questa sezione mostra un esempio di come tenere registri relativi ai dati durata generate da questo test e alcuni risultati rappresentativi. La figura 1A mostra un esempio di come registrare i dati vita durante questo test. Un foglio Excel viene utilizzato per tenere traccia della sopravvivenza delle popolazioni di ogni bene. Per ogni bene è coordinare nel piatto, ceppo, droga, la concentrazione del farmaco e il numero totale di animali vivi il giorno 0 (X0) è registrato all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Registrare la data, così come il numero di vivere e di animali morti tre volte la settimana per seguire la sopravvivenza delle popolazioni diverse in ciascun pozzetto. Per tracciare il grafico dei risultati, calcolare la frazione di animali vivi per ogni giorno e la trama come una funzione del tempo in giorni. P-valori devono essere calcolati utilizzando pacchetti statistici come STATA o software simili. La durata media di C.elegans dipende dalla temperatura. Figura 1B mostra che le variazioni di temperatura dipendenti in vita sono accuratamente riprodotti dal microtitolazione base durata del test 22. Allo stesso modo, il test micropiastra riproduce cambiamenti nella vita da mutanti segnalato per durata della vita che si differenziano dagli animali selvatici N2 tipo 23-24 25 (Fig. 1C). Il test può anche essere usato per fare dichiarazioni più quantitativa. In media Fig1D durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine 7. Ogni punto di dati rappresenta la durata media di 7-12 popolazione, ognuno vive in un altro bene. Anche se il numero di animali per bene è relativamente bassa (5-15 animali) il ben-to-bene variazione è relativamente piccolo come si può vedere dalle barre di errore. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La micropiastra basato durata saggio riproduce accuratamente cambiamenti nella vita riportati in letteratura. (A) Esempio di dati raccolti in un foglio di calcolo excel. Durante ogni sessione di conteggio data, coordinate del bene e del numero di animali vivi e morti è stato registrato. All&#39;inizio dell&#39;esperimento, il numero totale di animali in ciascun pozzetto è stata determinata. (B) Curva di sopravvivenza di tipo selvatico (N2) gli animali cresciuti a 20 ° C e 25 ° C. (C) Le curve di sopravvivenza dei ceppi portatori di mutazioni che influenzano la durata della vita. Tutti e quattro i ceppi sono stati analizzati in parallelo a 20 ° C. (D), curva dose-risposta Mirtazepine N2 animali trattati. Media durata della vita è rappresentata in funzione della concentrazione Mirtazepine. Barre di errore indicano la SEM di 8 pozzi per condizione. 5. Materiali. M9 tampone, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g di KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Potassiumphosphate pH 6.0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 900 ml </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> Metalli in tracce soluzione <ul><li> 1,86 g di Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g di CuSO 4 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave e conservare al buio. </li></ul> S-basale medio, 1000 ml <ul><li> 5,9 g di NaCl </li><li> 50 ml di fosfato di potassio 1M, pH 6.0 </li><li> 1000 mL di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Lasciar raffreddare la soluzione e si aggiunge 1 ml di colesterolo 5 mg / ml (sciolto in Et-OH). </li></ul> Citrato di potassio 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g tripotassico citrato </li><li> 26,3 acido citrico monoidrato </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Regolare il pH a 6,0 con KOH 5M </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 1000 ml </li><li> Autoclave </li></ul> S-completo di media, 1000 ml <ul><li> 977 mL S-basale </li><li> 10 ml 1M citrato di potassio pH 6 (sterile) </li><li> 10 ml Trace metalli soluzione (sterile) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 3 ml 1M MgSO 4 (sterile) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 NaCl </li><li> 2.5g peptone(A partire dalla caseina, pancreas digerire) </li><li> Agar 17g </li><li> Aggiungere acqua deionizzata a 975 ml e un bar mescolando </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> 0,5 mL di 1M CaCl 2 (sterile) </li><li> 1 mL di Colesterolo 5 mg / ml in etanolo </li><li> 1 mL di 1M MgSO 4 (sterile) </li><li> Potassiumphosphate 25 mL di tampone, pH 6,0 (sterile) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Triptone </li><li> 24 g Estratto di lievito </li><li> 4 mL di glicerolo </li><li> Aggiungere 900 ml di acqua deionizzata </li><li> Autoclave </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave raffreddare a 55 ° C e aggiungere i seguenti componenti: <ul><li> aggiungere 100 ml di 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mm Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Sciogliere in 670 mL sterili S-completo, fanno 10 ml o 45 ml aliquote. </li><li> Conservare a -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml Carbenicillin, 10 mL <ul><li> 1 g Carbenicillin </li><li> 10 ml di acqua sterile deionizzata </li><li> Sterile filtrato e aliquota </li><li> Conservare a -20 ° C. </li><li> Utilizzare ad una concentrazione finale di 50 mg / ml </li></ul> 250ug / ml di amfotericina B, 4 mL <ul><li> 1mg amfotericina B </li><li> 4 mL Et-OH </li><li> Conservare a -20 ° C </li><li> L&#39;uso ad una concentrazione finale di 0,1 mg / ml </li></ul>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes.">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato permette di misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Come mostrato nella sezione risultati rappresentativi si replica modo affidabile i risultati precedenti e fornisce informazioni quantitative. Da questo test siamo riusciti a screening oltre 89.000 molecole per il loro effetto sulla durata della vita C.elegans. Ai fini della droga di screening, che misura la durata della vita in un formato da 96 pozzetti micropiastra ha diversi vantaggi rispetto al classico saggio solido media. Si riduce il lavoro necessario per la preparazione dei media, la quantità di spazio di incubazione e la quantità di farmaco richiesto. Il formato a 96 pozzetti e la configurazione microscopia permettono l&#39;automazione del test per intero proiezioni elevato throughput. Durante lo sviluppo del test più valori per ogni variabile e loro combinazioni sono stati testati per i loro effetti sulla durata della vita C.elegans. Questi test inclusi diversi concentrazione OP50 variano da 3 a 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / mL), diverso numero di vermi per pozzetto vanno da 7 a 45 (7, 10, 15, 22, 45 worm / pozzetto), i volumi di cultura diversa che vanno dal 40-150 microlitri per bene (40, 60, 80, 100, 120, 150 mL), e cambiamenti nella composizione del buffer. Se alimentato con un Carbenicillin resistente OP50, né Carbenicillin né amfotericina B in concentrazioni indicate sono risultate influenzare C.elegans durata. Agitazione continua dolce delle lastre, come spesso consigliato nella cultura C.elegans liquido, è stato trovato dispensabile per piccoli volumi utilizzati in questo test. Agitando delicatamente ma è necessario se micropiastre con i più grandi pozzi devono essere utilizzati. I valori indicati in questo protocollo sono stati accuratamente selezionati sulla base di confronto statistico delle diverse condizioni testate. La caratteristica più sorprendente di questo saggio è probabilmente il fatto che C.elegans possono essere tenuti in piastre a 96 pozzetti che sono sigillati con nastro adesivo. Side-by-side paragoni non hanno evidenziato alcuna differenza nella durata della vita degli animali coltivate in piastre non sigillati, in piatti sigillati con un sigillante di plastica, o in lastre sigillate con sigillanti che permettono lo scambio d&#39;aria. In tutte e tre le condizioni, gli animali hanno sviluppato molto omogeneo da L1 agli adulti gravide entro 65 ore e ha mostrato durata della vita molto simili. Gli animali cresciuti in parallelo su NGM sviluppato leggermente più veloce, ma questa differenza era indipendente dalla presenza o meno di un sigillante. Il protocollo presentato è basato su batteri vivi, ma può essere adattato per i batteri morti. Tuttavia, in un test di liquido un batterio singolo sopravvissuti possono rapidamente si moltiplicano e ripopolare la cultura. Nelle nostre mani, l&#39;unico modo affidabile per uccidere i batteri nella misura in cui essi possono essere utilizzati per la coltura liquida è per trattamento prolungato dei batteri con raggi gamma. Un punto importante da considerare nella progettazione di un esperimento di vita è il potere di rilevazione. Dipende dalla dimensione dell&#39;effetto, l&#39;effetto del farmaco di interesse deve essere testato in pozzi multipli. In un saggio tipico di 4 farmaci trattati e 4 pozzetti di controllo, che corrisponde approssimativamente a 40-50 animali ciascuno, dovrebbe essere sufficiente per rilevare un aumento del 30% nel ciclo di vita in più del 95% degli esperimenti. Aumenta del 14% vengono rilevati solo nel 60% dei casi e richiedono pertanto pozzi più replicare. La ricchezza di dati di durata generati da questo test può essere usato per sviluppare o sperimentare ceppo specifico Gompertz modelli parametrici 1. Questi modelli Gompertz sono utili per determinare la potenza di rilevazione e di stimare il numero di falsi positivi e negativi per i grandi schermi. Abbiamo verificato le previsioni di questi modelli in esperimenti non vedenti e li ha usati per stimare il numero di falsi negativi in ​​schermi di grandi dimensioni (risultati non pubblicati). In sintesi, possiamo anticipare che il test presentati saranno di grande utilità per identificare piccole molecole che estendono la durata della vita di C.elegans e di studiare i meccanismi alla base.

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Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amphotericin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>cat# 171375</td>
<td>Also called Fungizone</td>
</tr>
<tr>
<td>FUDR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat# F0503</td>
<td>FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water</td>
</tr>
<tr>
<td>Mianserin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>M2525-250MG</td>
<td>Use as positive control at 50&mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Cyproheptadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-aldrich</td>
<td>cat#C6022-MG</td>
<td>Alternative positive control at 10 &mu;M final concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Sealing Tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 236370</td>
<td>Polyester, non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>96 well plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>cat# 351172</td>
<td>Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>cat# 178883</td>
<td>used for large volumes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates

Durata della vita è un processo biologico regolato da diversi percorsi genetici. Una strategia per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento è quello di studiare gli animali che le mutazioni in porto i componenti di età-regolamentazione percorsi. Se queste mutazioni turbare la funzione del tempo regolamentare percorso e quindi modificare la durata di tutto l&#39;organismo, forniscono importanti intuizioni meccanicistica 1-3. Un&#39;altra strategia per studiare la regolazione della durata della vita è quella di utilizzare piccole molecole per perturbare età regolamentazione percorsi. Fino ad oggi, un certo numero di molecole sono conosciuti per prolungare la durata della vita nei vari organismi modello e sono utilizzati come strumenti per studiare la biologia dell&#39;invecchiamento 4-16. Il numero di molecole individuate finora è piccola rispetto alla genetica &quot;toolset&quot; che è disponibile a studiare la biologia dell&#39;invecchiamento. Caenorhabditis elegans è uno dei modelli di principio utilizzati per studiare l&#39;invecchiamento grazie alla sua ottima genetica e la durata breve di tre settimane. Più recentemente, C.elegans è emerso come organismo modello per schermi fenotipo farmaco a base 5,7,16-20 a causa delle sue ridotte dimensioni e la sua capacità di crescere nelle piastre di microtitolazione. Presentiamo qui un test per misurare la durata della vita C.elegans in 96 piastre microtitolazione bene. Il test è stato sviluppato e utilizzato con successo per lo screening grandi biblioteche per le molecole che si estendono C.elegans durata 7. L&#39;affidabilità del test è stata valutata in prove multiple: in primo luogo, misurando la durata di vita di animali di tipo selvatico cresciuto a diverse temperature, in secondo luogo, misurando la durata di mutanti con durata di vita alterati, in terzo luogo, misurando i cambiamenti nella durata della vita in risposta a diverse concentrazioni del Mirtazepine antidepressivo. Mirtazepine ha già dimostrato di prolungare la durata della vita in C.elegans 7. I risultati di questi test mostrano che il saggio è in grado di replicare i risultati precedenti da altri test ed è quantitativa. Il formato micropiastra rende questo saggio durata compatibile con i sistemi automatizzati di gestione dei liquidi e consente l&#39;integrazione in piattaforme automatizzate.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In questo protocollo vi presentiamo un metodo per misurare<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Durata della vita in 96 piastre microtitolazione bene.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

36.0K Views.  The Scripps Research Institute. In questo protocollo vi presentiamo un metodo per misurare Caenorhabditis elegans Durata della vita in 96 piastre microtitolazione bene.

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Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Ricerca

Biologia

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Quantificare cronologica Span lievito Life di conseguenza di cellule invecchiate

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Durata pannello misura replicazione in lievito

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Misura Stress ossidativo Resistenza<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96 pozzetti micropiastre

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

Misurazione della tossicità del Peptide RAN in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...