Questo lavoro è supportato da ARRA NSF MRI Instrument Development Grant # 0923179 di FMF. Ringraziamo Aqua Asberry, Coordinatore Laboratorio per la Parker H. Petit Istituto di Bioingegneria e Bioscienze Istologia Nucleo, per l&#39;assistenza con sezionamento dei tessuti.

1. Tessuto sezionamento <ol><li> Negozio di flash-congelato, intero tessuto in freezer -80 ° C fino al momento per il sezionamento. </li><li> Permettere al campione di tessuto di raggiungere la temperatura nel cryomicrotome prima del sezionamento (30 min). Impostare la lama e la temperatura del campione a -30 ° C. </li><li> Una volta che il tessuto ha raggiunto la temperatura, la manipolazione del campione con pinzette, tagliare anteriore o posteriore del cervello seconda di quale parte del cervello è di interesse per sufficiente superficie di montaggio (cioè se la parte anteriore del cervello è di primaria importanza, montare posteriore del cervello sul mandrino). <ol><li> Applicare ~ 0,5 ml Temperatura ottimale di taglio Compound (OCT, Tissue-Tek, Sakura) al mandrino in centro e, con una pinzetta, tenere campione in vigore in ottobre fino a che non si solidifica. Una volta che ottobre è completamente congelato, montaggio mandrino a supporto del campione. </li><li> Una quantità minima di ottobre utilizzato per montare il campione è preferito (in contrasto con il montaggio del campione in un blocco di ottobre come viene comunemente fatto in altri istoprocedure logiche) per minimizzare la contaminazione del campione. Contaminazione del campione da ottobre è dannoso per la DESI e processo di imaging a causa di soppressione ionica. </li></ol></li><li> Sezioni tipo di tessuto necessari per l&#39;imaging gamma MS 12-18 micron di spessore. Sezione tessuti a spessore desiderato entro il range raccomandato. Scongelare-montare ogni tessuto sezionato leggermente toccando una stanza a temperatura microscopio vetrino sopra sezione. Una volta che un campione è montato, fare attenzione a non toccare la sezione di tessuto, come cambierà la distribuzione chimici e composizioni. </li></ol> Nota: si consiglia il montaggio di due sezioni per vetrino, con una sezione per l&#39;ottimizzazione e l&#39;altro per l&#39;imaging. Se le sezioni non sono per l&#39;imaging immediata, conservare i vetrini a -80 ° C freezer in una scatola di presentazione fino al momento dell&#39;analisi. <ol start="5"><li> Se l&#39;analisi sezioni memorizzate, rimuovere diapositiva dal freezer, trasferire immediatamente a essiccatore a vuoto, e permettere ~ 15-20min per scongelare. Lasciando il campione in un essiccatore più si asciuga il campione e ridurre l&#39;efficienza DESI. L&#39;ottimizzazione della sorgente di ioni DESI verrà fatta con il campione di tessuto una volta scongelato, tuttavia, nell&#39;interesse di tempo, il periodo durante il quale il campione si scongelano serve come un tempo ideale per l&#39;inizializzazione dell&#39;apparecchiatura. <ol><li> Usando acetonitrile con 1% di acido acetico come solvente DESI, accendere la pompa a siringa con un flusso di 5 ml / min. Una portata minore ridurrà il lato punto d&#39;impatto del getto DESI e dimensione effettiva dei pixel, ma un flusso maggiore può essere necessaria per una sensibilità sufficiente. Quindi la portata (tipicamente 1-5 microlitri / min) deve essere ottimizzata per ogni applicazione e la sensibilità e risoluzione desiderata. Assicurarsi che la siringa contiene abbastanza solvente per l&#39;ottimizzazione completa e di imaging in data portata. </li><li> Una volta che il solvente appare gocciola dalla punta sorgente, accendere il gas azoto nebulizzazione con una prese di 160 psi. </li><li> Accendere l&#39;alimentatore ad alta tensione collegato alla sorgente di ioni applicando 3,600 V. </li></ol></li><li> Montare il vetrino sul tavolo di movimento e iniziare a sorgente di ioni e MS ottimizzazione </li></ol> 2. DESI Ottimizzazione <ol><li> Il sistema DESI composto da una sonda sorgente (vedere Figura 2), una siringa e pompa o sistema alternativo di erogazione del solvente, azoto compresso, il campionamento traduzione e montaggio. Procedere con l&#39;ottimizzazione sorgente DESI una volta lo spettrometro di massa è stato ottimizzato per la gamma di massa appropriato e analiti di interesse. <ol><li> Se i componenti di origine non sono stati accesi ancora, fare riferimento alle sezioni 1.5.1-3 per le direzioni. </li><li> Le variabili discusse in queste sezioni sono raccomandati per l&#39;imaging di tessuti biologici. Tuttavia queste variabili devono essere ottimizzati per diversi tipi di tessuto o campione. Solventi alternativi, portate, nebulizzatori pressioni del gas e le tensioni sono state riportate per immaginazioneng di tessuti biologici. 16-18 </li></ol></li><li> Assicurarsi che inizialmente la sorgente DESI non tocca il vetrino, e non indirizzati contro parti della sezione di tessuto. Questo assicurerà che la sonda non viene danneggiato nel processo di ottimizzazione iniziale e non contaminerà qualsiasi parte del set up entrando in contatto con il campione di tessuto. <ol><li> Una buona posizione di partenza è con il consigliato 3 mm dalla superficie del campione e di 5 mm dall&#39;ingresso capillare MS, con la sonda ad un angolo di 55 ° rispetto alla superficie del campione. L&#39;interno della sonda capillare DESI deve estendersi circa 1 mm oltre la capillare esterno. Tutti questi parametri saranno ottimizzate. </li></ol></li><li> L&#39;interfaccia MS capillare deve avere un angolo di raccolta di ~ 15 ° rispetto alla superficie del campione per il trasferimento ottimale di ioni. Regolare l&#39;altezza stadio in modo che il MS libra capillari sulla superficie del campione, il capillare deve essere &lt;1 mm dalla superficie, il più vicino possibilesenza toccare. </li><li> Allineare la sonda DESI nella dimensione x con rispetto all&#39;aspirazione capillare MS modo che siano direttamente in linea. </li><li> Regolare le posizioni yez della sorgente DESI per sensibilità ottimale utilizzando la sezione di tessuto supplementare. Si noti che, come la sonda DESI è diretto a una zona campione, finirà desorbire e ionizzare tutti gli analiti in quella zona e segnale diminuirà gradualmente come questo avviene. Esegue questo punto il più rapidamente possibile è importante. <ol><li> Pertanto, durante il processo di ottimizzazione, il campione deve essere spostato sotto la testa di spruzzo di garantire che campione fresco viene analizzato e che eventuali variazioni di segnale sono dovute alla ottimizzazione della sorgente, non campione esaurimento. Tuttavia, considerando che la variegata composizione chimica delle diverse regioni del tessuto, un confronto diretto dell&#39;intensità ionico attraverso l&#39;intera sezione di tessuto non è del tutto preciso. Il talamo del cervello fornisce un&#39;area abbastanza grande dimensioni concomposizione chimica più consistente, ma ancora non perfettamente uniforme. Alternativamente, una marcatura di pennarello rosso, che contiene il colorante rodamina 6G ([M] +, m / z 443), sul vetrino lontano dal campione fornisce una forte risposta da MS DESI e può essere utilizzato anche per l&#39;ottimizzazione, ma data la forma campione diverso e analita, queste condizioni possono ancora non correlare ad un set-up ideale per i tessuti biologici. </li><li> Separazione y consigliata tra la punta e la fonte di aspirazione capillare: ~ 4 mm separazione z raccomandato tra la punta e la superficie del campione: ~ 1,5 mm. Anche se questi parametri saranno leggermente diverso per ogni set-up sperimentale. </li><li> Considerando la geometria e l&#39;angolo della sonda, tenere conto che la ye z posizioni-dimensionali sono correlati rispetto alla trasmissione efficace delle goccioline solvente e contenenti analita. Un cambiamento di una variabile richiede una modifica successiva nell&#39;altro per mantenere la stessa posizione impatto spruzzo esuoi angoli trasmissione. </li></ol></li><li> Regolare la distanza delle estrusioni capillari interni dal capillare esterno della sorgente per la massima sensibilità, e il minimo impatto dimensione dello spot. Attenzione: assicurarsi che l&#39;alta tensione è OFF Durante questa regolazione. </li><li> La geometria di origine è considerato ottimale quando si osserva il massimo del segnale. <ol><li> Le variabili ottimizzati nelle sezioni 2.5-2.6 sono collegati tra loro, pertanto la regolazione potrà inerentemente richiedono la ri-regolazione dell&#39;altro per mantenere la geometria necessaria sorgente-campione-aspirazione, o regolazione delle condizioni discusso nella sezione 1.5.1- 3. </li></ol></li><li> Inoltre, un elemento riscaldante che circonda il trasferimento capillare allo spettrometro di massa può migliorare la sensibilità facilitando desolvatazione delle goccioline analiti cariche prodotte durante il processo di ionizzazione. Qui si usa un riscaldatore corda arrotolata intorno al trasferimento capillare impostato a 100 ° C. </li></ol> 3. Tissue Imaging <ol><li> Durante il processo di imaging, la fase di campionamento il campione si muove sotto la sonda DESI e MS aspirazione capillare e tutti gli altri componenti rimangono stazionari. I parametri di movimento della fase dovrebbero essere selezionati sulla base DESI impatto dimensioni pennacchio e sensibilità ottimale. <ol><li> Un pennacchio impatto maggiore si tradurrà in una maggiore intensità di ioni, dato che più campione viene desorbita, però per l&#39;imaging, sarà anche tradursi in una dimensione di pixel maggiore e quindi peggiorare risoluzione dell&#39;immagine. </li></ol></li><li> La piattaforma di traslazione utilizzato in questo esperimento è home-costruito e controllato da un programma LabView che permette il controllo della velocità e interlinea rastering per un&#39;immagine di dimensioni date. La fase VI il controllo del movimento utilizzato in questo esperimento è disponibile presso omnispect.bme.gatech.edu. In alternativa, una sorgente DESI disponibile in commercio e la fase potrebbero essere utilizzati come l&#39;automatico Omni Spray fonte 2D da Prosolia Inc. (Indianapolis, IN, USA). <ol><li> Per i tessuti cerebrali di undimensione tipica immagine è di 10 x 15 mm, e dati i parametri di movimento palcoscenico utilizzati, l&#39;immagine richiede circa 3 ore. <ol><li> Programmare il VI di LabVIEW o software di controllo equivalenti per le condizioni di imaging desiderati, utilizzando una velocità di fase di scansione di 80 micron / sec, e l&#39;interlinea tra le file di 200 micron. Quando si utilizza la sorgente Spray Omni, i parametri di movimento devono essere impostati per una velocità di scansione di 100-200 micron / sec e una spaziatura di 200 micron. Notare che questi parametri di movimento possono essere modificati a seconda del numero di pixel desiderati in ciascuna dimensione sensibilità e necessario. <ol><li> Una interlinea più piccola ha dimostrato di migliorare la qualità dell&#39;immagine, con la velocità di scansione avente un effetto minore. 25 Tuttavia, è significativo notare che questo non indica necessariamente e migliore risoluzione dell&#39;immagine, dato che è fortemente dipendente punto d&#39;impatto dimensione. Una velocità di scansione più lenta e l&#39;interlinea minore aumenterà in modo significativo il tempo di analisi e devono quindi essere ottized per ogni tipo di tessuto o campione. </li></ol></li><li> Con l&#39;acquisizione spettrale MS impostato a 1 scan / sec, e l&#39;immagine creata come 1 pixel / scansione, la velocità di fase definisce la dimensione dei pixel nella dimensione x, mentre l&#39;interlinea determina la dimensione dei pixel nella dimensione y. Anche se la vera dimensione in pixel dell&#39;immagine è più grande di questa causa di spruzzare la diffusione, più lento movimento permette più tempo per desorbimento e la rilevazione di analiti. </li></ol></li><li> Dare directory e il nome del file per i file di posizione e di tempo per essere registrati durante le immagini all&#39;interno del VI di LabVIEW. </li></ol></li><li> In preparazione per l&#39;acquisizione dati di spettro di massa, calcolare il tempo totale necessario per l&#39;imaging. Il programma Labview utilizzato dal nostro gruppo fornisce automaticamente questo valore, ma se viene utilizzato controllo alternativo stadio, questo calcolo è necessario per le impostazioni di acquisizione dati MS. <ol><li> Quando si usa uno spray fonte automatizzato Omni e stadio, ogni linea dell&#39;immagine viene acquisito come individuale corre. Il tempo-per-linea e il numero di linee necessarie per determinate dimensioni di imaging sono calcolati utilizzando il software di controllo Omni Spray da immettere nel software spettrometro di massa. </li></ol></li><li> Verificare che la velocità di scansione spettrometro di massa è uno spettro / sec, e impostare il tempo di acquisizione dello strumento per abbinare il tempo totale calcolato. <ol><li> Impostare la velocità di scansione spettrale a 1 spettro / sec. </li><li> Acquisire dati in modalità profilo e accertarsi che il campo di m / z è appropriato per le specie di interesse. Ricorda che DESI produce anche analiti moltiplicano cariche, come in ESI. </li><li> Impostare il tempo di acquisizione in modo che corrisponda il tempo totale immagine data da LabView. </li></ol></li><li> Posizionare il punto di impatto a spruzzo in alto a sinistra dell&#39;area da acquisire. </li><li> Iniziare l&#39;acquisizione dei dati di MS e di movimento palco contemporaneamente. </li><li> A conclusione dell&#39;operazione di acquisizione dati, tornare spettrometro di massa in modalità standby. </li><li> Spegnere alta tensione di sorgente DESI. </li><li> Girare off gas azoto. </li><li> Spegnere pompa a siringa. </li></ol> 4. Elaborazione delle immagini <ol><li> Dati spettrali di massa, in combinazione con il tempo di prova e dati di posizione salvati come file di testo tramite LabView devono essere &quot;piegato&quot; in un&#39;immagine 2D correlando le coordinate del pixel con spettri corrispondenti. Le immagini qui presentate sono state elaborate utilizzando il software Matlab-based che è liberamente disponibile presso: omnispect.bme.gatech.edu. Se i dati sono acquisiti utilizzando la fonte Spray Omni, il software di conversione dati lucciola viene utilizzato per creare il cubo di dati per la visualizzazione dell&#39;immagine in BioMAP (www.maldi-msi.org). </li><li> Per i dati acquisiti sul spettrometro di massa Jeol AccuTOF, il cromatogramma registrato deve essere esportato in formato. Cdf per ulteriori analisi. <ol><li> Utilizzando il DataManager entro MassCenter, prima convertire i dati acquisiti ai dati centroided (Strumenti → Converti dati acquistion al Baricentro). Quindi esportare i dati in formato. CDF utilizzando la combinazione di tasti Ctrl + Maiusc + E folseguita da Strumenti → Esporta. </li></ol></li><li> Carica i dati grezzi. Cdf massa spettrali e le due file di testo, la posizione e il tempo, al sito OmniSpect. Dati di imaging Firefly-elaborati possono essere visualizzati in BioMAP. <ol><li> Ulteriore elaborazione dei dati tra cui l&#39;analisi statistica di non-negativo Matrix Fattorizzazione o plottaggio di un singolo ione di interesse può essere effettuata direttamente sul sito web. </li><li> In alternativa, il cubo di dati grezzi possono essere esportati per l&#39;analisi in Matlab. </li></ol></li></ol>

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Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).</li><li>Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spatial+resolution+in+the+imaging+of+biological+tissue+using+desorption+electrospray+ionization.">Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).</li><li>Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+quality+in+tissue+analysis+using+desorption+electrospray+ionization.">Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization.</a> Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).</li><li>Jackson, S. N., Wang, H. -. Y. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Profiling+of+Lipid+Distribution+in+Brain+Tissue+Using+MALDI-TOFMS.">Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS.</a> Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).</li><li>Jackson, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ion+mobility-TOFMS+imaging+of+lipids+in+rat+brain+tissue.">MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue.</a> J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).</li><li>Wang, H. -. Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimalist+approach+to+MALDI+imaging+of+glycerophospholipids+and+sphingolipids+in+rat+brain+sections.">A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections.</a> Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).</li><li>Wu, B., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+elements+and+molecules+in+biological+tissues+and+cells+in+the+low-micrometer+and+nanometer+range.">Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range.</a> Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).</li><li>Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Vizualization+of+Mouse+Brain+by+Lipid+Analysis+Using+Ambient+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).</li><li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Imaging+by+Mass+Spectrometry:+A+New+Frontier.">3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier.</a> Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).</li><li>Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+Metabolites+in+Tissues+under+Ambient+Conditions+by+Laser+Ablation+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry.">Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).</li><li>Pulfer, M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+mass+spectrometry+of+phospholipids.">Electrospray mass spectrometry of phospholipids.</a> Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).</li><li>Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmalogen+deficiency+in+early+Alzheimer's+disease+subjects+and+in+animal+models:+molecular+characterization+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry.">Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).</li><li>Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+composition+and+levels+are+altered+in+down+syndrome+brain.">Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain.</a> Brain Res. 867, 9-18 (2000).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Myocardial+Cardiolipin+Content+and+Composition+Occur+at+the+Very+Earliest+Stages+of+Diabetes:+A+Shotgun+Lipidomics+Study.">Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study.</a> Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L&#39;ottimizzazione della geometria sorgente DESI è critica per esperimenti MSI successo. Le molteplici variabili che contribuiscono alla allineamento del sistema influiscono direttamente sensibilità e risoluzione dell&#39;immagine. Se durante l&#39;ottimizzazione, lo sperimentatore ha difficoltà nell&#39;ottenere il segnale, si consiglia di utilizzare macchia pennarello rosso disegnato sul vetrino come punto di riferimento, il colorante, rodamina 6G, m / z 443, produce un forte segnale in modalità ioni positivi e ...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50575" target="_parent">Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry</a>. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:
Rachel V. Bennett
instead of:
Rachel V. Bennet

Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

L&#39;imaging non mirati mediante spettrometria di massa facilita l&#39;acquisizione delle informazioni chimiche per applicazioni di scoperta e ipotesi generatrice. Imaging mirata di una sostanza chimica nota di interesse, invece, può facilitare una maggiore sensibilità e selettività attraverso specifiche sviluppo del metodo. La spettrometria di massa di imaging (MSI) è più comunemente eseguito sui tessuti mediante MALDI, 1 massa di ioni secondari spettrometria (SIMS), 2 e tecniche di ionizzazione ambiente, comprese le desorbimento elettrospray ionizzazione (DESI), 3 ablazione laser-elettrospray ionizzazione (LAESI), 4, 5 e liquidi micro-giunzione-superficie di campionamento sonda (LMJ-SSP). 6 Nella MALDI e SIMS, i campioni devono essere fisicamente rimosso dal campione, e devono essere piatta e sottile, come vengono analizzati sotto alto vuoto. MALDI richiede rivestimento del campione con una radiazione di assorbimento di matrice, aggiungendo un ulteriore passo ed ingombrante per la preparazione del campione. SIMSha la più alta risoluzione laterale, ma il bombardamento con particelle altamente energetiche provoca vasta frammentazione molecolare. Pertanto, MSI con metodi ambient riempire una nicchia in cui l&#39;analisi morbido con la preparazione del campione minimo è auspicabile. Tuttavia, ad oggi, tutti i metodi sono ancora limitate dal requisito di superfici piane campione. DESI usa uno spray solvente pneumaticamente assistita carico diretto alla superficie del campione di desorbire e ionizzare analiti. 7 Il modello di lavoro per il desorbimento e la successiva ionizzazione da DESI è conosciuto come il &quot;pick-up modello goccia&quot;. 8-10 Le goccioline cariche primarie prodotta dalla sonda DESI collidono con la superficie, bagnandolo e formando un film sottile in cui l&#39;analita viene sciolto da un meccanismo microextraction solido-liquido 8 Successivamente gocciolina collisioni provocano trasferimento di momento e decollo di gocce secondarie contenenti il materiale estratto dalla superficie . 9,10 definitiva, gasioni di fase si ritiene di essere prodotto attraverso processi ESI-come dopo evaporazione di litio, i modelli di residui di carica o di altri modelli, 11 tuttavia il processo di formazione di ioni preciso in DESI deve ancora essere provata sperimentalmente. sensibilità 12 DESI è fortemente dipendente dalla solubilità del dell&#39;analita nel solvente spruzzo, come desorbimento basa sulla microextraction localizzata. 13 Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene analizzato unidirezionalmente con corsia passo sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica &#39;distribuzione spaziale (Figura 1). Dal momento che la prima prova di principio esperimento DESI-MSI riportato da Van Berkel e Kertesz, nel 2006, il 14 la tecnica è maturato notevolmente, 15 con le applicazioni riportate nella analisi dei lipidi, 3,16 metaboliti delle droghe, 17,18 diseÃsé biomarcatori, 19 tessuto cerebrale, 3,18,20 tessuto polmonare, 18 tessuto renale, 18 tessuto testicolo, 18 ghiandole surrenali, 17 tavole cromatografia su strato sottile, 21 e superfici di alghe. 22 La risoluzione di routine di immagini ottenute da DESI-MSI è 100-200 micron, che è in ultima analisi determinati dalla superficie effettiva estratta dallo spray, ma sono stati riportati risoluzioni a partire da 40 micron. 23-25 ​​Tale risoluzione e facilità di analisi rende DESI-MSI appropriato per l&#39;analisi rapida e semplice di campioni biologici di tessuto con superfici in cm 2 gamma 0.5-5, che consentono l&#39;acquisizione di preziose informazioni territoriali per meglio comprendere i processi biologici 26. Qui, come esempio di una tipica applicazione DESI-MSI, passiamo in rassegna i dettagli procedurali di condurre un esperimento di successo che coinvolge l&#39;imaging dei lipidi nei tessuti cerebrali di ratto. Le due fasi più critiche del protocollo sono laPreparazione del tessuto 27 e ottimizzazione della sorgente ionica DESI, come descritto di seguito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura-Finetek</td>
			<td>4583</td>
			<td><a href="http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48" target="_blank">http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&amp;subcat=48</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0156-6</td>
			<td>OmniSolv, LC-MS Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695092-500 ml</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CryoStar* NX70</td>
			<td>Any available microtome can be used for tissue sectioning <a href=" http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar" target="_blank"> http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&amp;groupType=PRODUCT&amp;searchType=0&amp;storeId=11152&amp;from=search&amp;ca=cryostar</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Omni Spray;DESI Spray Head</td>
			<td>Prosolia Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Can also use the 2-D Omni Spray; Source kit instead of assembling components of imaging experiment <a href=" http://www.prosolia.com/sources.php" target="_blank"> http://www.prosolia.com/sources.php</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>High Voltage Power Supply</td>
			<td>Stanford Research Systems, Inc.</td>
			<td>PS350/5000V-25W</td>
			<td><a href="http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm" target="_blank">http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rope heater, RTD, controller</td>
			<td>Omega</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters" target="_blank">http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&amp;book=Heaters</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>Version 7.1 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Translational stage</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Optiscan II</td>
			<td><a href="http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html" target="_blank">http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html</a></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AccuTOF Mass Spectrometer</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JMS-T100LC</td>
			<td>Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

imaging of biological tissues by desorption electrospray ionization mass spectrometry

La spettrometria di massa di imaging (MSI) fornisce informazioni non mirata molecolare con la più alta specificità e la risoluzione spaziale per studiare i tessuti biologici presso le centinaia a decine di scala micron. Quando eseguito in condizioni ambiente, pretrattamento del campione diventa inutile, semplificando così il protocollo mantenendo l&#39;elevata qualità delle informazioni ottenute. Desorbimento ionizzazione elettrospray (DESI) è una tecnica MSI ambient spruzzo-based che consente il campionamento diretto di superfici all&#39;aperto, anche in vivo. Quando utilizzato con una fase campione comandato da software, il campione viene rastered sotto la sonda di ionizzazione DESI, e attraverso il dominio del tempo, m / z informazione è correlata con la specie chimica &#39;distribuzione spaziale. La fedeltà dell&#39;uscita DESI-MSI dipende dall&#39;orientamento sorgente e posizionamento rispetto alla superficie del campione e l&#39;ingresso spettrometro di massa. Qui, esaminiamo come preparare sezioni di tessuto per DESI iMAGING e condizioni sperimentali aggiuntive che influenzano direttamente la qualità dell&#39;immagine. In particolare, si descrive il protocollo per l&#39;imaging di sezioni di tessuto cerebrale di ratto da DESI-MSI.

La figura 3 mostra uno spettro rappresentativa risultante da una sezione di cervello di ratto non trattato. Nel modo positivo, lo spettro di massa è dominato da fosfatidilcoline causa delle loro elevate efficienze di ionizzazione (attribuire al gruppo di ammonio quaternario carica positiva). L&#39;immagine complessiva ione della sezione di tessuto è anche mostrato in Figura 3, che mostra segnale abbondante attraverso l&#39;intera sezione cervello. Lipidi chiave individuati sono identi...

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Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all&#39;interno di sezioni di tessuto.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

imaging-biological-tissues-desorption-electrospray-ionization-mass

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.4K Views.  Georgia Institute of Technology. Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all'interno di sezioni di tessuto.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for sample pretreatment. The method was first described by Fenn and colleagues1 and has been applied to the detection of illicit drugs2 and explosives3-4, the characterization of skin volatiles5, and the analysis of breath6-7.
SESI ionization occurs by proton transfer reactions between the electrospray solution and the volatile analyte, and is therefore suitable for the analysis of hetero-organic molecules, just as in traditional electrospray ionization (ESI). However, unlike standard ESI, the proton transfer process of SESI occurs in the vapor phase rather than in solution (Fig. 1), and therefore SESI is best suited for detecting organic volatiles and aerosols.
We are expanding the use of SESI-MS to the detection of bacterial volatiles as a method for bacterial identification and characterization8. We have demonstrated that SESI-MS volatile fingerprinting, combined with a statistical analysis method, can be used to differentiate bacterial genera, species, and mixed cultures in a variety of growth media.8 Here we provide the steps for obtaining bacterial volatile fingerprints using SESI-MS, including the instrumental parameters that should be optimized to ensure robust bacterial identification and characterization.

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) enables the detection of volatile organic compounds (VOCs) without the need for any sample pretreatment. This protocol provides instructions for the rapid (within minutes) characterization of bacterial VOCs using SESI-MS.

Volatili che caratterizzano batterica secondaria utilizzando Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

Ricerca

Bioingegneria

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

Ad alta risoluzione di immagini 3D Ex-Vivo I campioni biologici da Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caratterizzazione qualitativa della frazione acquosa da idrotermale Liquefazione di alghe Utilizzando 2D gascromatografia con tempo di volo spettrometria di massa

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa