Esprimiamo apprezzamento per Woo-Jin Chang per fornire i canali trifurcating per DEP attuazione e di Mitchell Collens per la sua assistenza nella configurazione del dispositivo. Il lavoro è stato sostenuto dagli Stati Uniti attraverso la concessione OISE NSF-0951647 e da Taiwan NSC attraverso Concessione 99-2911-1-002-007.

Uno schema generale della installazione delle attrezzature è mostrato nella Figura 1A. Il PCB-campione di assemblaggio è ulteriormente dettagliato in una sezione trasversale schematica in Figura 1B. 1. Preparazione di elettrodi PCB: <ol><li> PCB Design elettrodi alla geometria desiderata per generare una non uniforme campo elettrico. Personalizzati chip elettrodo PCB possono essere ordinati attraverso impianti di fabbricazione commerciale (Figura 1C). </li><li> Preparare prefabbricati PCB elettrodi per saldatura 16-gauge filo fino alla fine di ciascun elettrodo metallico stampato (Figura 1D). <ol><li> Posizionare il filo sull&#39;estremità dell&#39;elettrodo. Tenere il filo in posizione sulla superficie metallica del PCB con il saldatore per scaldare il filo. </li><li> Alimentare una piccola quantità di saldatura in filo riscaldato per riempire il filo di saldatura. </li><li> Dopo che il filo è pieno di saldatura, rimuovere il saldatore, tenendo il filo in posizione durante la saldatura si raffredda. </li></ol></li><li> Ripetere il processo di saldatura per ogni connessione elettrica sul PCB (Figura 1D). </li></ol> 2. Preparare Canali Microfluidic: <ol><li> Polidimetilsilossano canali microfluidica (PDMS)-base sono preparati utilizzando l&#39;elastomero PDMS, Sylgard 184 di Dow Corning. Uno stampo master che definisce i canali di solito è creato attraverso processi di microfabbricazione standard con un wafer di silicio e SU-8 photoresist. </li><li> Mix composto base e catalizzatore in un rapporto di 10:1 per 5 minuti. </li><li> Versate il liquido PDMS sul SU-8 prefabbricati stampo master e rimuovere le bolle d&#39;aria esponendo liquido PDMS a vuoto per qualche minuto. Ripetere il processo di vuoto, se necessario, per rimuovere completamente tutte le bolle. </li><li> Curare il PDMS a 70 ° C per 2 ore. </li><li> Rimuovere lastra PDMS con canali microfluidica dal wafer con una lametta, attenzione a non rompere wafer. </li><li> Dei buchi per l&#39;introduzione di liquidi e le cellule nel dispositivo microfluidica. (Nota: Siringa di pompaggio, gravità o di tensione superficiale del flusso base possono essere utilizzati con DEP). </li><li> Ispezionare il dispositivo a microfluidi per assicurarsi che sia privo di polvere e detriti. Pulizia del PDMS può essere facilmente realizzato utilizzando 3M Scotch Magic Tape. </li><li> Plasma il legame PDMS canali microfluidica per un ambiente pulito No.0 spessore (80-130 micron) coprioggetto. Riscaldare il coprioggetto-microfluidico montaggio a 100 ° C per un minimo di 15 min. </li></ol> 3. Preparare bassa conducibilità Media: <ol><li> Bassa conducibilità media è preparata mescolando 8,5% di saccarosio + glucosio 0,3% (w / v) in acqua deionizzata (DI) 1. Nota:. Abbiamo già dimostrato che le cellule possono essere coltivate per giorni sui media tradizionali di coltura cellulare dopo essere stato esposto a bassa conducibilità per brevi periodi (circa 30 min) 11 </li></ol> 4. Montare Canali Microfluidic Onto Elettrodi PCB: <ol><li> Mettete una piccola quantità (circa 10 mL) di olio minerale sul PCB per garantire un contatto stretto tra il PCB e il coprioggetto. Nota: Un passo opzionale per ridurre la visualizzazione elettrodo è per rivestire la superficie del circuito stampato con uno strato molto sottile di pennarello indelebile nero o vernice. </li><li> Posizionare il coprioggetto-microfluidico assemblaggio canale sul PCB oliato, con contatto coprioggetto formando con l&#39;olio (coprioggetto in basso). Premere delicatamente il copri-microfluidica montaggio che garantiscano un buon contatto e di ridurre al minimo le bolle d&#39;aria che possono compromettere la visualizzazione delle cellule e tallone. Un esempio di dispositivo completato è mostrato nella Figura 1D. </li></ol> 5. Ordinare e concentrato Perline e cellule utilizzando DEP: <ol><li> Riempire i canali microfluidica con acqua deionizzata o bassa conducibilità media, il processo di incollaggio plasma facilita il facile caricamento di soluzioni acquose nei canali microfluidici temporaneamente per rendere la superficie idrofoba normalmente PDMS idrofilo. </li><li> Introdurre cellule e / o perle di polistirene nel serbatoio canale (Figura 1C). Qui usiamo l&#39;adenocarcinoma del colon umano (HT-29) le cellule. </li><li> Collegare l&#39;uscita di un generatore di funzioni per l&#39;ingresso di un amplificatore di rete e poi collegare l&#39;uscita dell&#39;amplificatore per i fili degli elettrodi. Coprire tutti i fili elettrici e le superfici della configurazione con del nastro isolante per proteggere gli utenti dalla potenziale esposizione agli urti. Un diagramma schematico della configurazione apparecchiatura è mostrato nella Figura 1A. </li><li> Impostare il generatore di funzioni per produrre un output a onda sinusoidale pari a 1,0-1,5 Mhz. L&#39;ampiezza della produzione deve essere regolata per l&#39;amplificatore di potenza RF di produrre una potenza di 80-100V al PCB. L&#39;amplificatore di potenza RF in questo lavoro richiede una tensione di ingresso intorno 220-330 mV. Di separare le cellule e perline, il tasso di flusso laminare devono essere conformi con la forza DEP per spostare le cellule e perline all&#39;interno del canale principale (larghezza w = 100 micron, altezza h = 27 micron) nei canali di destinazione (larghezza w = 100 micron , altezza h = 27 micron). Attenzione: consultare con il produttore di PCB per determinare la mtensioni di funzionamento aximum per evitare problemi come il surriscaldamento PCB o di fusione. Controllare le specifiche dei costruttori di apparecchiature &#39;per il generatore di funzioni e produttori di amplificatori di potenza per stabilire le impostazioni di funzionamento sicuro. </li><li> Avviare DEP alle cellule ordinare e perline. Cellule esperienza positiva-DEP mentre perle di polistirene esperienza negativa-DEP in modo non uniforme campo elettrico all&#39;interno delle frequenze specificato. Ciò consente DEP-force-attivati ​​bioactuation e separazione di cellule e di altre particelle all&#39;interno di dispositivi microfluidici utilizzando PCB accessibile e riutilizzabile come elettrodi. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Quando DEP è efficace a cellule di azionamento o di particelle, un allineamento robusto all&#39;interno dei campi elettrici non uniformi si osserva per i bagni statici o velocità del fluido lento. In condizioni di velocità del fluido superiore, il comportamento delle cellule o di particelle dipende dall&#39;orientamento relativo del flusso assiale al campo elettrico e la velocità del flusso. Inoltre, i comportamenti delle cellule e particelle dipendono anche l&#39;intensità di campo elettrico e il grado di non uniformità all&#39;interno del campo elettrico. Comportamenti tipici di cellule o particelle includono &#39;catene di perla,&#39; bicicletta, stallo o di svolta. Condizioni che compromettono o abolire DEP comprendono la presenza di sali o di altre molecole nel liquido ionico, debole intensità del campo elettrico, velocità di flusso eccessivo, coprioggetto che sono troppo spesse, o soluzioni conduttivo tra il coprioggetti e gli elettrodi PCB (ad esempio un coprioggetto incrinato può indurre la miscelazione di acqua e olio minerale). Qui, quando si usa No.0 coprioggetto spessore (80-130 micron) e un elettrodo di distanza (231 micron), la pendenza del quadrato dell&#39;intensità del campo elettrico applicato alle cellule HT-29 e perline è stimata essere tra 2 -8 a 6 -8 V 2 / 3 micron 1. La forza DEP può essere stimata misurando la velocità della particella, manipolato da DEP in un fluido statico (Figura 2A-B). A causa della bassa inerzia della particella e l&#39;ambiente altamente viscosi del canale microfluidica, la forza di resistenza idrodinamica sarà uguale a, ma in direzione opposta con la forza DEP. La velocità media tallone nella bassa conducibilità media è 34,5 micron / s con una tensione di 93 Vpp DEP e 1,5 Mhz. La forza di resistenza idrodinamica può essere calcolato con la seguente formula 1. F = trascinare 6πηRv La media viscosità η della bassa conducibilità media a 20 ° C è 1,27 mPa • s e il raggio R tallone è di 7,5 micron. La forza di resistenza idrodinamica per la microbead polistirolo è stimato in 6,19 pN. Per dimostrare la capacità di azionare perline all&#39;interno dei canali microfluidica (Figura 2C-F), abbiamo iniziato il flusso dei mezzi di comunicazione a bassa conducibilità con l&#39;impiego della tensione superficiale del flusso mediata. La velocità media tallone nel canale d&#39;ingresso singolo è stato 1.540 micron / sec, mentre la velocità media all&#39;interno dei singoli canali è stata ridotta a 565 micron / sec (Figura 2C). Avviando DEP, le perle sono state mantenute all&#39;interno del canale centrale invece di essere rilasciato nel canale laterale. Così, in queste condizioni, le forze DEP sono stati sufficienti per superare la forza di resistenza del fluido nei due canali laterali. Lo stesso principio è stato utilizzato anche per deviare le perle dal cannel centrale di un canale laterale singolo semplicemente cambiando l&#39;orientamento dei canali e il flusso tallone a quella degli elettrodi DEP (Figura 2E-F). Da pesca l&#39;elettrodo metallico sul lato del canale di ingresso singolo, quando DEP è stato avviato, le perle sono stati guidati a lato del canale, come le perline avvicinato ad un punto triforcazione. Qui, le forze DEP sono stati sufficienti per tirare le palline in uno dei canali laterali dove il flusso laminare continuato a spingere giù il canale (Figura 2F). Poiché le cellule e di perle di polistirene sono notevoli differenze nella loro capacità di essere polarizzata e azionato in campi elettrici non uniformi, si usa DEP per dimostrare la capacità di eseguire on-chip di separazione delle cellule e perline, contemporaneamente. Abbiamo utilizzato la stessa struttura del canale microfluidica ed elettrodi PCB come configurato nella Figura 2E-F, ma ha introdotto una sospensione di cellule HT-29 e perline in condizioni di scarsa conduttività dei media nel canale d&#39;ingresso singolo (Figura 3). Quando DEP è introdotto, e in queste condizioni, l&#39;HT-29 cellule sono state conservate nei due canali di uscita a sinistra, mentre le perle sono state mantenute nel canale di uscita individuale sulla destra. Qui le cellule mostrano il comportamento di un caratteristico &#39;perla-chaining&#39; come sono raccolti nel canale di uscita a sinistra. Occasionalmente un cordolo e la cella si attaccano insieme in cui sono raccolti insieme, spesso in canali di uscita della cellula. Da questo esperimentoAl dati, determinare il tasso di smistamento da 713 particelle (cellule e perline) al minuto, o l&#39;equivalente di 14.260 cellule e perline in 20 minuti. Il numero di cellule e perline recuperate è rilevante e utile per la biologia molecolare, imaging, biochimici e lab-on-a-chip. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. PCB a base di DEP di cellule e particelle nei canali microfluidica. (A) L&#39;impostazione attrezzature per Protezione esecuzione programmi a base di actuation inizia con un generatore di funzioni per definire la frequenza e l&#39;ampiezza del segnale elettrico, poi un amplificatore di potenza per aumentare la potenza del segnale della campo elettrico generato sul PCB. (B) L&#39;assemblea dispositivo a microfluidi per l&#39;azionamento del campione è costituito da PDMS canali microfluidica irreversibilmente legato a un no. 0 spessore coprioggetto (80-130 micron) attraverso plasma di ossigeno, non conduttivi per fare il bagno delle cellule e / o perline. (C) Gli elettrodi PCB usati qui sono composti da due regioni in cui sono interdigitati gli elettrodi per generare una forte non uniforme campo elettrico. (D) Il dispositivo completato: un PCB con un dispositivo suddivise ancora microfluidi su un unico vetrino, inserto mostra tutto il dispositivo con i fili degli elettrodi. (CD) Per le dimensioni, le misure PCB sono 8.4 cm (l), 2.1 cm (w), con 5 mm di larghezza elettrodi. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Immagini rappresentative delle cellule e perline nei canali prima e durante la DEP attuazione. (A) 15 perle di polistirene micron fluorescente in una soluzione a bassa conducibilità-media all&#39;interno di un canale microfluidica PDMS, senza flusso laminare (tempo trascorso, 1.23 sec). (B) Al momento della DEP iniziazione, le perle migrare verso modelli di elettrodi del PCB (strisce nere), piuttosto che tra gli elettrodi (tempo trascorso, 8,18 sec). (C) Perle nei canali stessi sotto flusso laminare sono divisi tra i tre canali separati (tempo trascorso, 5.3 sec), quando il DEP è iniziato (D), le perle vengono azionati a fluire solo nel canale centrale (tempo trascorso, 4.3 sec). (E) Cambiando l&#39;orientamento dei canali agli elettrodi PCB, sfere possono essere dirette in modo differenziale nei canali laterali (F) con DEP, piuttosto che il canale centrale come mostrato in (D). (EF) Tempo trascorso è 8.23 ​​sec e 5.16 sec, rispettivamente. Tutte le barre di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Immagini rappresentative delle cellule e perline nei canali prima e durante la DEP attuazione. (AB) Prima di iniziare il DEP, una soluzione mista di adenocarcinoma del colon umano (HT-29) le cellule e il flusso di perle da un canale a 3 canali di uscita separati. La freccia aperta indica la direzione del flusso laminare e canali sono delineati con linee tratteggiate per l&#39;orientamento e chiarimenti. (CD) Con DEP inducendo, perline e selettivamente le cellule sono azionati in canali separati individuate. HT-29 cellule uscire dal canale centrale e di sinistra, mentre perle di uscire dal canale destro. Concatenamento perla caratteristica di perline e cellule si osserva durante la Protezione esecuzione programmi di attuazione. (A, C) Interferenza di imaging differenziale di contrasto di cellule e perline in microcanali rende le perle facilmente visibile. Glow immagini intensità di scala (B, D) delle immagini stesse DIC (A, C) migliorare la visualizzazione delle cellule nei canali. Gli elettrodi di metallo riflettente ((A, C) striscia di luce e (B, D), giallo e verde) forniscono un punto di riferimento importante per l&#39;allineamento microcanali agli elettrodi per una efficace funzionalità Protezione esecuzione programmi a base di attuazione. Barre di scala = 100 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Manipolazione cellulare a dispositivi microfluidici è auspicabile per l&#39;ordinamento o il posizionamento selettivo di singole cellule o per studi di popolazione. 2 a flusso laminare viene utilizzato in combinazione con valvole e pompe di manipolare le cellule all&#39;interno di dispositivi microfluidici. Tuttavia, questi metodi da soli sono impegnativi e richiedono processi di fabbricazione dettagliato e abilità 3 centrifugazione può semplificare le richieste per il posizionamento delle cellule, ma di immagini simultanee è una sfida;. Inoltre, l&#39;architettura canale per centrifugazione deve essere considerato con attenzione nella progettazione del manipolazioni desiderato e considerando gli effetti di forze centripete. 4 pinzette laser può essere utilizzato per il posizionamento delle cellule, ma il metodo è costoso e non suscettibili di high-throughput separazione delle cellule. 5 Eppure, la DEP ha dimostrato come un efficace sistema di &quot;pinzette elettriche&quot; per il posizionamento efficace delle cellule, la caratterizzazione e la manipolazione. 6,7 In particolare, DEP è stato utilizzato per catturare selettivamente le cellule e ordinare on-chip per l&#39;elaborazione di vivere e di cellule morte, 7-10 e per la raccolta di cellule su sensori di risonanza per la misura della massa cellulare. 11 Abbiamo precedentemente dimostrato che aumentando la DEP vigore batteri o perline di sopra della forza di resistenza fluidico, l&#39;on-chip concentrazione e la cattura di perle di polistirene e Listeria monocytogenes V7 può essere realizzato. 12 popolazioni miste di E. coli e L. batteri monocytogenes può anche essere diretto e rilasciato attraverso impulsi DEP. Inoltre, le particelle più grandi possono essere catturati in modo differenziato e concentrato sugli elettrodi in base alle dimensioni delle particelle di grandi dimensioni, mentre le particelle più piccole non sono di cattura, ma vengono rimossi con il flusso fluido. 13 Quando le forze di Protezione esecuzione programmi non superano le forze fluidico trascinando le particelle, il tallone o cella non viene catturato, ma piuttosto spostato all&#39;interno del flusso fluido. Come mostrato nella Figura 2C, sfere possono essere concentrati nella regione centrale del flusso di liquido sufficiente a mantenere le perline nel canale centrale. Questo potrebbe essere dovuto all&#39;effetto combinato di particelle a particelle influenze all&#39;interno del campo elettrico, velocità del fluido superiore DEP forze trascinamento, la combinazione di questi, o qualche altro effetto indefinito. Più recenti progressi nella DEP contactless permettono di massimizzare la cattura e la manipolazione delle cellule con il campo minimo richiesto, proteggendo così i tipi di cellule, nella maggior misura, durante la manipolazione DEP. 1,9 contatto promessa DEP offre alla comunità microfluidica per l&#39;ordinamento, la raccolta e il posizionamento delle cellule all&#39;interno di dispositivi microfluidici. Ci aspettiamo che con l&#39;aumento della domanda per, l&#39;attuazione, il DEP per la manipolazione all&#39;interno di dispositivi microfluidici, ulteriori scoperte e innovazioni espandere la comprensione e l&#39;influenza delle forze DEP. PCB può essere prodotto attraverso processi ad alto volume ad un prezzo accessibile, con un tempo di risposta rapido di fabbricazione, che li rende buoni piattaforme per la commercializzazione. Inoltre, i PCB sono facili da usare e accessibile per gli scienziati in una vasta gamma di discipline per le on-chip manipolazioni delle cellule e l&#39;ordinamento. Nel progettare la superficie degli elettrodi PCB, occorre tenere in considerazione nella posizione desiderata particella / cellula traiettoria. I fattori chiave per l&#39;esame includono la dimensione delle particelle e tipo (perline e / o cellulare), tipo di cellula, la dimensione a microcanali, velocità di flusso, distanza tra gli elettrodi (che determina l&#39;intensità di campo elettrico), spessore coprioggetto, e la conduttività dei fluidi. Questi fattori influenzano la forza necessaria e disponibile per manipolare la particella o cellula, e in ultima analisi, l&#39;efficienza di separazione. Il nostro protocollo presentato qui dimostra una configurazione efficace per l&#39;avvio di Protezione esecuzione programmi per microsfere e la separazione delle cellule. Per potenziali applicazioni, gli utenti dovrebbero corrispondere l&#39;architettura del disegno canale microfluidica con i percorsi di flusso desiderato per le cellule e perline, così come i modelli di elettrodi per ottimizzare l&#39;efficienza per ogni applicazione. Distanza tra gli elettrodi e lo spessore coprioggetto può essere utilizzato secondo le linee guida precedentemente riportati durante la progettazione del layout microfluidica canale 1. La conducibilità e la permettività della cellula / particella e dei media circostante deve essere abbastanza differenti da facilitare DEP positivo o negativo, pur mantenendo intatte le cellule. La polarità di Protezione esecuzione programmi per una particella sferica può essere determinato dalla parte reale di un valore complesso delle seguenti Clausius-Mosotti fattore alla frequenza ω della tensione DEP. <img src="/files/ftp_upload/2545/2545eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> Equazione 1 In questa equazione ε, è permittività, σ è la conducibilità, e ε * è permettività complessa. Gli indici p e mdenotano la particella e dei media, rispettivamente. Quando una cellula ha una permittività superiore alla media, o la parte reale del Clausius-Mosotti diventa fattore positivo, la particella diventa più polarizzato rispetto ai media circostante. A causa di una non uniforme campo elettrico, la polarizzazione della particella diventa non uniforme e questo crea un DEP positivo (+ DEP) forza che trae la cellula verso la regione con maggiore intensità del campo elettrico. Se una cellula ha una permittività inferiore a quella media circostante, o la parte reale del Clausius-Mosotti fattore diventa negativo, subirà DEP negativo (-DEP), e la cellula è costretta verso la regione di campo minima. Se la cella e dei media hanno circa la permittività stesso complesso, nessuna forza può essere generata per manipolare le cellule. Per questo motivo, l&#39;acqua pura è un supporto preferito per la manipolazione di particelle DEP. Tuttavia, per evitare lo stress osmotico sulla cella da acqua pura, media bassa conducibilità è stato formulato per mantenere inalterata la conducibilità, ma per aumentare osmolarità per diminuire lo stress osmotico alle cellule. Tradizionali terreni di coltura cellulare o tamponi fisiologici, come DMEM o PBS, hanno alta conducibilità, che non è adatto per la manipolazione DEP. Abbiamo anche precedentemente dimostrato che le cellule possono essere catturati su sensori con DEP con bassa conducibilità media. Dopo un breve periodo per l&#39;attacco delle cellule, i media bassa conducibilità può essere sostituito per il supporto richiesto colture cellulari a supportare la crescita delle cellule per giorni 11. Dalla nostra esperienza, perline fluorescenti sono molto luminose rispetto alla fluorescenza delle cellule vive, quindi può essere una sfida per abbinare l&#39;intensità tallone per l&#39;intensità di una cellula vivente e fluorescenti. Per migliorare la visualizzazione di entrambe le celle e le perline, abbiamo usato la microscopia DIC un microscopio verticale per l&#39;imaging entrambi. Per visualizzare le celle e perline, abbiamo presentato i dati in un&#39;immagine intensità luce scala, che conserva i dati in un ampio spettro di colori per facilitare la visione. Così, quando si progetta lo studio di interesse, i parametri di imaging e le risorse devono essere considerati. In sintesi, abbiamo dimostrato la possibilità di azionare perline e selettivamente le cellule in canali separati con DEP. Con l&#39;utilità sempre maggiore di canali microfluidica per la biologia cellulare, biochimica e le applicazioni della bioingegneria, DEP è un&#39;opzione auspicabile per la raccolta delle cellule, il posizionamento e l&#39;ordinamento. La fabbricazione PCB elettrodi è economico e conveniente, gli elettrodi sono facili da usare, ei tempi di realizzazione rapidi sono ideali per l&#39;attuazione del DEP.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sylgard 184 kit (PDMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Elsworth Adhesives</td>
<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
<td>Dow Corning Sylgard</td>
</tr>
<tr>
<td>16 awg hook-up wire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Belden</td>
<td>8521</td>
<td>(Type MW) Mil-W-76C-PVC</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold seal Cover Glass </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>260320</td>
<td>No. 0 thick, 24 x 60 mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Miltex Biopsy Punch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR Scientific</td>
<td>95039-104</td>
<td>Miltex, assorted sizes</td>
</tr>
<tr>
<td>Custom PCB electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bay Area Circuits </td>
<td>Custom parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific </td>
<td>O121-1 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deionized water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>House DI water supply</td>
<td>None</td>
<td>Use filtered DI water</td>
</tr>
<tr>
<td>D-Glucose Anhydrous Granular AR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mallinckrodt Chemicals </td>
<td>4912-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose, Crystal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Mallinckrodt Chemicals</td>
<td>8360-06 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent polymer microspheres </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Bangs Laboratories</td>
<td> FS07F/9277</td>
<td>15&mu;m Dragon green microspheres</td>
</tr>
<tr>
<td>HT-29 cell line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>HTB-38D</td>
<td>Human colon adenocarcinoma</td>
</tr>
<tr>
<td>Typsin 0.05% EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>25300054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eclipse E600FN upright microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Nikon</td>
<td>Eclipse E600FN </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phantom V310 High-speed imaging camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Phantom</td>
<td> V310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BX51 upright research microscope </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus </td>
<td>BX51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpotFlex high resolution color camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diagnostic Instruments </td>
<td>FX1520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Function generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent </td>
<td>3325A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RF Power amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EIN</td>
<td>2100L</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

separating beads and cells in multi-channel microfluidic devices using dielectrophoresis and laminar flow

Dispositivi microfluidici hanno avanzato studi sulle cellule, fornendo un ambiente dinamico fluidico sulla scala della cellula per lo studio, manipolazione, selezione e conteggio delle cellule. Tuttavia, la manipolazione della cella all&#39;interno del dominio fluidico rimane una sfida e richiede protocolli di fabbricazione complicato per le valvole di formazione ed elettrodi, o richieste attrezzature speciali come pinzette ottiche. Qui, abbiamo dimostrato che convenzionali circuiti stampati (PCB) possono essere utilizzati per la non-contatto manipolazione di cellule utilizzando dielettroforesi (DEP) per la manipolazione delle cellule tallone e in campi a flusso laminare per bioactuation, e per la separazione delle cellule e perline in microfluidica multicanale dispositivi. In primo luogo, vi presentiamo il protocollo per il montaggio degli elettrodi DEP e dispositivi microfluidici, e preparare le cellule per DEP. Poi, ci caratterizzano l&#39;operazione DEP con perle di polistirene. Infine, mostriamo i risultati rappresentante della separazione tallone e cellulare in un dispositivo multicanale microfluidica. In sintesi, DEP è un metodo efficace per la manipolazione di particelle (granuli o cellule) all&#39;interno di dispositivi microfluidici.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Dielettroforesi (DEP) è un metodo efficace per manipolare le cellule. Circuiti stampati (PCB) in grado di fornire elettrodi economico, riutilizzabile ed efficace per il contatto senza manipolazione cellulare all&#39;interno di dispositivi microfluidici. Grazie alla combinazione di canali microfluidica PDMS-based con coprioggetto sul PCB, dimostriamo la manipolazione tallone e cellulare e di separazione all&#39;interno multicanale dispositivi microfluidici.

Perle di separazione e celle a multi-canale dispositivi Microfluidic Utilizzando dielettroforesi e flusso laminare

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

separating-beads-cells-multi-channel-microfluidic-devices-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

27.3K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Dielettroforesi (DEP) è un metodo efficace per manipolare le cellule. Circuiti stampati (PCB) in grado di fornire elettrodi economico, riutilizzabile ed efficace per il contatto senza manipolazione cellulare all'interno di dispositivi microfluidici. Grazie alla combinazione di canali microfluidica PDMS-based con coprioggetto sul PCB, dimostriamo la manipolazione tallone e cellulare e di separazione all'interno multicanale dispositivi microfluidici.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Ricerca

Bioingegneria

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Layer-by-layer collagene Deposizione nel Microfluidic Dispositivi per microtessuto Stabilizzazione

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

Multi-step altezza variabile fotolitografia per Valvolati multistrato microfluidici Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabbricazione di dispositivi microfluidici basati su carta tridimensionale per gli immunodosaggi

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsilossano-policarbonato dispositivi microfluidici per Cell Migration Studies Sotto perpendicolare chimica e gradienti di ossigeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Sviluppo di dispositivi microfluidici per studiare la capacità di allungamento di punta-coltivazione di cellule vegetali in spazi estremamente ridotti

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...