Descriviamo un protocollo per la microdissezione e il successivo isolamento dei microfagi residenti cardiaci mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza specificamente dal seno e dal nodo AV nel topo. Con la precisa microdissezione del seno e del nodo V, seguita dalla combinazione di selezione cellulare magnetica e attivata dalla fluorescenza, siamo in grado di isolare specificamente i macrofagi residenti dal seno e dal nodo V ad alta purezza. L'identificazione e l'isolamento di macrofagi residenti cardiaci da regioni distinte del cuore consente di studiare ulteriormente il loro fenotipo e il loro impatto specifico sulla regione sull'elettrofisiologia cardiaca.
Dopo aver isolato il cuore, eseguire le procedure di microdissezione in un piatto di dissezione con PBS ghiacciato una tantum al microscopio da dissezione. Utilizzare punti di riferimento anatomici cardiaci come l'aorta, l'arteria polmonare, il seno coronarico e il ventricolo sinistro o destro per determinare il sinistro-destro e anteriore-posteriore del cuore. Dopo aver determinato l'orientamento, posizionare il cuore con la parte anteriore nella parte inferiore del piatto per esporre le grandi vene posteriori.
Tagliare lungo il solco tra i ventricoli e gli atri per rimuovere la maggior parte dei ventricoli. Mantenere la parte atriale. Fissare il cuore al piatto di dissezione inserendo perni attraverso la parte rimanente della parete libera LV e il LAA.
Tagliare la parete libera RV rimanente verso l'alto attraverso la valvola tricuspide e la vena cava superiore. Capovolgere RA e RV e fissare il RAA per esporre la regione intercale della cavità RA e il setto atriale. Per la microdissezione di SAN, tagliare il cuore lungo il setto interatriale parallelo alla crista terminalis per separare la regione intercavale per ottenere il campione SAN.
Mettere il campione in una provetta di microcentrifuga vuota da 1,5 millilitri su ghiaccio. Per la microdissezione di AVN, fissare le parti rimanenti del cuore attraverso il tessuto adiacente al setto interatriale e al setto interventricolare per affrontare il lato atriale destro del setto interatriale verso l'alto. Guarda l'atrio destro sulla superficie endocardica per il triangolo di Koch che sarà delimitato anteriormente dalla linea della cerniera del foglietto settale della valvola tricuspide e posteriormente dal tendine di Todaro.
L'orifizio del seno coronarico è osservato alla base. Tritare il tessuto SAN e AVN con bisturi. Quindi aggiungere 500 microlitri di tampone di digestione appena preparato a ciascun campione e lavare tutto il tessuto tritato dalla parete del tubo della microcentrifuga.
Pipettare delicatamente per aiutare a digerire il campione e omogeneizzare il tessuto su una macchina a vortice. Dopo la digestione, trasferire la sospensione di tessuto in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri facendola passare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri. Risciacquare il filtro cellulare con altri cinque millilitri di tampone di selezione cellulare per fermare la digestione.
Rimuovere il surnatante. Dopo aver risospeso il pellet cellulare con 90 microlitri di tampone di selezione cellulare, aggiungere 10 microlitri di microsfere CD45 per 10 milioni di cellule totali alla sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Mescolare bene i campioni.
Durante il periodo di incubazione della sospensione cellulare con microsfere e miscela di anticorpi, preparare il set di separazione magnetica collegando la colonna magnetica a un separatore magnetico adatto e quindi posizionando un tubo di raccolta sotto la colonna magnetica. Preparare le colonne magnetiche risciacquando con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare aggiunto nella parte superiore della colonna e consentendo il passaggio del tampone. Applicare immediatamente la sospensione cellulare sulla colonna, evitando bolle d'aria, mentre il buffer di selezione delle celle sta passando.
Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare. Aggiungere un millilitro di buffer di ordinamento delle celle nella colonna. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla su un nuovo tubo di raccolta.
Lavare immediatamente la colonna applicando saldamente lo stantuffo fornito con la colonna per ottenere il flusso continuo contenente le celle marcate magneticamente. Dopo aver applicato il campione non colorato e i tubi di compensazione, regolare le tensioni di ciascun canale per allineare sia i picchi positivi che quelli negativi alla posizione corretta dell'asse. Impostare la strategia di gating come descritto nel manoscritto di testo utilizzando DAPI come indicatore di fattibilità.
Controllare i grafici di citometria a flusso per confermare che la popolazione cellulare di interesse sia correttamente mostrata sui grafici. Raccogliere le celle ordinate in mezzo o buffer in base alla necessità di esperimenti successivi. Per confermare una corretta dissezione, l'identificazione della SAN e dell'AVN è stata effettuata utilizzando immunofluorescenti e colorazione tricromatica di Masson.
La colorazione immunofluorescente delle cellule del sistema di conduzione positiva HCN4 in SAN e AVN, così come la colorazione tricromatica di Masson di SAN e AVN è mostrata qui. La strategia di gating per la selezione cellulare dei macrofagi cardiaci residenti ha aiutato a identificare le cellule mononucleate escludendo i doppietti nell'area di dispersione in avanti dell'asse y rispetto a quella dell'asse x. Le cellule morte sono state escluse dal DAPI.
Le cellule vive sono state impiegate per i leucociti CD45 positivi, quindi per le cellule mieloidi CD11b positive. I macrofagi cardiaci sono stati identificati dall'espressione sia di F4/80 che di CD64, quindi stratificati dall'espressione dell'antigene sei dei linfociti. Le cellule appena selezionate sono state osservate al microscopio a campo chiaro.
Le cellule erano positive per CD45 quando osservate sotto il canale PE del fluoroforo. Quando osservata sotto fluoroforo APC dimensione sette canali, la stessa vista delle cellule ordinate ha mostrato cellule CD11b positive. Il fluoroforo PE a sette canali è stato utilizzato per identificare il fenotipo F4/80 positivo.
E le cellule triple positive sono state identificate come macrofagi residenti cardiaci. I macrofagi cardiaci isolati coltivati in terreno per un massimo di sei giorni sono indicati con frecce bianche, mentre le frecce nere indicano cellule morte. I macrofagi ordinati possono essere utilizzati per ulteriori studi funzionali come esperimenti di patch clamp o studi di espressione come il sequenziamento dell'RNA o studi proteomici.
