Gli autori desiderano ringraziare Zoiray Technologies Inc., una co-sponsor e partner di commercializzazione, per il suo sostegno.

1. Preparazione del substrato <ol><li> Cappotto a strati di silicio SiO 2 supporti con auto-adsorbente copolimeri (DMA-NAS-MAPS): <ol><li> Sintesi di copolimero, struttura chimica e processo di rivestimento sono pubblicati in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Caratterizzazione di rivestimento in polimero adsorbito per DNA vetrini microarray. Anale. Chem. 2004, 76, 1352-1358. </li><li> In breve, preparare la soluzione di polimeri con l&#39;aggiunta di 100 mg di polimero a 5 ml di acqua deionizzata (DI) acqua e aggiungere 5 ml di solfato di ammonio al 40% saturi ((NH 4) 2SO 4) la soluzione per raggiungere una concentrazione finale di 0,92 M. </li><li> Chip Immergere in soluzione per 30 minuti su un agitatore e poi sciacquare abbondantemente con acqua deionizzata. Asciugare accuratamente con Argon / N 2 gas. </li><li> Chip Cuocere in forno a 80 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Conservare con rivestimento polimerico substrati / chip in un ambiente asciutto (essiccatore a vuoto) per un massimo di 3 mesi fino alla sonda spotting procedura. </li></ol> 2. Preparazione di Array Sonda: anticorpi, antigeni, ss / dsDNA, RNA, ecc <ol><li> Diluire sonda (s) a concentrazione adeguata nel buffer desiderato. Questa fase può essere variare notevolmente, ma un tipico esperimento utilizza antigene o IgG ad una concentrazione di 0,5 mg / ml (range da 0,1 -1 mg / mL) in tampone fosfato (PBS) a pH ≈ 7.4. </li><li> Luogo soluzioni in un 96 - o 384-pozzetti (o la targa fonte standard per la spotter in uso) </li><li> Impostazione parametri per spotting desiderato serie stampato: determinare i parametri appropriati spotting per la superficie e le soluzioni in uso (tempi di sosta, velocità di avvicinamento, ecc.) Determinare il numero di repliche di ogni condizione per griglia, il layout della griglia, il numero di griglie di replicare, e la posizione desiderata spotting sul chip. Substrati luogo e la piastra fonte nelle posizioni appropriate, verificare che le bottiglie dei rifiuti e la fornitura sono pronti, e iniziare a eseguire la stampa. </li><li> Dopo spotting è finito substrati svolge in un ambiente di elevata umidità durante la notte (4-18 ore) per consentire processo di immobilizzazione e la disattivazione di procedere. </li><li> Lavare substrati: metterli in le seguenti soluzioni per tre minuti per tre lavaggi separati: PBS con 0,1% Tween (PBST), PBS e infine deionizzata (DI). A seconda del tipo di esperimento (umido rispetto a secco), il chip asciugare accuratamente con gas Argon e iniziare l&#39;incubazione o posto il chip in una camera di flusso e assemblare. </li><li> Disattivare rimanenti gruppi NHS sulla superficie copolimero immergendo i chip in una soluzione 50 mM di etanolamina con il pH regolato a 7,4 per 30 minuti, mentre su un piatto shaker. Un primario ammina composto contenente come idrossilammina o Tris può anche essere usato, purché la soluzione preparata è sicuro da usare con le proteine. Sciacquare la soluzione di disattivazione utilizzando PBS poi acqua deionizzata. </li><li> Passaggio facoltativo (a seconda della chimica di superficie è occupata): superficie di blocco utilizzando una soluzione di BSA, caseina, o latte reidratato per 30 minuti. Per la chimica attuale superficie polimerica che usiamo, non eseguire questo passaggio come la spina dorsale polimero atti a prevenire le non-specifico legame con le proteine. </li></ol> 3. Acquisizione Dati e incubazione Procedura: formato Endpoint <ol><li> Ottenere una soluzione del target di interesse nel buffer desiderato. Qui, sarà una soluzione della concentrazione appropriata di anti-BSA in PBS (es: fare ML 1-10 di 10 ng / mL di soluzione di Anti-BSA in PBS). Inoltre, assicurarsi di avere una quantità equivalente di tampone (senza obiettivo) per l&#39;incubazione di controllo negativo. </li><li> Prendete una scansione specchio di silicio per la normalizzazione di tutti i dati successivamente raccolti. </li><li> Scansione dell&#39;array preparato sonda con il sistema IRIS prima della fase di incubazione per determinare l&#39;altezza iniziale ottico (massa) ad ogni punto. Ciò consentirà di un&#39;adeguata analisi delle variazioni di massa sulla superficie, ossia il livello di legame, dopo l&#39;incubazione. Qui, alcuni parametri saranno modificate per l&#39;esperimento in corso, come il tempo di esposizione, campo di vista, concentrandosi prospera, ecc </li><li> Immergere chip (s) in soluzione preparata per 1 ora su un piatto shaker. Il tempo di incubazione può variare notevolmente a seconda del livello di agitazione, la concentrazione del target di essere rilevato, le caratteristiche di trasporto della camera di flusso (se in tempo reale la modalità di rilevazione viene utilizzato), le affinità del target-sonda di coppia, ecc . </li><li> Dopo l&#39;incubazione, ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 2.5) </li><li> Scansione dello stesso array sonda utilizzando il sistema IRIS e ottenere post-incubazione delle immagini per la pre-incubazione confronto. </li><li> Ripetere questo processo per le fasi di incubazione diverso se necessario, ad esempio in un formato saggio a sandwich in cui un anticorpo secondario viene utilizzato. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Montare le immagini raccolte per ogni scansione IRIS (sequenza di immagini di intensità), utilizzando il laboratorio sviluppato un software di proprodurre un&#39;immagine della serie sonda contenente informazioni ottiche spessore. Una rapida analisi qualitativa del legame può essere effettuata sottraendo (registrati) post e pre-incubazione delle immagini. Vincolanti apparirà come un cambiamento di intensità in quei punti in cui sono state osservate variazioni di massa. Per l&#39;analisi quantitativa, determinare la densità di massa di ciascun punto rispetto al fondo facendo la media informazioni ottiche spessore per ogni pixel all&#39;interno di un luogo e un anello al di fuori del posto e facendo un confronto diretto di queste due aree. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La Figura 1 mostra uno schema esempio di strati Si-SiO 2 substrato IRIS macchiato con una vasta rappresentanza degli anticorpi. Ogni ensemble anticorpo è macchiato di replicare con specificità per un epitopo diverso targeting proteine ​​diverse. Due virus diversi intero e una proteina virale sono rappresentati come bersagli esempio. Anticorpi di controllo negativo dipende dal dosaggio e può essere non-specifici e / o virus-specifici. La Figura 2 mostra il legame di albumina sierica umana (HSA)-anticorpi specifici per una serie di gattuccio HSA e IgG di coniglio (controllo) punti. Come si vede qui, dopo il montaggio e la determinazione delle ottico spessori per le immagini pre-e post-incubazione, un&#39;immagine differenza per l&#39;array legame può essere creato per valutare qualitativamente vincolanti. L&#39;analisi quantitativa rivela che un 2,05 e 0,13 nanometri variazione media altezza ottica è stata osservata per la HSA e il coniglio IgG punti, rispettivamente, per un anti-HSA incubazione concentrazione di 500 ng / ml. La figura 3 mostra una misurazione IRIS di dipendenza Fur legame con le proteine ​​sulla concentrazione delle proteine ​​e la lunghezza oligomeri dsDNA. Il grafico in alto mostra in assoluto le misure di altezza ottica per altezze oligomero iniziale immobilizzato sonda e post-incubazione vincolante Fur. Concentrazioni crescenti di Fur (50, 100, 200 nM) ha determinato un aumento vincolante per sonde di DNA. La lunghezza del oligomeri impatti anche vincolante pelliccia con sequenze più lunghe con conseguente più vincolanti. Qui, le barre di errore rappresentano una deviazione standard dalla media. Il diagramma in basso mostra calcolato dimero proteine ​​Fur vincolante per ogni filza dsDNA. Dimero vincolante era significativamente aumentata ad una concentrazione di proteine ​​Fur di 200 Nm suggerendo un alto livello di legame non specifico. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schematica di un array sonda esempio normalmente usato in un esperimento per rilevare virus e componenti specifici virale in modo multiplex con il sistema IRIS. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Post-incubazione immagine differenza per il legame di albumina sierica umana anticorpi specifici per macchiato HSA raccolti con questo sistema privo di etichetta ad una concentrazione di 500 ng / mL. La densità di massa biomateriale per ogni spot è determinata calcolando la media dello spessore informazioni ottiche all&#39;interno di un punto e poi confrontandola con la media di un anello intorno al punto che rappresenta lo sfondo. <img src="/files/ftp_upload/2694/2694fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Terreno di associazione dati per le interazioni proteina con pelliccia maculata doppio filamento oligomeri con una sequenza consenso noto in base alla lunghezza oligomero, la posizione della sequenza di consenso all&#39;interno della oligomero, e concentrazione di proteine ​​Fur. Informazioni circa la quantità assoluta di proteine ​​Fur legato a ogni sequenza macchiato (in alto) possono essere usati per stimare il numero di dimeri Fur legato a ogni tipo di oligomeri (in basso).

<ol>
	<li>&#214;zkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+and+dynamic+detection+of+biomolecular+interactions+for+high-throughput+microarray+applications.">Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).</li><li>&#214;zkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+microarray+imaging+for+direct+detection+of+DNA+hybridization+and+single-nucleotide+mismatches.">Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).</li><li>&#214;zkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+reflectance+imaging+for+a+multiplexed,+high-throughput,+label-free,+and+dynamic+biosensing+platform.">Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).</li><li>Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., &#214;zkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., &#220;nl&#246;, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+multiplexed+virus+detection+using+spectral+reflectance+imaging.">Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging.</a> Biosensors and Bioelectronics. , (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La piattaforma IRIS è un sistema semplice e veloce da utilizzare per la raccolta di associazione dati ad alta velocità in un formato microarray. Da covalentemente immobilizzare diverse sonde funzionali proteine ​​o di DNA su una superficie, gli antigeni target / biomarcatori / etc. possono essere catturati da una soluzione, come in un immunodosaggio. Misurazione di queste interazioni tra condizioni sonda in un endpoint o in tempo reale in formato con il sistema IRIS permette di informazioni altamente sensibili e quantitativi da raccogliere per ogni interazione. L&#39;esperimento rappresentante disponibili a questo link è solo un esempio dei tipi di interazioni che possono essere studiati con questa tecnica. Rilevazione dei fattori di trascrizione, antigeni virali e virus intero è stato dimostrato in precedenza e rappresenta solo alcuni esempi dei tipi di analisi che il IRIS può facilmente gestire.

<ol><li> Wafer di silicio con 500 nm di biossido di silicio cresciuto termicamente, nella Silicon Valley Microelectronics, ordine personalizzato <li> Polvere di solfato di ammonio, Sigma-Aldrich cat. # A5132 <li> Tampone fosfato (PBS) concentrato 10X pronto, Fisher Scientific cat. # BP665-1 <li> Anticorpi anti-albumina sierica umana (anti-HSA), Sigma-Aldrich cat. # A0433 <li> Albumina sierica umana (HSA), Sigma-Aldrich cat. # A9511 <li> Argon o azoto gas (ultra-elevata purezza), cat Airgas. # # O AR UHP300 NI UHP300 <li> Piastre di Petri, 60 mm x 15 mm, cat Fisher Scientific. # 0875713A <li> Scienceware ® vuoto essiccatore, Sigma-Aldrich cat. # Z119016 <li> Microprovette, Fisher Scientific cat. # 05-408-120 <li> Piastre a 96 pozzetti, rilegatura cellulare bassa, Nalgene Nunc gatto International. # 145399 <li> BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer, Bio-Rad <li> Tween-20, Sigma-Aldrich # P1379 <li> Etanolammina, Sigma-Aldrich # 398136 <li> Idrossilammina, Thermo Scientific cat. # 26103 <li> Multi-purpose dei rotatori, Thermo Scientific (Barnstead International), modello # 2314, cat. # 2314Q <li> Retiga 2000R fotocamera, cat QImaging. # 01-RET-2000R-FM-12 <li> Illuminazione fonte ACULED, PerkinElmer, ordine personalizzato <li> Componenti ottici (lenti, obiettivi, aperture, rotaie, pali, ecc), Thorlabs </ol>

biomolecular detection employing the interferometric reflectance imaging sensor (iris)

La misura sensibile delle interazioni biomolecolari ha un uso in molti campi e settori come la biologia e microbiologia di base, monitoraggio ambientale / agricolo / biodifesa, nanobiotecnologie e altro ancora. Per applicazioni diagnostiche, monitoraggio (rilevazione) la presenza, assenza, o l&#39;espressione anormale di mirati biomarcatori proteomici o genomiche trovati nei campioni dei pazienti può essere utilizzato per determinare un approccio di trattamento o di efficacia della terapia. Nel campo di ricerca, informazioni sulle affinità molecolare e specificità sono utili per caratterizzare completamente i sistemi oggetto di indagine. Molti degli attuali sistemi utilizzati per determinare le concentrazioni molecolari o affinità contare sull&#39;utilizzo di etichette. Esempi di questi sistemi includono saggi immunologici, come l&#39;enzima-test immunoenzimatico (ELISA), reazione a catena della polimerasi (PCR), saggi di elettroforesi su gel e spettrometria di massa (MS). Generalmente, queste etichette sono fluorescenti, radiologiche, o colorimetrica in natura e sono direttamente o indirettamente collegata al bersaglio molecolare di interesse. Sebbene l&#39;uso di etichette è ampiamente accettato e ha alcuni vantaggi, non ci sono inconvenienti che sono stimolando lo sviluppo di nuovi senza etichetta metodi per misurare queste interazioni. Questi svantaggi includono aspetti pratici come il costo del test un aumento, Reattivo vita e le preoccupazioni usabilità, storage e sicurezza, perdita di tempo e fatica per l&#39;etichettatura, e la variabilità fra i diversi reagenti per i processi di etichettatura o etichette stesse. Su una base di ricerca scientifica, l&#39;uso di queste etichette possono anche introdurre tali difficoltà per quanto riguarda gli effetti sulla funzionalità delle proteine ​​/ struttura per la presenza delle etichette allegate e l&#39;incapacità di misurare direttamente le interazioni in tempo reale. Qui presentata è l&#39;uso di una nuova etichetta senza biosensore ottico che è suscettibile di microarray studi, definito il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS), per rilevare le proteine, DNA, materiale antigenico, patogeni intero (virioni) e altro materiale biologico. Il sistema IRIS ha dimostrato di avere sensibilità, precisione e riproducibilità delle interazioni biomolecolari diversi [1-3]. I vantaggi includono la capacità di imaging multiplex, in tempo reale e funzionalità di misura degli endpoint, e altri prodotti high-throughput attributi quali il consumo di reagente ridotti e una riduzione dei tempi di analisi. Inoltre, la piattaforma IRIS è semplice da usare, richiede attrezzature poco costose, e utilizza a base di silicone solido componenti saggio fase che lo rende compatibile con gli approcci superficiali molti contemporanea chimica. Qui, vi presentiamo l&#39;utilizzo del sistema IRIS dalla preparazione degli array sonda incubazione e la misurazione di obiettivo vincolante per l&#39;analisi dei risultati in un formato endpoint. Il sistema modello sarà la cattura di anticorpi bersaglio che sono specifici per albumina sierica umana (HSA) su HSA-macchiato substrati.

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Quantitativa, high-throughput in tempo reale, e l&#39;etichetta-libero di rilevamento biomolecolare (DNA, proteine, ecc) su SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Superfici può essere raggiunto utilizzando una semplice tecnica interferometrica, che si basa sulla illuminazione a LED, numero minimo di componenti ottici, e una macchina fotografica. Il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS) è poco costoso, semplice da usare, e suscettibili di microarray formati.

Biomolecolare Detection impiega il sensore di immagine interferometrica riflettanza (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

biomolecular-detection-employing-interferometric-reflectance-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

14.5K Views.  Boston University. Quantitativa, high-throughput in tempo reale, e l'etichetta-libero di rilevamento biomolecolare (DNA, proteine, ecc) su SiO 2 Superfici può essere raggiunto utilizzando una semplice tecnica interferometrica, che si basa sulla illuminazione a LED, numero minimo di componenti ottici, e una macchina fotografica. Il sensore interferometrico Imaging riflettanza (IRIS) è poco costoso, semplice da usare, e suscettibili di microarray formati.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Ricerca

Bioingegneria

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hollow microago-based sensore per Multiplexed transdermico elettrochimica Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

Progettazione e Realizzazione di un&#39;unità elastomerico per soft robot modulari in Chirurgia Mini-Invasiva

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Forno a microonde-driven sintesi di ossido di ferro Nanoparticelle per il rilevamento rapido di aterosclerosi

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab and industrial scale. However, due to its toxicity and flammability, there is a desire to avoid methanol while maintaining the high productivity of P. pastoris. Small scale bioreactor cultivations (0.5-5 L working volume) are commonly used to evaluate a strain and its protein production characteristics since microscale cultivation in deep well plates can be hardly controlled or relies on expensive equipment. Furthermore, traditional protocols for the cultivation and induction of P. pastoris were established for constitutive expression or methanol induction and so far, no reliable protocols were described to screen P. pastoris expression strains with derepressible promoters in (controlled and monitored) parallel cultivations. To simplify such initial cultivations to characterize and compare new protein production strains, we established a simple shake flask cultivation system for methanol free expression that simulates bioreactor conditions including a constant slow glycerol feed and online monitoring, thereby coming closer to the real conditions in bioreactors compared to mostly applied small scale batch cultivations. To drive recombinant protein expression in P. pastoris, the carbon source repressed promoters PDC and PDF were applied. Polymer discs with embedded carbon source, releasing a constant amount of glycerol, assured a feed rate delivering the necessary energy for maintaining the promoters active while keeping the biomass generation low.

Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies

This method for the first time describes reliable experimental procedures for efficient inducible methanol-free recombinant protein production in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), employing the carbon source regulated promoters PDCand PDF in small scale experiments while cultivation parameters can be monitored online, and a constant glycerol feed is applied.

Metanolo espressione indipendente di Pichia Pastoris che impiegano tecnologie di-repressione

Methanol is a well-established carbon source and inducer for efficient protein production employing Pichia pastoris (P. pastoris) as a host on micro-, lab ...

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many cell functions and behaviors. To calibrate and image integrin tension with high force sensitivity and spatial resolution, we developed an integrative tension sensor (ITS), a DNA-based fluorescent tension sensor. The ITS is activated to fluoresce if sustaining a molecular tension, thus converting force to fluorescent signal at the molecular level. The tension threshold for ITS activation is tunable in the range of 10&#8211;60 pN that well covers the dynamic range of integrin tension in cells. On a substrate grafted with an ITS, the integrin tension of adherent cells is visualized by fluorescence and imaged at submicron resolution. The ITS is also compatible with cell structural imaging in both live cells and fixed cells. The ITS has been successfully applied to the study of platelet contraction and cell migration. This paper details the procedure for the synthesis and application of the ITS in the study of integrin-transmitted cellular force.

Integrin tension plays important roles in various cell functions. With an integrative tension sensor, integrin tension is calibrated with picoNewton (pN) sensitivity and imaged at submicron resolution.

Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Valutazione dei comportamenti fotosintetici mediante misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e delle analisi della fluorescenza della clorofilla

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...