Ringraziamo Emeka Ifedigbo per assistenza tecnica e il Dr. Shivraj Tyagi per la preziosa esperienza. Ringraziamo anche il Centro NeuroDiscovery Harvard per l&#39;assistenza al microscopio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un American Heart Association Predoctoral concedere 09PRE2250120 a Hilaire Lam, e le sovvenzioni NIH, R01-HL60234, HL55330-R01, R01-HL079904, assegnato a AMK Choi.

Il protocollo generale richiede 2 giorni per isolamento di cellule da tessuti animali, 5-10 giorni per la proliferazione cellulare, e un ulteriore 10-14 giorni per la differenziazione cellulare in aria-liquido. Un giorno in più è necessario per l&#39;esposizione delle cellule e la raccolta di campioni. 1. Isolamento di mouse cellule epiteliali tracheobronchiale (MTEC). Nota: Tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso presso il Brigham and Women s Hospital / Area Harvard Medical School. Prima di iniziare: <ul><li> Preparare Ham F12 supporti contenenti antibiotici. A 250 mL Ham F12 i media basale (Cellgro) aggiungere 2,50 ml di una X 100 penicillina / streptomicina (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) soluzione e 250 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone. Conservare a 4 ° C per un massimo di 4 settimane. </li><li> Preparare una soluzione di 0,15% pronasi. Aggiungere 15 pronasi mg a 10 ml di Ham F12 supporti contenenti antibiotici. Fai aperta e tenerla in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare una superficie pulita di lavoro e sterili strumenti chirurgici appropriati per la chirurgia per piccoli animali, e un cappuccio lamellare coltura di tessuti per l&#39;isolamento delle cellule. Tutte le altre apparecchiature è considerato standard per la coltura di cellule animali tra cui umidificata CO 2 incubatori, celle frigorifere, celle tavolo centrifughe, microscopio invertito, e pipetta di plastica monouso e articoli cultura. </li><li> Preparare collagene I soluzione (50 mg / ml 0,02 N in acido acetico). Pipettare 1,0 ml soluzione di collagene in ciascun pozzetto di una piastra transwell 12 pozzetti (Corning). Avvolgerlo in parafilm e lasciate riposare per una notte su una superficie piana a temperatura ambiente. </li></ul><ol><li> Utilizzando un ceppo disponibile in commercio del mouse (cioè, C57BL / 6, maschio 6-8 settimane di età), eutanasia topo, utilizzando un metodo approvato di eutanasia, come la CO 2-indotta narcosi. Tipicamente 6 topi produrrà abbastanza cellule (1.5-2.0 x 10 5 cellule / mouse) alle sementi un 12-pozzetti transwell. </li><li> Spruzzare il carcasse di animali con il 70% EtOH soluzione per sterilizzare il campo. </li><li> Con acqua pulita forbici e bisturi chirurgici, togliere la pelle intorno alla zona della trachea, ed esporre la trachea. Aperto l&#39;addome, tagliare lungo lo sterno, e rimuovere la gabbia toracica. Rimuovere il tessuto fino alla fine della trachea è esposto. </li><li> Tracheas posto in una provetta da 50 ml conica contenente 30 ml Ham F12 supporti contenenti antibiotici, sul ghiaccio. </li><li> In una cappa sterile flusso lamellare, il trasferimento di tessuto tracheale in un piatto sterile 100 millimetri Petri contenenti 10 mL Ham F12 supporti contenenti antibiotici. </li><li> Delicatamente sezionare il tessuto connettivo con una pinza sterile e forbici chirurgiche. </li><li> Trasferimento di tessuto tracheale in un nuovo piatto 100 millimetri Petri contenenti 10 mL Ham F12 supporti contenenti antibiotici per risciacquare. Tagliare tracheas lungo l&#39;asse verticale per esporre lumen. </li><li> Trasferimento tracheas in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di soluzione pronasi 0,15% e incubare una notte a 4 ° C. </li><li> Il secondo giorno, sono pronti: <ul><li> Preparare una soluzione DNAsi I. A 18 mL di Ham F12 supporti contenenti antibiotici aggiungere 2 mL di 10 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) soluzione madre, e 10 mg di greggio al pancreas DNAsi I. Make 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C (scongelati in ghiaccio prima dell&#39;uso). </li><li> Preparare Ham F12 supporti contenenti antibiotici con il 20% di siero fetale bovino (FBS). A 200 mL Ham F12 mezzi basale (Invitrogen), aggiungere 50 ml di calore FBS inattivato, 2,5 mL di una X 100 penicillina / streptomicina (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) soluzione, e 250 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone . </li><li> Preparare terreno base MTEC contenenti antibiotici. A 475,5 mL DMEM/F12 mezzi di base (Cellgro) aggiungere 7,5 ml soluzione 1 M HEPES, 10 ml di soluzione 200 mM glutamina, 2 ml di un 7,5% NaHCO 3 soluzione, 5 mL di una X 100 penicillina / streptomicina soluzione, 500 microlitri di una soluzione di 1000 X Fungizone </li><li> Preparare MTEC medium/10% FBS. A 45 mL di medium MTEC base contenente antibiotici, aggiungere 5 ml di calore FBS inattivato. </li></ul></li><li> Agitare delicatamente il tubo (a partire dal punto 1.8) 10-12 volte, e poi lasciate riposare per 30-60 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 10 mL Ham F12 supporti contenenti il ​​20% FBS e antibiotici per il tubo e il rock 12 volte. </li><li> Preparare 3 15 ml provette coniche da 10 ml Ham F12 supporti contenenti il ​​20% FBS e antibiotici. </li><li> Rimuovere tracheas dalla soluzione pronasi, mettendo da parte questa soluzione sul ghiaccio. Trasferimento tracheas al primo tubo conico contenente F12 Ham e capovolgere tubo di 12 volte. Ripetere questa operazione altre due volte. </li><li> Combina soluzione pronasi con i tre surnatanti dal passaggio 1,13 in un tubo da 50 ml. Eliminare residui di tessuto. </li><li> Centrifugare a 1400rpm (390 xg; centrifuga Eppendorf 5810R dotato di un A-4-62 rotore) per 10 minuti a 4 ° C, il surnatante e gettarlo. </li><li> Delicatamente risospendere il pellet in 1 ml di soluzione DNAsi (100-200 microlitri / trachea)e incubare 5 minuti sul ghiaccio. </li><li> Centrifugare a 1400rpm (390 xg) per 5 minuti a 4 ° C, il surnatante e gettarlo. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 8 ml di mezzo MTEC contenente 10% FBS </li><li> Piastra di sospensione cellulare su piastre Primaria (Falcon). Incubare a 37 ° C in atmosfera del 95% di aria, 5% di CO 2 per 5 ore (Nota: questo è un passo selezione negativa per fibroblasti). </li><li> Raccogliere sospensione cellulare da piatti e lavare piatti due volte con 4 ml MTEC contenente 10% FBS. Cellula sospensione piscina e lava insieme in una provetta da 50 ml. </li><li> Conserve 1 ml per cytospin e il conteggio delle cellule. Spin in una centrifuga da tavolo per 5 min a 5.000 giri (Eppendorf 5415D). Rimuovere 500 microlitri e risospendere pellet in surnatante rimanente. Usa 100 l per il conteggio delle cellule con il metodo Blu colorazione vitale tripan. Conserve 4 aliquote di 100 microlitri per l&#39;analisi cytospin </li><li> Spin restanti 15 ml sospensione cellulare a 1400rpm (390 xg), a 4 ° C per 10 min. </li></ol> 2. Propagazione e Differenziazione dei MTEC Alla aria-liquido Preparare soluzioni di riserva acido retinoico. Soluzione stock A: pesare acido retinoico al buio (Sig. 300,44 g / mol) di fare un 5 mM soluzione madre nel 95% EtOH. Conservare in un tubo di alluminio avvolto a -80 ° C. Se necessario, preparare Soluzione B (5 mM) aggiungendo 50 microlitri archivi A, 500 ul di soluzione BSA (100 mg / mL) e 49,5 ml di Hank soluzione salina bilanciata (HBSS). Conservare in un foglio avvolto tubo a -80 ° C per un massimo di 4 settimane. Preparare medio proliferazione MTEC contenenti acido retinoico. A 45,7 mL supporti MTEC basale contenenti antibiotici, aggiungere 2,5 ml di siero FBS, 1 ml di acido retinoico Azione B, 250 microlitri soluzione di Insulina (2 mg / ml di insulina in 4 mM HCl), 250 microlitri soluzione del fattore di crescita epidermico (5 mg / mL di EGF in HBS contenente 1 mg / ml BSA), 200 ul estratto di ipofisi bovina (15 mg / ml in HBS contenente 1 mg / ml BSA), 50 ul di soluzione transferrina (5 mg / ml transferrina in HBS contenente 1 mg / mL di BSA ), 50 microlitri soluzione tossina del colera (100 mg / ml in HBS contenente 1 mg / ml BSA). Filtro sterilizzare finale preparazione media e utilizzare entro 2 giorni dalla preparazione. <ol><li> Rimuovere la soluzione di collagene da piatti transwell, lasciate riposare sotto il cofano per 5 minuti, e lavare con PBS 2 volte. </li><li> In seguito a centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di proliferazione dei media (500 mL) per facilitare la placcatura di 7,5 x 10 4 -1,0 x10 5 cellule per pozzetto. Pipettare 500 microlitri sospensione cellulare sulla superficie apicale dell&#39;inserto transwell membrana in policarbonato. Aggiungere 1,5 mL di proliferazione dei media per il comparto basale del transwell. </li><li> Incubare le culture MTEC sommerso a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 95% di aria, 5% di CO 2 per 7-10 giorni. </li><li> Aspettare tre giorni prima di cambiare i media la prima volta. Cambiare i media a giorni alterni. Monitorare le culture mediante ispezione visiva e la misurazione della resistenza delle cellule transepiteliale utilizzando un elettrodo (EVOM Ohmvoltometer, strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL). </li><li> Quando le cellule appaiono confluenti e resistenza epiteliale raggiunge le 1000 Ω / cm 2, le cellule sono pronte per differenziare in ALI. </li><li> Preparare MTEC i media basale contenente il 2% NuSerum. Aggiungi NuSerum medio MTEC base alla concentrazione finale del 2% V / V. Aggiungi Archivi acido retinoico B ad una concentrazione finale di 1 x 10 -7 M prima dell&#39;uso. Preparare fresco e consumare entro 2 giorni. </li><li> Lasciare cellula a differenziarsi per 10-14 giorni, rimuovendo i media apicale e la sostituzione dei media basale con 750 microlitri mezzi MTEC basale contenente il 2% di acido retinoico e Nuserum. Cambiare il supporto basale e lavare la parte apicale con MTEC contenente il 2% NuSerum a giorni alterni. </li></ol> 3. Applicazione di fumo di sigaretta a colture di cellule epiteliali <ol><li> Esporre la parte apicale delle culture transwell al fumo di sigaretta tradizionale utilizzando un sistema a celle CS esposizione (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Vedere la Figura 1 per la fotografia degli apparecchi. Vedere la tabella di reagenti e attrezzature specifiche per le specifiche tecniche. In breve, l&#39;apparato è costituito da una pompa peristaltica che fuma una sigaretta in ~ 7-8 sbuffi, disegno nel fumo tradizionale in una linea di polipropilene che è collegato ad una camera di esposizione ventilata. La camera di esposizione è mantenuta a 37 ° C con circolazione di acqua, e mantenuta a un clima di 5% CO 2 su una linea del gas. Le cellule possono essere esposte al fumo utilizzando Kentucky 3R4F sigarette con filtro di ricerca di riferimento (Il Tabacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY). Tipicamente le cellule sono esposte al fumo 1-2 sigarette, cedendo 100-200 mg / m 3 di materiale particolato totale (TPM). Colture di controllo sono esposti ad aria della stanza per un periodo di esposizione equivalente. </li><li> Il TPM è misurata secondo il protocollo del produttore fornito con il TE10c-macchina fumo (Aziende Teague). In breve, un filtro (Pallflex) viene posto in un supporto in linea in acciaio inossidabile su un tubo di campionamento che porta dal porto di campionamento sulla camera di fumo ad una pompa a portata costante (unità di campionamento). Un tubo di efflusso collega l&#39;unità di campionamento di un contatore del gas (contatore del gas a secco, ONM61, 67, AEM). Il filtro viene pesato prima e dopo il campionamento dei gas. Il materiale totale depositata sul filtro in mg è normalizzata per il volume totale di aria campionata. </li><li> Le cellule possono essere raccolte in qualsiasi momento (ad esempio, 0-24 ore) dopo l&#39;esposizione per le procedure standard di cella analitica (cioè, analisi Western immunoblot, analisi di mRNA, ecc) o microscopia (ad esempio, la microscopia confocale o elettronica). I media cultura può anche essere analizzato per citochine o di rilascio per i test di citotossicità LDH. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Successo isolamento epiteliali, la proliferazione e la differenziazione a ALI dovrebbe produrre un monostrato intatto con una morfologia ciottoli. Resistenza delle cellule Transepithelilal di culture sano dovrebbe essere di circa 1000-2000 Ω / cm 2. La Figura 2 mostra un monostrato di cellule epiteliali respiratorie topo colorate per i marcatori delle cellule epiteliali e le ciglia in condizioni di controllo e dopo l&#39;esposizione fumo di sigaretta. La figura 3 mostra microscopio elettronico rappresentante del sana culture MTEC, raffigurante ultrastruttura e la morfologia ciglia. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Preparazione delle cellule epiteliali procede attraverso tre fasi, una fase di isolamento, una fase di propagazione, e una fase di differenziazione in aria-liquido (schema). Cellule epiteliali sono isolati da topo trachea, seminate su transwells dove proliferano nella cultura sommersa, e quindi convertito in aria-liquido dove si differenziano completamente. Gli esperimenti sono tipicamente condotte il giorno 24 di coltura continua. Il quadro raffigura un sistema modello per l&#39;esposizione di cellule in coltura al fumo di sigaretta tradizionale. Una cultura transwell ALI sistema è collocato all&#39;interno di un sistema modulare personalizzato di consegna fumo di sigaretta, che è controllato per temperatura, umidità e CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 colture di cellule epiteliali sono state fissate e colorate per nuclei (Hoechst 33258), F-actina (verde, Alexa Fluor falloidina-488-coniugate). E l&#39;indicatore di ciglia acetilata α-tubulina (rosso; Cy3 anticorpo secondario coniugato). I pannelli inferiori mostrano immagini equivalenti di cellule epiteliali preso 4 ore dopo l&#39;esposizione al fumo di sigaretta (2 sigarette, 150 mg / m 3). (B) lattato deidrogenasi (LDH) rilascio è stato misurato nel medio basale 24 ore dopo l&#39;esposizione a dosi variabili di fumo di sigaretta come indicato. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Aria-liquido interfaccia culture di cellule epiteliali isolate da epitelio tracheale del mouse differenziarsi in diversi sottotipi che al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) hanno le caratteristiche di ciliate, cellule basali, e non ciliate 1. Queste cellule caratterizzano pseudostratificato dell&#39;epitelio respiratorio. Figura etichette corrispondono a: bb: basale, a: axoneme, m: i mitocondri, n: nucleo, s: substrato (policarbonato membrana), mv: microvili

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo descrive l&#39;isolamento di mouse cellule epiteliali tracheali è adattato dai protocolli di Lei et al., 1, e altri 2-3 con modifiche. Come con qualsiasi isolamento protocollo descrive cellulare, l&#39;aspetto più critico è quello di evitare la contaminazione da batteri patogeni o fungine mediante rigorose tecniche asettiche. Un secondo passo fondamentale è quello di evitare la contaminazione delle culture di fibroblasti, che possono essere evitati mediante dissezione att...

* La macchina fumo di sigaretta è progettato e fabbricato 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;a doppio scomparto e acqua camicia prova di tonalità chiara luce 1 / 2&quot; di spessore in policarbonato Lexan per la camera di esposizione al fumo di sigaretta a temperatura controllata, sensore di livello dell&#39;acqua controllato spegnimento del sistema. Un fumo di sigaretta / sbuffando unità è predisposta per una sigaretta sbuffando variabile tassi. Quando l&#39;unità è in uso, che imita un incubatore, nel senso che la temperatura, l&#39;umidità e l&#39;anidride carbonica sono controllati nel sistema. Il sistema comprende: (I) una misura doppia camera / acqua unità camicia che mantiene un ambiente controllato per gli esperimenti di coltura di tessuti. (II) Un dovere digitale pesante, alto livello di precisione a doppia pompa di circolazione dell&#39;acqua temperatura del sistema con sensore di livello dell&#39;acqua e il controllo della temperatura (III) Un&#39;unità sbuffando fumo di sigaretta con pompa. (IV) Una pompa ciclo sensore di controllo della frequenza cycler (IV) Una precisione in acciaio inox ad alta in-Line portafiltro. (V) Un coperchio rimovibile montato 11 / 2 &quot;dimensione assiale fumo di sigaretta fan uniformità di miscelazione. (VI) Un bagno d&#39;acqua di medie dimensioni con staffa di montaggio per il circolatore d&#39;acqua. (VII) A 1 / 2 &#39;vassoio plexiglas spessore di staffe per il puff pompa e supporto per collettore di cenere di sigaretta. Questa macchina, come descritto può essere sostituito con simili disponibili in commercio macchine fumatori, quali il tipo a disposizione dai sistemi TSE ( <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface

Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido (ALI) come un modello di differenziazione dell&#39;epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per isolare queste cellule e di esporre al fumo di sigaretta mainstream (CS), al fine di studiare le risposte delle cellule epiteliali all&#39;esposizione CS. Il protocollo si compone di tre parti: l&#39;isolamento delle cellule epiteliali delle vie aeree da mouse trachea, la coltura di queste cellule in aria-liquido (ALI) come cellule altamente differenziate epiteliali, e la consegna del tradizionale CS calibrato a queste cellule in coltura. Il sistema di coltura ALI permette la cultura del epiteli delle vie respiratorie, in condizioni che si avvicinano maggiormente a loro ambiente fisiologico rispetto ai sistemi normali coltura liquida. Lo studio delle risposte cellulari e molecolari di esposizione ai polmoni CS è un componente fondamentale di comprendere l&#39;impatto dell&#39;inquinamento atmosferico ambientale sulla salute umana. I risultati della ricerca in questo settore possono in ultima analisi, contribuire alla comprensione della eziologia della malattia polmonare ostruttiva cronica (BPCO), e altre malattie legate al tabacco, che rappresentano gravi problemi di salute globale.

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Le cellule epiteliali polmonari può essere isolato dal tratto respiratorio dei topi e colto in aria-liquido come un modello di differenziazione dell&#39;epitelio respiratorio. Un protocollo è descritto per l&#39;isolamento, la coltura e l&#39;esposizione di queste cellule al fumo di sigaretta tradizionale, al fine di studiare le risposte molecolari di questa tossina ambientale.

Isolamento di mouse cellule epiteliali delle vie respiratorie ed esposizione al fumo di sigaretta Sperimentale interfaccia Air Liquid

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.
Aim
We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage1. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes2-4.
Method
We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 &mu;l of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.
The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (104-105) are much lower than those used in animal models (107)5. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally &gt;10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.
Results
Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes6. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Experimental human pneumococcal carriage offers a natural model of carriage and a potential model for use in vaccine development. This technique is valuable yet complex and involves clinical risk by introducing a pathogen into a human. We have developed a detailed protocol.

Sperimentale trasporto pneumococco umano

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Ricerca

Medicina

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolamento, Crioconservazione e Cultura umani Cellule epiteliali Amnion per le applicazioni cliniche

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Misurazione automatica di enfisema polmonare e piccole vie aeree ritocca in sigaretta Mice-fumo esposti

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

Isolamento e cultura espansione delle cellule endoteliali tumore-specifici

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

Confronto degli effetti di fumo elettronico di sigarette e sigaretta in un romanzo<em&gt; In Vivo</em&gt; Sistema di esposizione

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to gases, particles or complex atmospheres (e.g., cigarette smoke), thus providing realistic physiological exposure of the apical surface of the human alveolar region to air. In contrast to sequential exposure models with linear aerosol guidance, the modular design of the radial flow system meets all requirements for the continuous generation and transport of the test atmosphere to the cells, a homogenous distribution and deposition of the particles and the continuous removal of the atmosphere. This exposure method is primarily designed for the exposure of cells to airborne particles, but can be adapted to the exposure of liquid aerosols and highly toxic and aggressive gases depending on the aerosol generation method and the material of the exposure modules.
Within the framework of a recently completed validation study, this exposure system was proven as a transferable, reproducible and predictive screening method for the qualitative assessment of the acute pulmonary cytotoxicity of airborne particles, thereby potentially reducing or replacing animal experiments that would normally provide this toxicological assessment.

We present a robust, transferable and predictive in vitro exposure system for the screening and monitoring of airborne particles concerning their acute pulmonary cytotoxicity by exposing cultivated human lung cells at the air-liquid interface (ALI).

Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.