Questo lavoro è finanziato da NIH concedere RR021905 P20-01, CF RPD concedere STANTO07R0, e la NASA concedere NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schematica SESI-MS per l&#39;analisi di sostanze volatili batterica. Spazio di testa della coltura batterica è spostato da CO 2 (1) nella camera di reazione SESI (2). Come il volatiles attraversano la camera di reazione SESI passano attraverso la nube electrospray e diventare ionizzato (3). Una volta ionizzato, i volatili sono tirato in spettrometro di massa per l&#39;analisi (4). Gas di trasporto in eccesso e che non ha reagito volatili batterica sono passati attraverso un filtro di 0,22 micron (5), come ulteriore misura di protezione, e ventilati per una cappa chimica. Riquadro: L&#39;ago elettrospray SESI è un capillare in silice (40 ID micron) con una punta dell&#39;ago affilata. A dimostrazione dell&#39;uso di SESI-MS per la caratterizzazione di sostanze volatili batteriche, E. coli K12 e P. PAO1 aeruginosa sono coltivate in aerobiosi per 24 ore in 50 mL di LB-Lennox a 37 ° C e la SESI-MS spettri dei volatili spazio di testa sono raccolti in 2 minuti. L&#39;anidride carbonica (99,99%) ad un flusso di 2 L / min viene usato come gas di trasporto per la consegna volatili della camera di reazione. La camera di reazione SESI è stato su misura e dotato di una API-3000 (SCIEX), sostituendo l&#39;originale sorgente di ioni electrospray. Gli spettri sono raccolti in modalità ioni positivi con lo 0,1% acido formico, metanolo 5,0%, e 94,9% di acqua (v / v) come la soluzione electrospray, consegnato a 5 Nl / s attraverso un non-conduttivo capillare in silice con una punta dell&#39;ago affilata (40 ID micron). La tensione applicata è di 2,5 kV. Analista 1.4.2 del software (Applied Biosystems) viene utilizzato per la raccolta dati con i seguenti parametri: 20-500 Da, MCA modalità, 40 scansioni, 3 s / scansione, e 2 minuti il ​​tempo di analisi totale. 1. Sistema di coltura <ol><li> Scegli il vaso adatto per far crescere la vostra culture, tenendo conto delle esigenze di crescita della specie nel tuo esperimento (ad esempio, aerazione, luce, temperatura, ecc), così come la consegna efficiente dei volatili allo spettrometro di massa. Le bottiglie cultura che sceglie di utilizzare sono standard 100 mL in Pyrex bottiglie di mezzi dotati di tappi filettati che hanno almeno due porte luer. Una linea in ingresso viene inserito attraverso una porta luer vettore per la consegna del gas alla bottiglia campione e una linea di uscita viene inserito attraverso un&#39;altra porta per la consegna di COV allo strumento (Figura 1). Eventuali ulteriori porte sono collegati. </li><li> Prima di coltura dei campioni, pressurizzare i vasi e immergere in acqua per controllare eventuali perdite. Fughe di gas sono una causa primaria di risultati atipici, sotto forma di segnali deboli o assenti agli ioni di volatili. </li></ol> 2. Esperimento biologico: set-up e le considerazioni di sicurezza <ol><li> Fai crescere la tua culture nelle condizioni appropriate per la tua ipotesi. Si raccomanda che almeno due repliche biologiche, ciascuna con due tecnici si replica, vengono utilizzati per ogni variabile. </li><li> Preparare un bianco per ogni condizione di cultura (medio, antibiotici, ecc) e incubare il bianco nelle stesse condizioni dei vostri campioni. </li><li> Utilizzare misure di sicurezza che sono appropriati per gli agenti biologici in uso, prendendo in considerazione il livello di biosicurezza (s) della specie. </li><li> Per prevenire la contaminazione dello strumento e le linee di trasferimento del gas con praticabile agenti biologici, installare i filtri delle dimensioni dei pori appropriato nella linea di gas di trasporto. I filtri non interferisce con il trasferimento delle sostanze volatili della camera di reazione SESI, ma può leggermente impatto l&#39;efficienza del trasferimento aerosol 6. </li><li> Usare contenitori secondari o un armadietto biosicurezza quando si collega il tappo del trasferimento del gas per la vostra bottiglia cultura per garantire il contenimento adeguato nel caso di versamento di agenti biologici. </li><li> Avviare e interrompere il flusso del gas vettore per la vostra bottiglia campione in un modo che non costruirà la pressione all&#39;interno della bottiglia. </li></ol> 3. Strumento di ottimizzazione NOTA: SESI-MS è specificamente progettato per volatili del campione, in modo da limitare l&#39;uso di fragrante articoli per la cura personale (ad esempio, colonie, collutorio, lozioni, ammorbidente), gomme, sigarette, ecc prima di utilizzare lo strumento. Strettamente tappo tutte le sostanze chimiche volatili in laboratorio, e l&#39;aria di controllo bozze il più possibile durante il test. I seguenti parametri strumentali, che tutti influenzare l&#39;intensità del segnale e stabilità, dovrà essere ottimizzata per il vostro strumento e sperimentare. <ol><li> Soluzione electrospray e portata: Scegli la soluzione adatta electrospray per la classe di molecole che si desidera target, tenendo conto della polarità strumento operativo (modo positivo o negativo di litio) e il carattere molecolare dei composti target. In questo esperimento la soluzione electrospray è 0,1% di acido formico, metanolo 5,0%, 94,9% di acqua (v / v), che aumenta l&#39;intensità del segnale di meno molecole polari while fornisce una buona stabilità del segnale. La soluzione è consegnato ad un flusso di 5 nL / s. </li><li> Flusso del gas: il flusso del gas vettore può influenzare la stabilità electrospray e l&#39;intensità del segnale. CO 2 (≥ 99,99%) ad un flusso di 2 L / min è usato qui. </li><li> Forma e la posizione dell&#39;ago: La forma punta dell&#39;ago e la posizione fortemente influenzare l&#39;intensità del segnale e stabilità. Quando si installa un nuovo ago, la posizione dell&#39;ago deve essere ottimizzata per creare un equilibrio tra lo sfondo a bassa e ad alta intensità del segnale analita e stabilità del segnale. Al fine di riprodurre gli spettri SESI dopo un cambio di ago, è necessario raccogliere periodicamente spettri come si regola la posizione dell&#39;ago finché non si è in grado di corrispondere al spettro osservato al tuo record. La distanza dalla punta elettrospray ago a orifizio massa spec sarà di 1 - 5 mm. </li><li> Tensione applicata: La tensione che viene applicata al sistema influenza l&#39;intensità del segnale di ioni e la stabilità della Taylor elettrospray cono. Inoltre, la tensione ottimale dipende dalla vostra soluzione elettrospray e la forma della punta dell&#39;ago. All&#39;inizio della vostra serie di esperimenti, determinare la tensione che produce lo spettro ottimale e la stabilità del segnale per il sistema, e quindi utilizzare questa tensione per tutti gli esperimenti successivi. Per il nostro sistema, tensioni applicate di 2,0-5,0 kV fornire intensità ottimale del segnale e stabilità elettrospray. Per questo esperimento 2,5 kV viene utilizzato. </li></ol> 4. Accensione e messa a punto del SESI-MS per l&#39;analisi <ol><li> Iniziare facendo in modo che la tensione di alimentazione sia spento e che il sistema è di scaricare l&#39;elettricità. A tale scopo 1) assicurare l&#39;indicatore sulla tensione di alimentazione sono spenti, 2) garantire la tensione sul multimetro è pari a zero, e 3) la messa a terra i cavi elettrici. </li><li> Installare la soluzione appropriata electrospray per l&#39;esperimento. </li><li> Accendere il gas di trasporto e impostare il flusso verso il tasso appropriato per l&#39;esperimento. </li><li> Applicare una pressione al serbatoio electrospray di avviare la fornitura della soluzione elettrospray della camera di reazione. </li><li> Accendere la tensione di alimentazione e regolare la tensione su un valore appropriato per i vostri esperimenti. </li></ol> NOTA: A questo punto le superfici metalliche della sorgente di ionizzazione sono in grado di fornire una scossa pericolosa. Esercitare grande cautela quando si lavora intorno allo strumento una volta che la tensione di alimentazione è stata accesa. <ol start="6"><li> Impostare un metodo di messa a punto per il monitoraggio del SESI-MS spettro rendendo messo a punto modifiche alla tensione applicata. Utilizzare i parametri di acquisizione che hanno ottimizzato per il sistema e l&#39;esperimento. Deselezionare la multipla Acquisizione Channel (MCA) casella di controllo (se applicabile) in modo che ad ogni scansione produce uno spettro indipendente, impostare il tempo di acquisizione a 10 - 15 min, e avviare l&#39;acquisizione. Spettri del fondo gas di trasporto dovrebbe essere osservato. </li><li> Fai messo a punto modifiche alla tensione applicata per ottenere un cromatogramma stabile ione totale (TIC) e scansioni riproducibile che corrispondono al CO 2 scansioni per i vostri esperimenti precedenti. Una volta che le regolazioni di tensione sono stati compiuti, continuare a raccogliere spettri e una TIC per cinque minuti per assicurare lo strumento è stabilizzato. </li><li> Una volta stabilità strumentale è assicurata, impostare il metodo di acquisizione a seconda dei casi per i tuoi campioni, regolando il tempo di acquisizione, intervallo di dati, e la selezione MCA, se necessario. Raccogliere un gas spettro vettore sfondo per il vostro record. </li></ol> 5. Ottenere una impronta digitale volatili della vostra cultura batterica <ol><li> Per raccogliere uno spettro bianco, diretto il flusso di gas di trasporto attraverso le linee di bypass, e quindi collegare il campione in bianco (valvole chiuse) alle linee trasferire il gas dello strumento. </li><li> Aprire le valvole alla bottiglia campione e chiudere le valvole delle linee di bypass. </li><li> Lasciare che il sistema si stabilizzi per 30 secondi, durante i quali l&#39;umidità nella camera di reazione si sta stabilizzando. Questo periodo di equilibrio è fondamentale per ottenere spettri riproducibile. Per garantire che il sistema è equilibrato, si potrebbe voler controllare il TIC, che cambierà durante il periodo di equilibrio, e stabilizzare in seguito. </li><li> Una volta che il sistema è equilibrato, avviare la raccolta dello spettro. </li><li> Dopo lo spettro viene raccolta, rimuovere la bottiglia campione per la prima apertura del gas linee di bypass vettore, poi la chiusura delle valvole del campione, e infine la rimozione della bottiglia di campionamento. Lavare il sistema con il gas di trasporto per 2 - 4 minuti, eliminando l&#39;umidità e sostanze volatili assorbiti dalle linee di trasferimento, impedendo campione a campione riporto. </li><li> Ripetere i passaggi 5,2-5,5 per ogni campione batterica, a intermittenza raccogliendo ulteriori spettri vuoto per assicurare un completo vuoto sottrazione. Incompleti vuoto sottrazione porterà allacomparsa di picchi chimici sfondo nella vostra spettro elaborati che sono comuni alle tecniche di ionizzazione a pressione atmosferica, (ad esempio, gli ftalati, siliconi, ecc) 9. </li><li> Al momento del ritiro spettri, sì che i segnali di ioni non sono superiori ai limiti di rilevazione lineare del vostro strumento, come determinato dal TIC e l&#39;intensità massima dei singoli picchi. Ioni di superare i limiti superiore del rivelatore del tuo strumento in grado di generare picchi di artefatto che non sono rappresentativi del campione. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Come esempio del SESI-MS spettri che possono essere ottenuti per volatili batterica, il modo positivo le impronte digitali agli ioni di volatili per E. coli e P. aeruginosa cresciuto in condizioni aerobiche LB-Lennox per 24 ore a 37 ° C sono riportati (Fig. 2). La E. coli volatili spettro è dominato da indolo a m / z = 118, che dà E. culture coli il loro odore caratteristico, mentre lo spettro di P. aeruginosa contiene una grande varietà di picchi protonatable. Si prega di notare che l&#39;intensità relativa dei picchi nello spettro volatili dipendono i parametri strumentali descritto nella Sezione 3. Questi parametri devono essere strettamente controllati dalla fase sperimentale alla sperimentazione al fine di ottenere spettri riproducibile. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 Blank-sottratto agli ioni positivi modalità SESI-MS spettri (20 - 150 m / z). Di E. coli K12 e P. aeruginosa PAO1 volatili dopo 24 ore di crescita aerobica a LB-Lennox a 37 ° C. Per ulteriori dettagli sui picchi osservati negli spettri SESI, consultare Zhu, et al. 8.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Batteri producono diverse combinazioni di sostanze volatili, che possono essere utilizzati per l&#39;identificazione batterica 10-12 e la valutazione dello stato metabolico. La SESI-MS metodo qui descritto fornisce un mezzo di rapida caratterizzano volatili batterica (in due minuti o meno) senza alcuna preparazione del campione, generando un batterica &quot;impronta digitale&quot; per l&#39;identificazione della specie. 8 Negli ultimi decenni molti altri ionizzazione a pressione atmosferica MS tecniche sono state applicate alla caratterizzazione di composti volatili, tra cui tubo selettivo flusso di ioni (SIFT) e reazione di trasferimento di protoni (PTR), spettrometria di massa. Il vantaggio distintivo che SESI fornisce oltre questi metodi di ionizzazione altri è che è possibile picchi specifico frammento (a condizione che il tipo appropriato di spettrometro di massa è stato adattato per SESI), che è un importante strumento per l&#39;identificazione del composto. Non abbiamo l&#39;indirizzo frammentazione picco nel protocollo di cui sopra, ma per gli esempi di come le informazioni frammentazione può essere utilizzato nella caratterizzazione di sostanze volatili batterica, consultare Zhu, et al. 8 SESI-MS ha applicazione diretta per il rilevamento in situ di infezioni polmonari batteriche attraverso l&#39;analisi respiro, ma può anche essere applicato a qualsiasi ambiente in cui il campionamento volatile è possibile. Per esempio, l&#39;analisi delle sostanze volatili nelle urine, sangue e respiro, che sono rilevanti per la diagnosi di malattie metaboliche, malattie gastroenteriche, cancro e l&#39;esposizione ambientale, ben si adattano ad SESI-MS. 13,14 SESI-MS ha anche una vasta gamma di applicazioni non-clinici fingerprinting COV, compresa l&#39;analisi rapida di alimenti per i volatili caratteristica associata con la maturazione, l&#39;invecchiamento, o guastarsi. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Catalogo # </td><td> Commento </td></tr><tr><td> API-3000 triplo quadrupolo </td><td> Strumento </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Acquistato con Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI Sorgente di ioni </td><td> Strumento </td><td></td><td></td><td> Su misura; Sede di riferimento 6 </td></tr><tr><td> Misuratore di portata gas </td><td> Attrezzatura </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Anidride carbonica </td><td> Attrezzatura </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ puro al 99,99% </td></tr><tr><td> Azoto </td><td> Attrezzatura </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Ultra elevata purezza </td></tr><tr><td> 100 ml di vetro dei media bottiglie </td><td> Attrezzatura </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 vite discussioni </td></tr><tr><td> Tappi di bottiglia con porte luer </td><td> Attrezzatura </td><td> Bio Chem Fluidica </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap di montaggio </td></tr><tr><td> Luer porta spine </td><td> Attrezzatura </td><td> Bio Chem Fluidica </td><td> 009LP </td><td> Cap di montaggio </td></tr><tr><td> Tubi 1 / 4 &quot;(OD) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Attrezzatura </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap di montaggio e linee di trasferimento del gas </td></tr><tr><td> Tubi 1 / 8 &quot;(OD) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Attrezzatura </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap di montaggio </td></tr><tr><td> Valvole a due vie </td><td> Attrezzatura </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap di montaggio </td></tr><tr><td> Filtro, grado AAQ </td><td> Attrezzatura </td><td> Balston Filtri </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Acido formico, LC / MS grado </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> A117-05AMP </td><td> Elettrospray soluzione </td></tr><tr><td> Metanolo, LC / MS grado </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> A456-500 </td><td> Elettrospray soluzione </td></tr><tr><td> Acqua, LC / MS grado </td><td> Reagente </td><td> Pescatore </td><td> W6-500 </td><td> Elettrospray soluzione </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

Secondaria elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (SESI-MS) è un metodo sviluppato per la rapida individuazione di composti volatili, senza la necessità di pre-trattamento del campione. Il metodo è stato inizialmente descritto da Fenn e colleghi 1 ed è stato applicato per la rilevazione di droghe illecite 2 e esplosivi 3-4, la caratterizzazione di sostanze volatili pelle 5, e l&#39;analisi del respiro 6-7. SESI ionizzazione avviene per mezzo di reazioni protone trasferimento tra la soluzione electrospray e l&#39;analita volatile, ed è quindi adatto per l&#39;analisi di etero-molecole organiche, come nella ionizzazione elettrospray tradizionali (ESI). Tuttavia, a differenza ESI standard, il processo di trasferimento di protone SESI si verifica nella fase vapore piuttosto che in soluzione (Fig. 1), e quindi SESI è più adatto per la rilevazione di sostanze volatili organiche e aerosol. Stiamo espandendo l&#39;uso della SESI-MS per la rilevazione di sostanze volatili batteriche come metodo per l&#39;identificazione e la caratterizzazione batterica 8. Abbiamo dimostrato che SESI-MS fingerprinting volatili, combinato con un metodo di analisi statistica, può essere utilizzato per differenziare generi di batteri, specie e colture miste in una varietà di terreni di crescita. 8 Qui si illustrano i passaggi per ottenere le impronte digitali dei batteri volatili utilizzando SESI -MS, inclusi i parametri strumentali che dovrebbe essere ottimizzato per garantire solide identificazione e caratterizzazione di batteri.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondaria elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (SESI-MS) permette la rilevazione di composti organici volatili (COV) senza la necessità di alcun pre-trattamento del campione. Questo protocollo fornisce le istruzioni per il rapido (pochi minuti) caratterizzazione di COV batterica utilizzando SESI-MS.

Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K Views.  University of Vermont. Secondaria elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (SESI-MS) permette la rilevazione di composti organici volatili (COV) senza la necessità di alcun pre-trattamento del campione. Questo protocollo fornisce le istruzioni per il rapido (pochi minuti) caratterizzazione di COV batterica utilizzando SESI-MS.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Rilevamento e identificazione batterica Utilizzando Sensori elettrochimici

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caratterizzazione qualitativa della frazione acquosa da idrotermale Liquefazione di alghe Utilizzando 2D gascromatografia con tempo di volo spettrometria di massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...