This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

<ol>
	<li>Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+cell+separation+and+sorting+in+microfluidic+systems.">Label free cell separation and sorting in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).</li><li>Lenshof, A., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+separation+of+cells+and+particles+in+microfluidic+systems.">Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems.</a> Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).</li><li>Sajeesh, P., Sen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+separation+and+sorting+in+microfluidic+devices+a+review.">Particle separation and sorting in microfluidic devices a review.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).</li><li>Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+cell+separation.">Microfluidics for cell separation.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).</li><li>McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+lateral+displacement+for+particle+separation+a+review.">Deterministic lateral displacement for particle separation a review.</a> Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).</li><li>Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+bioparticles+in+microdevices+A+review.">Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review.</a> ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).</li><li>Jin, C., McFaul, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+label+free+separation+of+circulating+tumor+cells+from+historical+foundations+to+recent+developments.">Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 32 (2014).</li><li>Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa C&#225;novas, G., Knoerzer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+suspensions+and+emulsions+via+ultrasonic+standing+waves+&#8211;+A+review.">Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves &#8211; A review.</a> Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).</li><li>Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microfluidics+in+waterborne+pathogen+monitoring+A+review.">Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review.</a> Water Research. 55, 256-271 (2014).</li><li>Mariella Jr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection.">Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).</li><li>Gor&#8217;kov, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustic+field+in+an+ideal+fluid.">On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid.</a> Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).</li><li>Settnes, M., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustical+field+in+a+viscous+fluid.">Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid.</a> Physical Review E. 85 (1), 016327 (2012).</li><li>Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+radiation+and+streaming-induced+microparticle+velocities+determined+by+microparticle+image+velocimetry+in+an+ultrasound+symmetry+plane.">Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane.</a> Physical Review E. 86 (5), (2012).</li><li>Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+7+The+acoustic+radiation+force+on+small+particles.">Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles.</a> Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).</li><li>Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+focusing+with+engineered+node+locations+for+high+performance+microfluidic+particle+separation.">Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation.</a> Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).</li><li>Fong, E. J., Bora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+Variable+Node+Position+in+a+High+Throughput+Acoustofluidic+Device.">Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device.</a> Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).</li><li>Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+tuning+of+acoustofluidic+pressure+nodes+by+altering+net+sonic+velocity+enables+high-throughput+efficient+cell+sorting.">Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting.</a> Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).</li><li>Franssila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Reactive+Ion+Etching.">Deep Reactive Ion Etching.</a> Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).</li><li>Sharma Rao, B., Hashim, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Photomask+Design+Using+CAD+Software+for+Application+in+Lab+On+Chip+Biomedical+Nanodiagnostics.">Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics.</a> Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Large+Scale+Integration+The+Evolution+of+Design+Rules+for+Biological+Automation.">Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).</li><li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. , (2002).</li><li>Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+based+packaging+platform+for+hybrid+microfluidic+systems.">Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems.</a> Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).</li><li>Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+specific+flow+control+in+microfluidic+circuits+with+passive+elastomeric+features.">Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features.</a> Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).</li><li>Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+pressure+driven+microfluidic+networks+using+electric+circuit+analogy.">Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).</li><li>Mittelbrunn, M., Guti&#233;rrez V&#225;zquez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA+loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen+presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282 (2011).</li><li>Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+entry+of+dengue+virus+into+Aedes+albopictus+mosquito+cells+is+dependent+on+clathrin+mediated+endocytosis.">Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis.</a> Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).</li><li>Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Characterization+and+In+Vitro+Culture+of+Highly+Divergent+Arenaviruses+from+Boa+Constrictors+and+Annulated+Tree+Boas+Candidate+Etiological+Agents+for+Snake+Inclusion+Body+Disease.">Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease.</a> 3 (4), e00180 12 (2012).</li><li>Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+Evaluation+of+Fast+Microfluidic+Thermal+Lysis+of+Bacteria+for+Diagnostic+Sample+Preparation.">Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation.</a> Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).</li><li>Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+move+to+microfluidics+for+protein+analysis.">Why the move to microfluidics for protein analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo protocollo presenta l&#39;integrazione a livello di sistema di dispositivi microfluidici per attrezzature macroscala per eseguire l&#39;elaborazione automatizzata campione biologico. La modularità di questa piattaforma permette di essere adattabile a qualsiasi dispositivo flusso continuo, e, come esempio, il protocollo presentato concentra sulla caratterizzazione e ottimizzare le prestazioni di un dispositivo di separazione delle particelle acoustofluidic. Tre grandi vantaggi di questo protocollo sono evidenziati: (i) la modularità e chip-to-mondo interfacciamento, (ii) caratterizzazione affidabile di prestazioni del dispositivo, e (iii) il trattamento automatizzato dei volumi di campione precisamente misurate per la separazione di particelle. io. Modularità e chip-to-mondo interfacciamento Come mostrato in Figura 2, il chip microfluidico è montato su una basetta per misura facilmente su un palco microscopio per l&#39;osservazione diretta. Il tagliere contiene # 6-40 fori filettati UNF su una griglia di 5 mm a passo, enabling il chip da fissare, e le connessioni del fluido da effettuare. Le connessioni del fluido sono PEEK tubi con estremità lavorate, che tenuta contro il chip fluidico con una gomma faccia guarnizione di tenuta e un collare di acciaio inossidabile. Questo schema interfaccia rende per una facile sostituzione di chip e rapida riprogettazione dispositivo, che richiedono poche o nessuna modifica al altri componenti del sistema, impronte di chip forniti conformi al formato griglia. Ad esempio, abbiamo utilizzato questa piattaforma con chip microfluidici per elettroforesi a flusso continuo, lisi cellulare termico, 29 rapida miscelazione di reagenti per la sintesi chimica, e la cattura cella singola e interrogatori. ii. Caratterizzazione robusta di prestazioni del dispositivo Per ottimizzare le prestazioni di qualsiasi dispositivo di separazione microfluidi, il suo funzionamento deve prima essere accuratamente caratterizzata. Il sistema qui descritto supporta lo sviluppo di protocolli rapidi e automatici per farlo. Per il examp specificale di dispositivi acustici di messa a fuoco, la qualità di messa a fuoco, la frequenza di funzionamento, e la posizione delle particelle focalizzate nel canale microfluidica deve essere misurato per ogni singolo dispositivo. Queste misure richiedono spazzare attraverso una gamma di frequenze di trasmissione piezoceramico, tensioni e portate, per identificare le combinazioni ottimali dei parametri per la separazione di alta qualità. Il protocollo presentato varia automaticamente questi parametri sintonizzabili e cattura pertinente Data-ie, immagini fluorescenti di particelle che scorre nel canale che sono post-elaborati per generare le misure delle particelle richiesti focalizzazione qualità, frequenza, e la posizione (figura 3). Caratterizzazione completa delle prestazioni del dispositivo acustico richiede passaggi ripetuti 4.4 e 4.5, se necessario in diverse condizioni sperimentali. Ad esempio, la posizione di messa a fuoco assoluta di un chip è trovato eseguendo la scansione di frequenza a portate relativamente bassa e alta tensiones per garantire una completa migrazione alla posizione di nodo. Inoltre, tali scansioni frequenza possono valutare la qualità del montaggio del dispositivo (quando eseguito con perle di polistirene di dimensioni note), o per determinare come un tipo di particelle precedentemente sconosciuta si comporterà nel sistema (dopo un chip è stato caratterizzato con perline). Un chip con buon trasferimento di energia dal piezoceramico al canale microfluidico comporterà stretto focalizzazione a portate elevate (&gt; 1 ml / min) e bassa tensione (12-15 V pp), mentre quelli con scarso trasferimento di energia non si concentrerà anche a basse portate (&lt;100 l / min) e tensioni elevate (&gt; 20 V pp). Abbiamo scoperto che il contatto intimo tra il chip microfluidica e piezoceramico è fondamentale per un efficiente trasferimento di energia nel fluido. Ulteriori analisi del metodo ottimale incollaggio del chip microfluidico e piezoceramico consentirà produzione affidabile di dispositivi ad alte prestazioni. Infine, un completoimmagine di funzionamento di un dispositivo acoustophoretic può essere ottenuto combinando le misurazioni di scansione di frequenza basati su immagini di Fase 4 (e figura 3) con numeri di particelle raccolte dalla SPO e LPO come funzioni dei parametri operativi relativi, da esperimenti di separazione effettuate con microsfere , come descritto nel passaggio 5. Come mostrato in figura 6, una tale serie di esperimenti automatizzate può rapidamente caratterizzare le prestazioni di un singolo dispositivo e sintonizzabilità, informare l&#39;utente dello spazio ottimale parametro per azionare il dispositivo per la separazione di particelle. iii. Di trattamento automatizzato di piccolo-campione per la separazione di particelle Per l&#39;elaborazione del campione di successo e preciso basato su chip microfluidica, è fondamentale in modo affidabile e preciso metro, carico, consegnare, e raccogliere le quantità di liquidi che passano attraverso. Questa precisione è particolarmente importante quando il volume del campione è piccola(~ 0,1-1 ml), che è comune in laboratorio clinico o di ricerca. 30 precisa manipolazione del campione è impegnativo in esperimenti tradizionali microfluidici che impiegano ritiro manuale del campione in una siringa e l&#39;infusione in un dispositivo senza valutazioni di quando il campione è stata separata e quando devono essere raccolti. Il protocollo presentato impiega automatizzato campione bobina di carico e erogazione accoppiato con feedback in tempo reale da sensori di flusso per consentire separazioni riproducibili di piccoli volumi di campione. La Figura 5 mostra i profili di flusso misurata in SPO e LPO da un tipico esperimento separazione. Innanzitutto, portando tampone di almeno 35 microlitri viene caricato per garantire un flusso stabile prima che il campione raggiunge il chip acustica. Volumi di campione inferiori 100 pl non sono raccomandati per questa configurazione del sistema, perché diluizione del campione dovuta al buffer principale diventa eccessiva. Una spina di aria viene utilizzata all&#39;inizio del the iniezione prima che il buffer porta per separare la spina campione dal fluido che segue, impedendo la miscelazione e la diluizione del campione e servire come indicatore per i sensori di flusso. Dopo un transitorio iniziale come fluido comincia a muoversi attraverso il sistema, segnali spike taglienti in entrambe le uscite indicano il passaggio del primo bolla d&#39;aria. Questi transitori sono seguiti da un lungo periodo di flusso stabile come il campione scorre attraverso il sistema, poi un&#39;altra punta quando la seconda bolla d&#39;aria passa, e infine un eventuale calo di portata a zero dopo la pompa si ferma siringa. Il passaggio delle spine aria attraverso i sensori di flusso viene utilizzato come punti di innesco per commutare le valvole per avviare e arrestare la raccolta del campione, riducendo così al minimo campione perduta e diluizione con volumi di fluido non-campione. Ciclo chiuso misurazione di volumi di campione trasformati elimina la necessità di riprogrammare questi valori prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento ogni campione in ingresso viene cambiato. Questa caratteristica èparticolarmente importante quando il volume del campione è limitato, per esempio nel caso di molti campioni clinici. Monitoraggio del flusso in tempo reale aiuta anche nella risoluzione dei problemi; una cattiva esecuzione (ad esempio, uno zoccolo formando in uno dei punti vendita) è immediatamente evidente dai profili di flusso risultanti, come nella figura 5b. Per dimostrare la flessibilità e l&#39;efficacia della separazione acoustofluidic utilizzando l&#39;architettura del sistema presentato, DENV purificato e le riserve di virus GGV sono stati aggiunti in azioni di celle e separate da lavorazione attraverso il chip microfluidico. Figura 7a mostra che le cellule Raji erano ben separati-da virus, come 97 % di cellule Raji escono chip sono risultati essere in LPO, lasciando così un campione altamente arricchito di DENV nel SPO. In confronto, l&#39;efficienza della separazione DENV era inferiore, con il 70% di DENV uscita del chip trovato nel SPO. Ciò può essere attribuito alla leggera miscelazione convettiva indotto dalle spire della Separatisul canale, ma più probabile che alcune particelle DENV migrano insieme con le cellule Raji nel LPO. Cellule che migrano lateralmente attraverso linee di corrente trascinano un fluido con loro, anche a basso numero di Reynolds. Con questo meccanismo, così come aspecifico adsorbimento superficie, particelle virali trasferire nella LPO. Tuttavia, il campione altamente arricchito di DENV nel SPO è un vantaggio significativo, per esempio quando de novo sequencing è utilizzato per rilevare e identificare i virus. Figura 7b mostra che in una prova sperimentale, solo circa il 70% delle cellule Boa escono chip sono stati trovati nella LPO, rispetto a quasi il 100% di efficienza di separazione per cellule Raji. La differenza di prestazioni di separazione tra i due tipi di cellule può essere attribuibile a una dimensione più piccola o media densità inferiore di cellule Boa rispetto alle cellule Raji, quindi con conseguente forze acustiche più piccole. Per confermare o smentire queste ipotesi, le dimensioni, la densità e la morfologia di Boale cellule in sospensione (che normalmente crescere aderenti) di cellule Boa devono essere misurati con precisione, uno sforzo per ulteriori indagini. Negli stessi esperimenti, analogamente agli esperimenti con DENV, il grosso del GGV recuperato uscita dal SPO, indicando un arricchimento della frazione virale. I dati presentati evidenziano le sfide inerenti di ingegneria piattaforme di ampia applicazione per l&#39;elaborazione di una serie di campioni biologici. È importante sottolineare che le interazioni biologiche può cominciare a giocare come un grande ruolo gli effetti fisici e meccanici. Tuttavia, questi esperimenti preliminari dimostrano anche la potenza e la promessa di utilizzare questo sistema per la trasformazione dell&#39;architettura campione applicazioni cliniche e di ricerca. Come un robusto sistema progettato, ben caratterizzato, questa piattaforma offre la possibilità di cercare le risposte alle nuove questioni scientifiche.

Separazione del campione e frazionamento è una delle aree di applicazione più promettenti per le tecnologie microfluidici. Tali fasi di manipolazione del campione sono parte integrante per la diagnostica clinica, lo sviluppo efficaci terapie, gli sforzi Biosurveillance e progressi nella ricerca delle scienze della vita e della tecnologia. Una miriade di strategie di separazione microfluidica sono state dimostrate per il particolato e colloidi fluide in sospensione, così come per le specie chimiche e biologiche; diverse recensioni forniscono una panoramica delle recenti progressi e gli sviluppi in questi settori 1 - 9. Anche se molte di queste tecnologie di separazione microfluidica (di seguito denominati &quot;Core Devices&quot;) sono stati ampiamente caratterizzato, pochi studi hanno preso in considerazione il problema di separazione del campione a livello di sistema. I dispositivi core sono in genere singoli chip centimetri scala, interfacciati a tubi fluoropolimero, con fluido erogato da una pompa o pressione.Tuttavia, se la promessa di microfluidica - tra cui una maggiore automazione, affidabilità e riduzione dei volumi di campione - è di diventare realtà, almeno uno sforzo equivalente deve essere dedicata alla progettazione di un sistema di separazione completa in cui è integrato il dispositivo del centro . Inoltre, una grande sfida per gli approcci alla microfluidica biorilevazione è il macro al micro interfaccia. Questo si riferisce non solo alle connessioni fisiche &quot;mondo-truciolo&quot; di un dispositivo a microfluidi ai componenti macroscala, e per la mancata corrispondenza tra tipici volumi di campione clinico o analitico (~ 0,1-10 ml) e il volume interno di chip microfluidica (~ 0,01-10 microlitri), ma anche le limitazioni di campionamento statistico derivanti da colmare queste scale dimensionali. Questi problemi contribuiscono alla percezione che la pre-elaborazione e preparazione del campione sono il &quot;anello debole&quot; della biorilevazione. 10 La piattaforma descritta in questo lavoro taKES grandi passi verso affrontare queste sfide. In una prospettiva a livello di sistema, i dettagli di questo protocollo il trattamento affidabile di precisione-misurate volumi analitico scala (che variano da 0,15 a 1,5 ml) su scale temporali ~ 10 min. Si tratta di una operazione &quot;un solo pulsante&quot;: una volta che la fiala sorgente contenente le fiale di campione e di destinazione per la raccolta delle frazioni vengono inseriti nel sistema, il comando &quot;Esegui&quot; avvia la procedura, e tutte le fasi sono controllati dal computer. Alla fine di una corsa, le fiale di raccolta possono essere rimossi dal sistema di analisi valle delle frazioni separate. Il Device Core in questo sistema è un chip acoustophoresis che estrae (5-20 micron) particelle di cellule di mammifero dimensioni dal campione. Separazione Acoustophoretic è scelto qui soprattutto perché è high-throughput (fino a 100s di microlitri / min), senza etichetta e senza contatto, offrendo così vantaggi nel separare viru praticabileses dalle cellule che poche altre tecniche microfluidici possono eguagliare. La fisica della particelle acustico messa a fuoco sono stati ampiamente descritti, 11 - 13 e non sono il focus di questo protocollo, ma un breve riassunto dei concetti di base segue per aiutare a comprendere l&#39;applicazione alla separazione microfluidica. Ultrasuoni onde stazionarie risonanti in microcanali piene di liquido producono campi di pressione, che danno origine a forze che guidano le particelle verso i nodi di bassa pressione. La grandezza forza dipende dal volume della particella, e su un fattore di contrasto acustico derivante dai relativi densità e compressibilities della particella e il fluido di sospensione. 14 In quanto tale, concentrandosi acustico è ideale per la separazione delle cellule di dimensioni (~ 7-15 micron) da (~ 50-200 nm) particelle virus-dimensioni. Le particelle più grandi migrano verso un nodo di pressione; tuttavia, poiché l&#39;intensità della forza è molto piccolo perparticelle di dimensioni inferiori a 2-3 micron, queste piccole particelle o specie disciolte difficilmente muoversi. La nostra implementazione specifica di separazione acustica, come precedentemente descritto, 15 incorpora una parete sottile per suddividere il canale del fluido e permette sintonizzabile, posizionamento asimmetrico della posizione di messa a fuoco. Questo aggiunge flessibilità nella progettazione di dispositivi, e dei benefici, tra cui una maggiore qualità delle prestazioni di separazione e la velocità sono perfettamente descritte altrove. 16,17 Tuttavia, uno dei principali vantaggi del metodo di progettazione a livello di sistema descritto in questo lavoro è che è adattabile ad una grande varietà di dispositivi microfluidici core. Ad esempio, la maggior parte delle altre modalità di separazione a flusso continuo, tra cui inerziale, flow-campo di frazionamento, spostamento laterale deterministico (DLD), e vari tipi di dispositivi elettrocinetiche possono essere facilmente incorporati, con opportuni aggiustamenti fatti per tener conto delle variazioni nella configurazione di ingresso / uscita , portate,e volumi di campione. I dispositivi con vari tipi di campi on-chip (elettrico, magnetico) o gradienti (termici, chimici) possono richiedere ulteriori collegamenti al chip, o l&#39;integrazione di hardware aggiuntivo, che questa piattaforma può ospitare. Questo protocollo definisce i passaggi indispensabili per la progettazione di un dispositivo di separazione microfluidica, e per fabbricare chip di silicio di vetro da una profonda ion etching reattiva (DRIE, un processo al plasma etch disponibili in molte strutture di microfabbricazione, che utilizza cicli di incisione e passivazione alternati per raggiungere in profondità caratteristiche con pareti laterali verticali 18). Successivamente, descriviamo la caratterizzazione del dispositivo acoustofluidic per determinare i parametri di funzionamento ottimali per la separazione, e infine dettaglio il sistema di separazione completamente integrato e la procedura per il trattamento di campioni biologici. Risultati caratterizzazione dispositivo tipici e l&#39;elaborazione dei dati del campione vengono poi presentati e discussi, ed i vantaggi di questo approach sono evidenziati, tra cui la modularità, robustezza, precisione e automazione.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

Un vantaggio importante di dispositivi microfluidici è la capacità di manipolare piccoli volumi, riducendo così sprechi di reagente e conservazione del campione prezioso. Tuttavia, per raggiungere robusta manipolazione campionatura è necessario affrontare l&#39;integrazione dei dispositivi con l&#39;ambiente macroscala. Per realizzare ripetibili, la separazione di particelle sensibili con dispositivi microfluidici, questo protocollo presenta una completa piattaforma microfluidica automatizzata e integrata che consente l&#39;elaborazione precisa dei 0.15-1.5 ml campioni utilizzando dispositivi microfluidici. Aspetti importanti di questo sistema comprendono struttura modulare dispositivo e infissi robusti conseguente mondo affidabile e flessibile di chip connessioni, e la gestione dei fluidi completamente automatizzata che compie campionario circuito chiuso, sistema di pulizia e adescamento misure per garantire il funzionamento ripetibile. Diversi dispositivi microfluidici possono essere usati in modo intercambiabile con questa architettura. Qui incorporiamo un dispositivo acoustofluidic, particolare la sua characterizzione, ottimizzazione delle prestazioni, e dimostrare il suo uso per dimensioni-separazione dei campioni biologici. Utilizzando feedback in tempo reale durante gli esperimenti di separazione, la raccolta dei campioni è ottimizzato per conservare e concentrare campione. Sebbene richiede l&#39;integrazione di più apparecchiature, i vantaggi di questa architettura includono la capacità di trattare i campioni sconosciuti senza ulteriore ottimizzazione del sistema, facilità di sostituzione del dispositivo, e preciso, campione di trasformazione robusto.

Le caratteristiche principali del disegno dispositivo acustico-microfluidica sono evidenziati in Figura 1, e descritte dettagliatamente altrove. 15 In breve, side-by-side due correnti di fluido flusso in un canale di separazione, separato da un canale di bypass in parallelo da una parete sottile di silicio. Poiché il primario forza di radiazione ampiezza scale con volume di particelle, le particelle più grandi migrano dal flusso di input mista campione verso il nodo di pressione acustica situata nella corrente fluida recupero adiacenti, mentre le piccole particelle rimangono nel flusso originale (Figura 1B, C). Il suddivisa architettura a due canali migliora separazione delle particelle 17 e permette la regolazione della posizione nodo utilizzando diversi fluidi canale di by-pass. 16 Il tagliere fluidica e infissi fornisce una solida piattaforma per mondo a scheggiare le connessioni, e il design modulare consente un rapido cambio tra i chip fluidici (Figura 2). Questo cONFIGURAZIONE permette altresì collegamenti del fluido reversibili, che sigillano fino a 1000 psi, da effettuare in modo rapido e affidabile (Figura 2B, E). I risonanti res frequenza f di un chip può essere stimata utilizzando semplici calcoli analitici 1D (fare riferimento al punto 1.1.1). Da un modello più completo 2D agli elementi finiti del nostro dispositivo sezione 16, la posizione del fuoco previsto per 2 nodi risonanza è 225 micron dalla parete e la frequenza attesa è 1.68 MHz. Tuttavia, res f di dispositivi reali può variare di ± 100 kHz, a seconda della temperatura di funzionamento e l&#39;accoppiamento di risonanze longitudinali e laterali. Pertanto, dopo il montaggio del dispositivo, res f devono essere verificate empiricamente a portate rilevanti e le tensioni di unità piezoelettrica, come descritto al punto 4 del protocollo. La figura 3 mostra le scansioni di frequenza rappresentante prese a 200 ml / min,<html> con acqua in principali e bypass canali, e 20 V pp fornita al piezo. Quando l&#39;accoppiamento tra il dispositivo e piezo microfluidi è buona, particelle si concentrano strettamente alla frequenza di risonanza, causando un picco dell&#39;intensità fluorescente e migrazione verso la posizione di messa a fuoco atteso (Figura 3A). Al contrario, quando vi è scarsa accoppiamento, particelle si concentrano bene ei risultati di scansione di frequenza saranno simili alla Figura 3B. In tali dispositivi, il trasduttore piezoelettrico può essere necessario ri-montato, se è stato usato un adesivo reversibile; altrimenti il ​​dispositivo non è adatto quando l&#39;alta qualità di messa a fuoco o flusso veloce sono fondamentali per l&#39;applicazione richiesta. I dati della figura 3 informano la scelta della frequenza di funzionamento per esperimenti successivi, e la tensione e campo di portata disponibili per la separazione di particelle efficiente. file / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. di trattamento automatizzato di Campione. (A) Schema di campione caricato nella bobina campione. (B) profilo del flusso Rappresentante di un esperimento di successo di separazione. (C) Portata profilo da una separazione eseguire durante il quale l&#39;uscita SPO intasato a circa 220 secondi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Dopo aver identificato chip che sono separatori efficaci, sono incorporati nel sistema illustrato nella figura 4. Totale sistema cilindrata viene minimizzato usando tubi con 0.01 &quot;diametro interno lungo il percorso di flusso principale (linee blu). Figura 5A illustra il make-up una spina di campione tipico infuso attraverso il sistema. Una piccola quantità di &quot;leader cuscinetto&quot; (~ 35 ml) è necessario per precede il campione nel flusso per eliminare fluttuazioni di flusso mentre il campione si muove attraverso il chip di separazione. La figura 5B mostra i dati di flusso risultanti da un esperimento separazione acustica automatizzato successo. Caratteristiche principali di una corsa di successo includono: (1) un aumento transitorio della portata sia nel LPO e SPO come pressione aumenta e fluido inizia a fluire attraverso il sistema, (2) un picco tagliente che indica il passaggio di una bolla d&#39;aria (il inserto mostra un profilo esteso di una singola bolla), che dovrebbe raggiungere la SPO prima della LPO dovuta al flusso disuguale dalle due uscite, (3) stabile flusso attraverso entrambe le uscite tra le due bolle di aria mentre il campione si muove attraverso il sistema, e (4) una graduale diminuzione della portata in entrambe le uscite dopo che il volume totale del campione viene consegnato al sistema. Piste problematici sono immediatamente evidenti dai profili di flusso simile alla Figura 5C, qualora risulti che la SPO diventato intasato dopo circa 220 secondi. In thi<html> s caso, una procedura di pulizia simile a quello descritto nella Fase 5.3 deve essere eseguito per sbloccare il canale. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Figura tunability 6. Dispositivo: dimensione delle particelle ed effetti di tensione. Percentuale di microsfere di polistirene estratti nel LPO dipende dalla dimensione delle particelle e la tensione fornita al piezoceramico. Ogni riga corrisponde ad una tensione di esercizio diverso alla frequenza di risonanza, determinato come descritto al punto 4. portata totale attraverso il dispositivo è di 200 ml / min, con frequenze di trasmissione applicata tra 1,62 e 1,64 MHz. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno tre esperimenti separati. Riprodotto e modificato con il permesso di The Royal Society of Chemistry da http://pubs.rsc.org / it / Contenuti / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. La figura 6 mostra compilati separazione è il risultato utilizzando varie granulometrie polistirolo e piezo guida tensioni che dimostrano i parametri di funzionamento necessari per la separazione efficiente. In generale, tensioni superiori (cioè maggiori forze acustici) sono necessari per estrarre le particelle più piccole, come previsto. Tensioni unità non può essere a tempo indeterminato aumentati, però, a causa di una maggiore dissipazione del calore e crescenti effetti di streaming acustico. 13 La trama serve come guida generale per particelle dimensioni separazione delle particelle che mostrano il recupero significativamente diversa ad una tensione un&#39;unità specifica (ad esempio, 10- e le particelle a 2 micron a 8.8 V pp) si separeranno bene. In generale, le popolazioni di particelle con una grande differenza di dimensioni, come ad esempio i virus (~ 100 nm) e le cellule (~ 10 micron) possono essere separati rapido ed efficiente, così come le cellule di diffdimensioni erenti (ad esempio, 6-8 micron eritrociti discoidali e 8-15 micron leucociti). Le condizioni specifiche necessarie per lavorare con altri tipi di cellule devono essere determinato empiricamente, come forma delle cellule, densità e compressibilità influenzare il contrasto acustica, oltre alla dimensione della cella. A tal fine, le procedure nel passaggio 4 sono utili per determinare condizioni di separazione utilizzabili per qualsiasi nuovo tipo cellulare o particelle, e non solo per valutare la qualità di un particolare dispositivo acoustophoresis. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> Figura 7. La separazione efficienza di Cell-Virus campioni addizionati. Separazione è il risultato di (A) Raji cellule addizionati con il virus Dengue (DENV) e (B), le cellule Raji e cellule renali Boa a spillo con il Golden Gate Virus (GGV). Percentuali raccolti sono definiti come la frazione di virus o cellule in uscita da una specificaoutlet rispetto alla quantità totale in uscita dal chip. Le barre di errore per (A) sono la deviazione standard di 3 studi, mentre i campioni in (B) sono stati trattati solo una volta a causa delle basse quantità disponibili. 1x PBS è stato usato come fluido tampone campione e recupero, con acqua nel canale di bypass per tutti gli esperimenti. Frequenze di funzionamento di chip erano compresi tra 1,60 e 1,64 MHz, con tensioni di unità tra i 16 ei 20 V pp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per dimostrare l&#39;utilità di questa piattaforma per la separazione di particelle biologiche, in primo luogo abbiamo usato per processare campioni biologici ben caratterizzati: cellule Raji umane (10 5 cellule / ml, diametro medio 8-10 micron 25) narcotizzati dai virus della dengue (DENV, 10 5 pfu / ml, diametro approssimativo di 50 nm 26). Figura 7A mostra la percentuale di cellule Raji e DENV raccolti sia nel SPO e LPO (definito come la frazione di ciascun tipo di particella raccolti da ogni uscita rispetto alla quantità totale di ciascuna particella raccolti dal chip). L&#39;esperimento è stato ripetuto in triplicato, e cellule Raji sono stati quantificati usando un contatore Coulter, mentre DENV stata quantificata utilizzando una trascrizione inversa polymerase chain reaction quantitativa (RT-qPCR). Successivamente, le prestazioni del sistema è stato testato in uno scenario che è più realistico per la lavorazione di campioni clinici, in cui le caratteristiche fisiche delle particelle esatte possono essere sconosciuti, e le quantità di campione disponibili sono inferiori. Qui, abbiamo valutato la separazione del virus golden gate recentemente identificati (GGV), un serpente patogeno di infettare cellule renali boa constrictor. 27 La dimensione della particella virale GGV non è ancora stata misurata, ma dal momento che GGV appartiene alla famiglia Arenaviridae, esso è probabile di undimensioni simili, tra 100 e 150 nm. 28 Abbiamo elaborato campioni GGV spillo (10 4 pfu / ml) in cellule Raji umane (e non un obiettivo di infezione per il virus), e le cellule boa renali (bersaglio dell&#39;infezione per GGV, dimensione approssimativa 10 27 micron), con entrambi i tipi di cellule a 10 4 cellule / ml. Poiché questi campioni erano disponibili in piccole quantità, separazione è il risultato di un solo periodo sperimentale sono riportati in questo lavoro. La figura 7B mostra la percentuale di cellule Raji, cellule Boa, e GGV raccolti da SPO e LPO. Le cellule sono state quantificate in questi esperimenti contando su un emocitometro e virus sono stati quantificati mediante RT-qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice at JoVE.co

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Una piattaforma per l&#39;elaborazione di precisione Microfluidic piccola Volume del campione e il suo uso per Dimensione particelle biologiche separate con un Microdevice Acoustic

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

a-microfluidic-platform-for-precision-small-volume-sample-processing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Video: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Un Microfluidic basato Trappola idrodinamico per particelle singole

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Ricerca

Bioingegneria

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

Piattaforma microfluidica con multiplex di rilevamento elettronico per spaziale monitoraggio di particelle

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Una piattaforma di Microfluidic ad altissima velocità di trasmissione per il sequenziamento del genoma di cella singola

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...