Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health R01HL086939 concedere (NCC).

In questo protocollo dimostriamo un caso isolato, ventilato, perfusi preparazione del polmone del mouse che in precedenza è stato utilizzato per quantificare l&#39;impatto di embolia polmonare e l&#39;ipossia cronica pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni (Tuchscherer, Webster e Chesler, 2006; Tuchscherer et al ., 2007). In breve, i polmoni del mouse sono chirurgicamente isolato nei tessuti circostanti, posto in una camera riscaldata (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) e ventilato (ventilatoria Modulo di controllo (VCM)-R con modulo timer di conteggio (TCM); Harvard gli apparecchi). La vascolarizzazione del polmone è perfuso con RPMI 1640 riscaldato mezzo di coltura cellulare con il 3,5% Ficoll utilizzando una pompa a siringa (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) per generare il costante flusso di forme d&#39;onda o una pompa ad alta frequenza oscillatoria (Bose-Electro Force, Eden Prairie, MN), in parallelo con la pompa a siringa per creare forme d&#39;onda pulsatile del flusso vascolare polmonare. Trasduttori di pressione (P75, Harvard Apparatus), misurare la pressione istantanea arteriosa polmonare (PAP) e la pressione atriale sinistra (LAP). Portata istantanea (Q) è misurata con un filtro in linea flussometro (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Pulsatile della pressione del flusso rapporti sono derivati ​​da queste misurazioni, che forniscono informazioni sulle vascolare polmonare fisiologia e patologia e post-carico del ventricolo destro. 1. Attrezzatura: <ol><li> Polmone isolato di set-up compreso ventilatore del mouse </li><li> Sistema di acquisizione dati e computer con programma LabView </li><li> Due trasduttori di pressione e misuratore di portata per il flusso perfusato </li><li> Trasduttore di pressione e flussometro (pnemotachometer) per il flusso delle vie aeree </li><li> Pompa ad alta frequenza oscillatoria e computer con programma di test Win </li><li> Boom / zoom microscopio, lampada </li><li> Bagno di riscaldamento con pompa ad alta velocità per IL-1 sistema </li></ol> 2. Preparazione del sistema di IL-1 <ol><li> Acqua distillata riscaldata a 37 ° C con il bagno di riscaldamento viene fatta circolare verso l&#39;interno del sistema di IL-1. </li><li> Tutte le pompe, trasduttori e l&#39;IL-1 cannula sono collegati mediante tubazioni pulite e tutti i tubi viene lavata con acqua distillata riscaldata a 37 ° C. Bolle d&#39;aria, che poteva viaggiare nei polmoni e causare edema, deve essere rimossa. Tubazione dalla pompa di flusso oscillatorio al sensore di flusso e dal sensore di flusso alla cannula arteria polmonare sono lavata con PBS 1%. </li><li> Il P75 trasduttori di pressione sono azzerati chiudendo la valvola alla cannula, aprendo le valvole per l&#39;atmosfera e poi premendo il pulsante automatico a zero sull&#39;amplificatore PLUGSYS. Poi, la valvola per l&#39;atmosfera è chiusa e la valvola per la cannula aperta. </li><li> Il pezzo di ceramica porosa nel percorso di ventilazione del sistema di IL-1 è bagnata per fornire umidità. </li></ol> 3. Soluzioni <ol><li> Preparare il 3,5% in volume Ficoll-RPMI soluzione sterile e filtro dei media. Filtraggio dei media assicura l&#39;assenza di particelle più grandi che potrebbero involontariamente embolizzare del polmone. L&#39;utilizzo di supporti sterili riduce anche la probabilità di edema improvviso sviluppo nel polmone. Riempire una siringa da 10 ml con RPMI per la chirurgia e una siringa da 60 ml con RPMI per ogni prova sperimentale. Riscaldare il perfusato in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Preparare 1 ml di eparina peso corporeo 500IU/100g del mouse (approssimativa). Il sale è 158IU/mg eparina. Per un topo ~ 25 g, mix di 1,25 mg di sale eparina con la soluzione 1ml PBS in una provetta di piccole dimensioni. </li></ol> 4. Ventilazione di un mouse <ol><li> Dopo un&#39;iniezione intraperitoneale di 150 mg pentobarbital in soluzione per chilogrammo nel mouse, assicurarsi profonda anestesia eseguendo un pizzico duro con una zampa. Se non c&#39;è reazione, preparare il mouse per un intervento chirurgico da appuntare le sue zampe anteriori di sughero per la stabilità. Nota: In tutta la profondità dell&#39;anestesia esperimento è monitorato osservando attentamente l&#39;animale. I perni in zampe e incisioni frequenti agiscono come stimoli nocivi, la mancanza di risposta a conferma che l&#39;animale rimane in un piano chirurgico di anestesia. </li><li> Spray al petto con il 95% di alcool per bagnare la pelliccia e l&#39;uso forcipe dritto per afferrare la pelle del collo. Taglio di 1 cm di apertura nella pelle usando le forbici diritte. </li><li> Una volta che l&#39;interno del collo è esposta, rimuovere tutto il tessuto ghiandolare e bianco muscolare superficiale, cercando l&#39;esofago e la trachea. Isolare l&#39;esofago e trachea dal tessuto su entrambi i lati e posteriormente. </li><li> Inserire la pinza piegata piccolo sotto la trachea e afferrare un pezzo di sutura sul lato opposto. Tirare la sutura sotto la trachea e un nodo allentato chirurghi. Non stringere la sutura o legare il nodo. </li><li> Tagliare un piccolo angolo &quot;v&quot; nella trachea, con piccole forbici, non tagliare tutto il percorso attraverso la trachea. Spostare la bacheca di sughero e il mouse per il riscaldamento di IL-1 sistema. Usando i due pinze smussato, afferrare la cannula tracheale e la trachea sotto la &quot;v&quot;. Quindi, far scorrere la cannula tracheale in tracheostomiaEA attraverso l&#39;apertura &quot;v&quot;. Stringere la sutura intorno trachea e cannula tracheale per fissare la cannula all&#39;interno della trachea. Legare il nodo. </li><li> Iniziare la ventilazione (50% ispirazione, 90 atti / min, con inspirazione profonda) con aria ambiente. </li></ol> 5. Perfusione di un mouse ventilato 5.1. Accedi al ventricolo destro per iniettare eparina <ol><li> Spray al petto del mouse con l&#39;alcol nuovamente per bagnare la pelliccia. Togliere tutta la pelle sul petto sopra le costole con pinze e forbici dritto dritto. Taglio verso l&#39;alto lungo lo sterno. Sollevare la pelle su ogni lato e poi tagliare la pelle seguendo la linea delle costole inferiori. </li><li> Afferrare il processo xifoideo alla base dello sterno con una pinzetta e un foro nella membrana usando le forbici diritte. Afferra il diaframma con le pinze e tagliare fuori le costole. </li><li> Afferrare il processo xifoideo di nuovo con le pinzette (mano sinistra) e utilizzare la palla-punta, forbici angolate per tagliare lo sterno e costole attraverso, facendo attenzione a non tagliare i polmoni, il cuore oi vasi sanguigni (utilizzare la palla punta su le forbici per guidare l&#39;utente). Ci sarà del sangue, ma fintanto che la punta di diamante delle forbici è contro lo sterno, il cuore ei polmoni non saranno tagliati. </li><li> Afferrare le costole sul lato sinistro e tagliare via il più delle costole come necessario per esporre il cuore. Iniettare lentamente il ventricolo destro con 0,1 ml di soluzione di eparina. Questo passaggio è importante per prevenire coaguli di sangue nel polmone, che danneggiano le cellule endoteliali e potrebbe compromettere la perfusione. L&#39;eparina deve essere iniettato, mentre il cuore batte ancora. </li></ol> 5.2. Cannulate la principale arteria polmonare <ol><li> Tagliare via il resto delle costole (lato destro e sinistro) utilizzando la parte posteriore (arrotondati) fine del forcipe per spingere delicatamente i polmoni dalla parete toracica. Afferrando i polmoni stessi danneggiare il delicato tessuto. Contatto accidentale tra le punte a forbice e il tessuto polmonare anche causare danni. </li><li> Spostare il microscopio in posizione più polmonare. Tagliare il tessuto ghiandolare e adiposo nella parte superiore del cuore. Utilizzare le pinzette per tirare via dalle arterie e le vene e poi tagliare con le forbici a molla, mentre il tessuto è in tensione. </li><li> Utilizzando un altro insieme schietto di pinzette, scoop da destra a sinistra dalla parte superiore del cuore sotto atrio sinistro / ventricolo per ottenere la punta delle pinzette sotto l&#39;aorta e l&#39;arteria polmonare (PA). Procedere con cautela, non ci dovrebbe essere la resistenza alle pinzette. Utilizzando smussato pinzette riduce la probabilità di pungere accidentalmente l&#39;arteria polmonare o dell&#39;aorta. </li><li> Una volta che la punta pinzetta è sotto l&#39;aorta e PA, afferrare un pezzo di sutura e tirare attraverso. Un nodo allentato chirurghi. Non stringere la sutura o legare il nodo. </li><li> Opzionale: utilizzare le forbici angolate per rimuovere la metà inferiore del corpo. Ridurre attraverso le costole e colonna vertebrale; taglio l&#39;aorta e vena cava causerà una notevole quantità di sangue di fluire - utilizzare un Q-tip per arrestare il flusso. Mettere in un sacco per lo smaltimento. </li><li> Primo PA cannula con 4 ml di una siringa da 10 ml di RPMI. Doppia controllare che tutti i tubi è libero di bolle d&#39;aria. Perfusione del polmone con acqua distillata o bolle si tradurrà in edema. </li><li> Tagliare una piccola tacca nella parete del ventricolo destro libero e inserire la cannula PA, puntando verso il basso e verso destra. La punta della cannula deve essere visibile attraverso la parete trasparente della PA. Infondere una piccola quantità di RPMI per confermare la posizione. Stringere la sutura intorno alla cannula aortica, e PA e legare il nodo. Si noti che a questo punto, l&#39;aorta è anche legata off in modo perfusione reale non dovrebbe iniziare fino a quando l&#39;atrio sinistro è cannulata. </li></ol> 5.3. Cannulate l&#39;atrio sinistro <ol><li> Tagliare una tacca nella parte inferiore del ventricolo sinistro e la sinistra inerte atriale (LA) cannula, puntando verso l&#39;alto. Leggera pressione può essere necessaria per aprire la valvola mitrale in questa direzione. Nella posizione corretta, la punta della cannula scivolerà attraverso ed essere sicura senza sutura. </li></ol> 5.4. Iniziare la perfusione <ol><li> Manualmente infondere RPMI dalla siringa da 10 ml a 0,3 ml al minuto fino a quando RMPI è evidente nel tubo deflusso (rosa-ish colore in contrasto con la chiara PBS). Se non c&#39;è flusso nel tubo di deflusso, riposizionare la cannula Los Angeles. Se non efflusso possono essere ottenuti con ri-posizionamento, verificare la presenza di una perdita in arteria polmonare. Una perdita di strappo o in arteria polmonare non possono essere riparati, questo è il motivo per interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Collegare una siringa da 60 ml per la cannula PA attraverso il sistema di IL-1 e iniziare l&#39;infusione 1ml/min di perfusato, controlli per individuare perdite e assicurandosi che i polmoni diventano bianchi, che dimostra che RPMI sta sostituendo il sangue nei polmoni. Profumato con flusso lento per due minuti. </li></ol> 6. Misura pulsatile e costante pressione polmonare-Flow Relazioni <ol><li> Per gli studi di flusso pulsatile, in primo luogo gli oscillatori spostamenti del pistone della pompa ai livelli desiderati per ogni frequenza nel WinTest programma basato su esperimenti precedenti. Variabilità a causa della struttura del polmone e della meccanica, gli spostamenti devono essere adattati per ogni mouse. Impostare flusso costante al livello desiderato. Aprire la valvola alla pompa oscillatorio e iniziare la registrazione dei dati a destra prima di eseguire il profilo oscillatorio flusso (programma Wintest). Aprire il file di dati e tracciare il flusso sperimentale (Q) in Excel. Regolare il oscillatorio spostamenti del pistone della pompa ad ogni frequenza (programma Wintest) in modo che Q max e Q min sono come desiderato. </li><li> Per gli studi flusso costante, chiudere la valvola alla pompa oscillatorio. Se questa valvola viene lasciata aperta, la pompa oscillatorio si comporta come un condensatore, attenuare i cambiamenti da una portata all&#39;altra. Raccogliere dati per almeno 10 secondi ad ogni portata o fino a quando la pressione PA non varia di oltre il 5%. </li><li> Per misure di portata sia pulsatile o continuo, ventilazione vecchio ad una pressione costante prima raccolta dei dati. Riprendere la ventilazione immediatamente dopo la raccolta dei dati. </li><li> Guarda per RPMI nel tubo delle vie aeree, questa è la prova di edema ed è motivo di interrompere l&#39;esperimento. Inoltre, non lasciare che RPMI raggiungere la pressione delle vie aeree o sensori di flusso, perché danneggia i trasduttori. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Rappresentante Risultati costante: Nel polmone isolato set-up lo sperimentatore ha la capacità di controllare indipendentemente non solo la portata Q polmonare ma anche LAP pressione delle vie aeree pressione P dell&#39;aria e dell&#39;atrio sinistro. Questo è vantaggioso perché Q, P aria e LAP influenzare il sistema vascolare polmonare e la conseguente pressione arteriosa polmonare PAP. Un altro vantaggio è che i risultati ottenuti sono indipendenti dal sistema nervoso simpatico tono 1, stato del volume, e l&#39;anestesia 2. Cambiamenti indotti dal PAP gradini cambiamenti in Q fissa per P aria e fisso o variabile LAP sono mostrati in Figura 1. Si noti che nella preparazione del polmone isolato, la cannula LAP è tipicamente collegato a tubi che dirige il perfusato in un contenitore dei rifiuti. Con questo tubo in posizione, LAP è linearmente dipendente da causa di flusso di Poiseuille Q. Tuttavia, l&#39;altezza della presa e il contenitore dei rifiuti può essere regolata manualmente per fornire una costante, diverso da zero LAP o il tubo può essere rimossa per consentire a zero LAP che è indipendente da Q. Rappresentante Risultati pulsatile: Mentre il flusso pulsatile forme d&#39;onda arbitrarie possono essere generati con questo sistema, che tipicamente generano il flusso della forma Q = 3 + 2 peccato (2 f πt) ml / min a frequenze di f = 1, 2, 5, 10, 15 e 20 Hz per valutare l&#39;impedenza linearizzata del sistema vascolare polmonare (Figura 2: pannello superiore). Dalle misure conseguenti PAP, LAP e Q, grandezza impedenza vascolare polmonare (Z) e di fase (θ) sono calcolati in primo luogo un ciclo completo di decomposizione sinusoidale di AP = PAP-LAP e Q ad ogni frequenza imposto sinusoidale portata in una serie di armoniche sinusoidali usando una trasformata di Fourier. Il rapporto tra la pressione di trasformare il flusso dei rendimenti trasformare l&#39;impedenza polmonare vascualar, PVZ = FFT (AP) / FFT (Q), che ha ampiezza e la fase Z θ. Impedenza di ingresso Z 0, impedenza caratteristica Z C e indice di riflessione delle onde R W, sono calcolati dalla magnitudine impedenza. In particolare, Z 0 è calcolata da Z a 0 armonica (f = 0 Hz) media su tutte le frequenze, Z C viene calcolato come la media di Z tra il primo minimo (5 Hz) e 20 Hz, W e R si calcola come (Z 0-Z C) / (Z 0 + Z C) 3. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 costante flusso di forme d&#39;onda (riga superiore) e pressioni che ne derivano. (Seconda fila: PAP, P aria, LAP) in funzione del tempo con diverse combinazioni di LAP e aria P. La riga in basso mostra PAP vs D. (A) e (B), LAP aumenta e diminuisce con Q perché il tubo di deflusso è stato al suo posto. Questo tubo è stato rimosso per (C) in modo che LAP è costante e indipendente da Q. In (D) e (E) l&#39;altezza del tubo di uscita è stata regolata manualmente in modo che LAP è superiore, ma indipendente da D. P aria sia a end-inspiratoria (A, C, D) o di fine espirazione (B, E) la pressione. <img src="/files/ftp_upload/2690/2690fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2 pulsatile del flusso d&#39;onda Q (pannello superiore) e la pressione risultante (pannello inferiore: PAP, LAP e P aria). In funzione del tempo. Da queste pulsatile pressione polmonare flusso delle relazioni, PVZ può essere calcolato, che riflette il totale post-carico del ventricolo destro.

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+vascular+remodeling+in+isolated+mouse+lungs:+Effects+on+pulsatile+pressure-flow+relationships.">Pulmonary vascular remodeling in isolated mouse lungs: Effects on pulsatile pressure-flow relationships.</a> Journal of Biomechanics. 40, 993-1001 (2007).</li><li>Vanderpool, R., Naeije, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impedance+in+Isolated+Mouse+Lungs+for+the+Determination+of+Site+of+Action+of+Vasoactive+Agents+and+Disease.">Impedance in Isolated Mouse Lungs for the Determination of Site of Action of Vasoactive Agents and Disease.</a> Ann Biomed Eng. , (2010).</li><li>Vanderpool, R., Kim, A., Molthen, R., Chesler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+rho+kinase+inhibition+on+chronic+hypoxia-induced+changes+in+proximal+and+distal+pulmonary+arterial+structure+and+function.">Effects of acute rho kinase inhibition on chronic hypoxia-induced changes in proximal and distal pulmonary arterial structure and function.</a> Journal of Applied Physiology. , (2010).</li><li>El-Bizri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+protein+22alpha-mediated+patchy+deletion+of+Bmpr1a+impairs+cardiac+contractility+but+protects+against+pulmonary+vascular+remodeling.">Smooth muscle protein 22alpha-mediated patchy deletion of Bmpr1a impairs cardiac contractility but protects against pulmonary vascular remodeling.</a> Circ Res. 102, 380-388 (2008).</li><li>Champion, H., Michelakis, E., Hassoun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+invasive+and+noninvasive+approach+to+the+right+ventricle-pulmonary+circulation+unit:+state+of+the+art+and+clinical+and+research+implications.">Comprehensive invasive and noninvasive approach to the right ventricle-pulmonary circulation unit: state of the art and clinical and research implications.</a> Circulation. 120, 992-1007 (2009).</li><li>Gan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasively+assessed+pulmonary+artery+stiffness+predicts+mortality+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Noninvasively assessed pulmonary artery stiffness predicts mortality in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 132, 1906-1912 (2007).</li><li>Mahapatra, S., Nishimura, R., Sorajja, P., Cha, S., McGoon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+pulmonary+arterial+capacitance+and+mortality+in+idiopathic+pulmonary+arterial+hypertension.">Relationship of pulmonary arterial capacitance and mortality in idiopathic pulmonary arterial hypertension.</a> J Am Coll Cardiol. 47, 799-803 (2006).</li><li>Bogaard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+artery+pressure+elevation+is+insufficient+to+explain+right+heart+failure.">Chronic pulmonary artery pressure elevation is insufficient to explain right heart failure.</a> Circulation. 120, 1951-1960 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici della chirurgia E &#39;fondamentale che si fa attenzione quando si taglia la gabbia toracica lontano dai polmoni. I polmoni devono essere completamente esposti e disinibito da parte dei tessuti circostanti durante l&#39;inflazione, ma non danneggiate durante il processo di isolamento. L&#39;uso di un oggetto piatto come il back-end della pinza può essere utilizzata per tenere il polmone dalla parete toracica modo che ci sia un percorso chiaro per le forbici per tagliare. Un al...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-829-10F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>14-823-2A </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>13-689-8 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RPMI with GLN 6/PK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>MT10040CV </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bottle Top Filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Sci</td>
<td>09-761-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll PM 70</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2878-100g</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Y27632</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Y0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Angled Ball Iris scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14109-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas Spring Scissors - 4mm Blades</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15018-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Iris Scissors - straight</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14106-09</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont Medical Biology Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11254-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lauda E100 ECO-line 003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>Comparable to Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IL-1 Isolated perfused mouse lung system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus </td>
<td>739904 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>730020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TS410 Flow Modules</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic </td>
<td>TS410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ME 4 PXN Precision PXN Inline Flowsensors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Transonic</td>
<td>ME 4 PXN</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cole-Parmer Multi-Syringe Pumps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer </td>
<td>EW-74900-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nembutal 50MG/ML 20ML Vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amatheon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

characterization of the isolated, ventilated, and instrumented mouse lung perfused with pulsatile flow

L&#39;isolato, ventilato e strumentato preparazione polmone del mouse permette di costante e pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni deve essere misurata con un controllo indipendente sulla portata polmonare arteriosa, frequenza delle forme d&#39;onda di flusso, pressione delle vie aeree e la pressione atriale sinistra. Resistenza vascolare polmonare è calcolata in base multi-punto, la pressione costante flusso di curve; impedenza vascolare polmonare viene calcolata la pressione del flusso pulsatile curve ottenute in una gamma di frequenze. Come ormai riconosciuto clinicamente, l&#39;impedenza è una misura superiore del post-carico del ventricolo destro di resistenza in quanto include gli effetti della compliance vascolare, che non sono trascurabili, soprattutto nella circolazione polmonare. Tre parametri importanti di impedenza - zero hertz impedenza Z 0, la caratteristica di impedenza Z C, e l&#39;indice di riflessione delle onde R W - fornire una conoscenza distale delle arterie sezione trasversale a disposizione per il flusso, prossimale rigidità arteriosa e l&#39;impedenza a monte ea valle mancata corrispondenza, rispettivamente. Tutti i risultati ottenuti in isolato, ventilato e polmoni perfusi sono indipendenti dal tono simpatico del sistema nervoso, lo stato del volume e gli effetti dell&#39;anestesia. Abbiamo usato questa tecnica per quantificare l&#39;impatto di embolia polmonare e l&#39;ipossia cronica sulla resistenza e impedenza, e di distinguere tra i siti di azione (cioè, prossimale distale rispetto) di agenti vasoattivi e le malattie usando la dipendenza della pressione di Z C. Inoltre, quando queste tecniche sono utilizzate con i polmoni di ceppi di topi geneticamente modificati, gli effetti a livello molecolare dei difetti vascolari polmonari struttura e la funzione può essere determinato.

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Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Il protocollo seguente delinea il processo di isolamento, ventilazione e strumentazione polmoni del mouse su misura stabile o pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni al fine di quantificare gli effetti del flusso sanguigno, flusso d&#39;aria, i cambiamenti delle vie aeree e sui cambiamenti vascolari post-carico del ventricolo destro.

Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

characterization-isolated-ventilated-instrumented-mouse-lung-perfused

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  University of Wisconsin – Madison. Il protocollo seguente delinea il processo di isolamento, ventilazione e strumentazione polmoni del mouse su misura stabile o pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni al fine di quantificare gli effetti del flusso sanguigno, flusso d'aria, i cambiamenti delle vie aeree e sui cambiamenti vascolari post-carico del ventricolo destro.

Video: Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Ricerca

Biologia

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3. On the macro scale the stiffness of tissues and organs within the human body span several orders of magnitude4. Much less is known about how stiffness varies spatially within tissues, and what the scope and spatial scale of stiffness changes are in disease processes that result in tissue remodeling. To better understand how changes in matrix stiffness contribute to cellular physiology in health and disease, measurements of tissue stiffness obtained at a spatial scale relevant to resident cells are needed. This is particularly true for the lung, a highly compliant and elastic tissue in which matrix remodeling is a prominent feature in diseases such as asthma, emphysema, hypertension and fibrosis. To characterize the local mechanical environment of lung parenchyma at a spatial scale relevant to resident cells, we have developed methods to directly measure the local elastic properties of fresh murine lung tissue using atomic force microscopy (AFM) microindentation. With appropriate choice of AFM indentor, cantilever, and indentation depth, these methods allow measurements of local tissue shear modulus in parallel with phase contrast and fluorescence imaging of the region of interest. Systematic sampling of tissue strips provides maps of tissue mechanical properties that reveal local spatial variations in shear modulus. Correlations between mechanical properties and underlying anatomical and pathological features illustrate how stiffness varies with matrix deposition in fibrosis. These methods can be extended to other soft tissues and disease processes to reveal how local tissue mechanical properties vary across space and disease progression.

The stiffness of the extracellular matrix strongly influences multiple behaviors of adherent cells. Matrix stiffness varies spatially throughout a tissue, and undergoes modification in various disease conditions. Here we develop methods to characterize spatial variations in stiffness in normal and fibrotic mouse lung tissue using atomic force microscopy microindentation.

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One of the primary risk factors of EAC is Barrett&#8217;s esophagus (BE), a metaplastic change of the normal squamous esophagus in response to chronic heartburn. Despite the well-established connection between EAC and BE, interrogation of the molecular events, particularly altered signaling pathways involving progression of BE to EAC, are poorly understood. Much of this is due to the lack of suitable in vitro models available to study these diseases. Recently, immortalized BE cell lines have become commercially available allowing for in vitro studies of BE. Here, we present a method for immunofluorescent staining of immortalized BE cell lines, allowing in vitro characterization of cell signaling and structure after exposure to therapeutic compounds. Application of these techniques will help develop insight into the mechanisms involved in BE to EAC progression and provide potential avenues for treatment and prevention of EAC.

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

There is a discernible need for improved information on molecular drivers of Barrett&#8217;s Esophagus. Immunofluorescent staining is a useful technique for understanding the effects of cell signaling on cell morphology. We present a simple, effective protocol for the use of immunofluorescent staining to assess therapeutic treatment in Barrett&#8217;s Esophagus cells.

Un metodo di immunofluorescenza per la caratterizzazione di cellule esofago di Barrett

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Fenotipizzazione mouse Pulmonary Function<em&gt; In Vivo</em&gt; Con la capacità polmonare Diffusione

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplicazione tramite flusso Cytometry di tubero isolato protoplasti di misura

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare