L'integrazione di questa metodologia con microfluidica a goccia aiuta a rispondere alle domande chiave relative al campo dell'immunologia dei sistemi per codificare l'eterogeneità cellulare e la comunicazione tra singole cellule o agenti patogeni. Il principale vantaggio di questa tecnica che abbiamo sviluppato è che questa procedura di caricamento della punta consente l'incapsulamento di cellule rare in goccioline che corrispondono strettamente alla distribuzione percentuale prevista. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per comprendere come utilizzare le punte delle pipette per caricare le celle su goccioline di genere e per recuperare le celle dalle goccioline.
Per il caricamento della punta per la generazione di goccioline acquose, aggiungere prima tre millilitri di tensioattivi a due millilitri di olio infarinato e disegnare la miscela di fase dell'olio in una siringa da 2,5 millilitri. Rimuovere eventuali bolle d'aria dalla siringa e collegare la siringa a un pezzo di tubo di teflon di lunghezza appropriata. Caricare due siringhe campione con un olio minerale compatibile appropriato e collegare la siringa a un secondo pezzo di tubo di teflon di lunghezza appropriata.
Quindi, punzonare un polydimethylsiloxane di cinque millimetri di diametro o una spina PDMS da una lastra EDMS polimerizzata e perforare un foro di un millimetro attraverso il centro della spina. Inserire saldamente la spina nell'estremità superiore di una punta della pipetta da 200 microliter e inserire il tubo collegato alla siringa ad olio minerale bicompatibile nella spina. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per riempire la punta della pipetta con olio minerale spingendo fuori tutta l'aria residua.
Posizionare con cura sia le siringhe campione che la siringa ad olio infarinato, su una pompa per siringhe. Una volta rimossa tutta l'aria, abbassare ogni punta della pipetta nella soluzione del campione e aspirare circa 100 microlitri di campione di cellule nelle punte. Successivamente, inserire entrambe le punte di pipetta contenenti campioni nelle due insenature interne del chip PDMS e inserire il tubo contenente la miscela di fase dell'olio nell'ingresso esterno.
Impostare le portate sulla pompa della siringa come indicato E immettere e impostare le dimensioni di ogni siringa. Avviare la pompa per sciacquare la soluzione campione attraverso i canali interni del dispositivo e la fase dell'olio attraverso il canale esterno del dispositivo. Quindi collegare un pezzo di tubo di una lunghezza appropriata all'uscita per iniziare a raccogliere le goccioline quando la formazione di goccioline è stabile, raccogliendo le goccioline in un tubo di blocco.
Una volta raccolte tutte le goccioline, aggiungere 200 microlitri di mezzo RPMI, senza siero, sopra le goccioline e incubare il campione con il foro sul coperchio del tubo di bloccaggio per l'appropriato periodo di tempo sperimentale. Per la rottura dell'emulsione, aggiungere prima due millilitri di PFO a otto millilitri di olio flouinato e utilizzare una siringa per rimuovere l'olio in eccesso dal fondo del tubo di raccolta delle goccioline. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione PFO al 20% all'emulsione per rilasciare le celle incapsulate nella fase acquosa e toccare brevemente il tubo per mescolare.
Non dimenticare che la PFO può essere dannosa per le cellule. E quindi, mantenere il contatto con PFO al minimo. Dopo uno o due minuti, ruotare la soluzione alla forza centrifuga relativa più bassa possibile per 30 secondi e trasferire immediatamente 550 microlitri della frazione acquosa in un nuovo tubo bloccato contenente 500 microlitri di PBS freddo, integrato con siero di vitello fetale al 2% o FCS.
Lasciare che l'olio residuo affondi sul fondo del nuovo tubo di bloccaggio e trasferire con cura 950 microlitri della cella contenenti fase acquosa in un nuovo tubo di bloccaggio. Assicurarsi che l'olio non venga trasferito insieme alla fase acquosa nel nuovo tubo di blocco. Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere nuovamente il pellet in 300 microlitri di PBS freddo fresco integrato con 2%FCS.
Utilizzando l'approccio di caricamento della punta come appena dimostrato, è possibile ottenere tassi di incapsulamento delle celle Jurkat T coincidenti con i valori statisticamente previsti. Sorprendentemente, anche con cellule aderenti come le cellule tumorali, che tendono a ciuffo, o cellule rare come le cellule dendritiche plasmacitoidi, si osserva una migliore efficienza di incapsulamento. Durante questo incapsulamento rappresentativo, le goccioline rigenerate utilizzando agarosio a temperatura di gelata ultra-bassa e gelate dopo la produzione per formare perline idrogel di agarosio che hanno permesso successive analisi a valle tramite microscopia e citometria del flusso.
L'analisi microscopica ha rivelato che l'accoppiamento cellulare è stato ottenuto in diverse combinazioni indicative di accoppiamento cellulare ad alta produttività e l'analisi della stessa popolazione di perline di idrogel per citometria del flusso, ha rivelato che le perline senza cellule potevano essere separate dalle perline con cellule basate sui loro distinti schemi di dispersione avanti e laterale. Infatti, la gating sulla popolazione di perline senza cellule ha confermato la mancanza di incapsulamento cellulare per l'assenza di segnali fluorescenti mentre gating sulla popolazione di perline con cellule ha rivelato l'esistenza di più sotto-popolazioni indicative dell'incapsulamento di cellule Jurkat T etichettate in modo diverso. Durante l'utilizzo di questo metodo, è importante ricordare che la concentrazione cellulare è un fattore limitante e deve essere ottimizzata per assicurare un efficiente incapsulamento cellulare e l'accoppiamento cellulare.
Seguendo questa procedura, non solo una o due celle possono essere incapsulate in goccioline ad alta efficienza, ma è possibile incapsulare più celle, o tipi di celle, per una replicazione più accurata del micro ambiente cellulare. Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nei campi dell'immunologia e delle discipline correlate per un utilizzo ottimale delle popolazioni di cellule cicatriziali e la loro efficiente incapsulamento nelle goccioline, per studiare il comportamento cellulare in un ambiente privo di rumore.
