1. Tapis roulant Correre per Rivelare l&#39;entità della lesione muscolare in modelli murini <ol><li> Stabilire l&#39;angolo della superficie di tapis roulant per l&#39;utilizzo durante il protocollo di esecuzione. In generale, un livello piatto o un angolo tra i 7 ° e 15 ° gradi in discesa o in salita è usato. Alcuni tapis roulant sono parte integrante dell&#39;apparato di regolare l&#39;inclinazione, mentre altri richiedono il tapis roulant di essere elevata con altri mezzi. </li><li> Posizionare un vassoio o un trampolino di laboratorio blu sotto il tappeto prima di mettere gli animali nei tapis roulant per raccogliere i rifiuti di animali durante il protocollo di esecuzione. </li><li> Prima di eseguire i topi dovrebbero essere acclimatati all&#39;ambiente del tapis roulant. Ciò comporta l&#39;immissione degli animali nei tapis roulant per 15 minuti con la rete elettrica spegne e il motore trasmissione a cinghia su, ma la cintura non si muove (cioè con la velocità impostata a 0 m / s). </li><li> Attivare la griglia motivazionale elettrica. L&#39;intensità e la frequenza degli impulsi utilizzati di solito può essere controllata su tapis roulant, ma varia da un costruttore all&#39;altro. In generale, l&#39;intensità massima non è tenuto a motivare i topi di funzionare mentre una frequenza elevata (almeno una volta ogni due secondi) migliorare la compliance. </li><li> Attivare la cintura tapis roulant per iniziare il protocollo di esecuzione. Una velocità iniziale di circa 5 metri / min deve essere utilizzato per un periodo di riscaldamento per i topi. La velocità del tapis roulant può essere accelerato lentamente, di solito con l&#39;aggiunta di 1-2 metri / min per ogni minuto dopo l&#39;inizio del tapis roulant. </li><li> Il rispetto degli animali nella maggior parte dei protocolli può essere migliorata conducendo una serie di basse tirature (5 minuti) a velocità di riscaldamento per 3 a 10 giorni prima della esecuzione sperimentale comincia. </li><li> Un esercizio esaurimento acuta comporta in genere l&#39;aumento della velocità del tapis roulant con il tempo fino ad una velocità massima (generalmente &lt;30 m / m) è raggiunto e mantenuto fino a quando i topi mostrano segni di esaurimento. I criteri per giudicare esaurimento variare, ma generalmente includono un mouse spendere più della metà del tempo sulla rete elettrica o 5 secondi consecutivi sulla rete elettrica senza ritornare in superficie tapis roulant. Dopo un mouse individuo è esaurito può essere rimosso dal tapis roulant e il tempo totale di esecuzione può essere registrato. </li><li> Cambiare l&#39;angolo del tapis roulant può essere utilizzata in processi acuti corsa per aumentare il carico di esercizio (con un angolo di salita) o di indurre danni contrazioni eccentriche (con un angolo di discesa) che lacerano le membrane del sarcolemma delle fibre muscolari 1. Evans colorante blu possono essere iniettati in animali prima che le procedure per l&#39;utilizzo come colorante istologico per identificare le fibre muscolari danneggiate 2,3. </li><li> L&#39;allenamento di resistenza in esecuzione protocolli prevedono un carico di esercizio per l&#39;animale in un periodo di tempo prolungato (fino a mesi) al fine di produrre rimodellamento del muscolo o il sistema cardiovascolare. Warm up procedura è la stessa di cui sopra (punto 1.5) però la velocità massima è generalmente inferiore ed i tempi di esecuzione può essere piuttosto lungo (&gt; 1 ora). </li><li> Dopo il completamento di correre i topi possono essere restituiti alle loro gabbie. Tapis roulant di solito diventano piuttosto sporca, mentre i topi sono in esecuzione, in particolare su protocolli lungo. E &#39;necessario pulire il tapis roulant, di solito con uno spray etanolo al 70%, dopo ogni utilizzo. </li></ol> 2. Ex test in vivo della capacità di riparazione della membrana delle fibre muscolari isolati laser UV-A seguito di danni <ol><li> Sezionare lo strato superficiale del flessore delle dita brevis (FDB) muscolo dal piede del mouse. In primo luogo, tagliare la pelle del aperti solo alla linea mediana, mentre facendo attenzione a non danneggiare il muscolo sottostante, poi fare dei tagli orizzontali e togliere la pelle. Il tendine del muscolo piatto bianco FDB (tendine prossimale) può essere visto attaccati all&#39;osso del calcagno. Senza mezzi termini a parte il tendine di forcipe e recidere il tendine vicino al sito di attaccamento, afferrare il tendine libero da pinza e tirarlo verso l&#39;alto delicatamente per separare i FDB dai tessuti circostanti, mentre il taglio di qualunque tessuto connettivo che rimangono attaccati. Dopo aver visto il ramo distale tendini alle cifre individuali la FDB può essere rimosso tagliando dove questi tendini collegano allo strato più profondo del muscolo. </li><li> Mettere il fascio muscolare FDB in 1 ml di soluzione di collagenasi pre-riscaldato a 37 ° C in una provetta da 1,5 ml Eppendorf, nastro il tubo in un orientamento orizzontale a 37 ° C orbitale shaker e agitare a 200 rpm per 65 min. Tempi di incubazione può essere regolato per garantire la digestione sufficiente, che è indicata da un aspetto sfilacciato e il colore pallido del muscolo. </li><li> Cura il trasferimento del fascio FDB digerito in un tubo di 1,5 microlitri centrifuga contenente ~ 600 ml di 2,5 Tyrode Ca 2 + tramite una punta da 1 ml con una pipetta fine taglio che ha un diametro sufficiente a consentire il fascio digerito di passare facilmente attraverso senza interruzioni. Capovolgere delicatamente il tubo di scuotere le fibre sciolto dal bundle. </li><li> Tagliare la punta della pipetta 30 microlitri in modo che il diameter è solo leggermente più piccolo del fascio muscolare (tra i 15 - 20 micron di diametro) Utilizzare la pipetta per disegnare delicatamente il pacco nella pipetta e poi spingerlo nuovamente dentro la soluzione.. Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte delle fibre sono dissociate dal fascio. </li><li> Mescolare fibre dissociate bene girando delicatamente il tubo, prendete importo desiderato e cadono in un fondo di vetro piatto delta T. Il volume di carico varia in base al rendimento di isolamento e il numero di fibre utili che servono su un piatto per un particolare protocollo. Le fibre restanti possono essere memorizzati nel tubo a 4 ° C per circa 6 ore per ulteriori studi. </li><li> Lasciare che il piatto a riposare per 5 minuti. Questo permette alle fibre di aderire al fondo di vetro del piatto. </li><li> Porre la capsula a fondo di vetro su un microscopio confocale equipaggiato con un laser UV. Osservare le fibre al microscopio di fase con ingrandimento&gt; 100X per verificare la presenza di un pattern striatura normale e una scala, asta come forma. </li><li> Aggiungi FM1-43 o FM4-64 coloranti styrylpyridinium 4 a soluzione ad una concentrazione finale di 2,5 mM 5. </li><li> Per indurre danni alla posizione delle fibre nella finestra di imaging così la fibra è orientata ad un angolo di 45 ° dalla parte superiore sinistra del campo di vista in basso a destra (Figura 1). Irradiare una zona di 5x5 pixel (circa 0.9μmx0.9μm) della membrana plasmatica utilizzando un laser UV (80 mW o superiore, 351/364 nm) impostato alla massima potenza per 5 secondi. La regione irradiata dovrebbero dividere la membrana plasmatica, cioè la metà della casella 5x5 dovrebbe essere all&#39;interno della fibra, mentre il resto dovrebbe essere al di fuori della fibra (Figura 1). </li><li> Catturare immagini di entrata colorante nella fibra a intervalli di 5 secondi ciascuno per un massimo di 5 minuti. </li><li> Ripetere il punto 2.8 per non più di 3 fibre per piatto, in quanto il colorante fluorescente alla fine sarà endocitato nella fibra e complicare le analisi dei dati. Dopo 3 fibre di un nuovo piatto deve essere preparato dal punto 2.5. </li><li> Analizzare i dati calcolando la variazione di intensità di fluorescenza (ΔF / F 0) tra ogni fotogramma catturato per misurare la quantità di entrata colorante. Ciò richiede la misurazione della fluorescenza media di una superficie di circa 200 micron 2 utilizzando software di analisi come il pubblicamente disponibili ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Per fare un confronto tra le fibre, il seguente calcolo deve essere fatta per ogni fotogramma: ΔF / F 0, dove F 0 è la fluorescenza media della regione di interesse nel primo fotogramma catturato (t = 0; prima della lesione), e ΔF è la variazione di fluorescenza di ogni fotogramma successivo (FF 0). </li></ol> 3. Vivere Imaging confocale cellulare per controllare il processo dinamico di riparazione della membrana cellulare <ol><li> Micropipette sono state fatte da PYREX capillari. Il capillare è stata posta su un estrattore micropipetta e tirata a pre-impostati programma (calore = 695; Tirare = 50; Vel .= 55; Tempo = 250). </li><li> Micropipetta è stato attaccato ad un asse 3 (xyz) micromanipolatore. </li><li> Le cellule sono transfettate con il DNA plasmidico con metodi normali su un piatto fondo di vetro delta T. I terreni devono essere acceso a 2,5 mm Ca 2 + tampone Tyrode prima di iniziare gli esperimenti. </li><li> Piatti di vetro contenenti cellule transfettate sono stati collocati su un microscopio confocale a scansione laser con obiettivo 40X 1.3NA immersione in olio. </li><li> L&#39;acuto live-cell danni è stata effettuata inserendo il micropipetta nella membrana cellulare e quindi rapidamente ritrarre la micropipetta fuori dalla cella 3,6. Consecutivi immagini dal vivo di cellule sono state ottenute con un intervallo di 1,54 s / telaio. </li><li> Per il saggio saponina membrana indotta interruzione, 0,005% saponina (Sigma) in 2,5 mm di Ca 2 + tampone Tyrode è stato perfuso da un flusso di gravità su misura assemblati sistema di perfusione 7. Il tasso di perfusione è di circa 1 ml / min e la punta perfusione deve essere posto direttamente sopra la cella viene esposta. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Un film rappresentante del tapis roulant in esecuzione del mouse può essere effettuato durante le riprese. Il film illustrerà la ridotta capacità di funzionamento del mg53-/ - i topi a causa di danni al muscolo scheletrico. L&#39;entità del danno causato dal laser UV-protocollo dettagliata dei danni sopra dipende dalla capacità della membrana riparazione della fibra analizzati. Questa capacità è influenzata dal genotipo del mouse da cui è stato isolato la fibra, le condizioni extracellulare, e qualsiasi modifica di espressione della proteina (trasfezione o infezione). Una fibra normale di tipo selvatico permetterà lieve a moderata ingresso colorante (Figura 2a). Fibra muscolare deriva dal mg53-/ - i topi con una capacità di membrana compromessa riparazione mostrerà ingresso più significativo del colorante nella fibra (Figura 2b). I risultati tipici per traslocazione mostrare microelettrodo ferimento di MG53 contenenti vesiCles al luogo di ferita. Figura 3a e 3b mostrano GFP-MG53 miotubi C2C12 trasfettate danneggiati inserendo la micropipetta nella membrana cellulare. Nella cella prima che il danno micropipetta, GFP-MG53 si trova su entrambi membrana plasmatica citoplasma e 3. A seguito di penetrazione micropipetta, GFP-MG53 vescicole contenenti spostato verso siti danno (come indicato dalla freccia). Figura 3c mostra un GFP-MG53 mioblasti C2C12 trasfettate trattati con 0,005% di saponina, un detergente che può permeabilize la membrana plasmatica. Al trattamento saponina, GFP-MG53 traslocato dal citosol alla membrana cellulare. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Weisleder, et al. Figura 1. Allineamento delle fibre e regione definizione lesioni. Corretto orientamento delle fibre muscolari isolate all&#39;interno del campo visivo e la definizione della regione lesioni mostrato. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Weisleder, et al. Figura 2. Danni laser UV di fibra FDB. Immagini mostrano le fibre prima della lesione (0 sec, a sinistra) ea 200 lesioni dopo sec (a destra). Fibre da un topo wild-type (a) mostrano lesioni lievi. Fibre provenienti da topi con la riparazione della membrana compromessa (b) permettere a più tintura di entrare. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Weisleder, et al. Figura 3. Danni microelettrodo e saponina di cellule in coltura. Immagini mostrano miotubi C2C12 (a, b) e un mioblasti C2C12 (c) prima ferita (sopra) e lesioni post (in basso). Cellule danneggiate con un microelettrodo (a, b) mostrano MG53 traslocazione a siti di lesione (frecce). Cellule trattate con saponina (c) mostrare MG53 traslocazione alla membrana cellulare.

<ol>
	<li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle.">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence.">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53,+caveolin-3,+and+dysferlin.">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+of+ischemia/reperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair.">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li><li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice.">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice.">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li><li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Esecuzione tapis roulant è una metodologia utile a fornire un carico di esercizio per gli animali trattati. Come una metodologia per misurare la funzione muscolare o la capacità di resistenza si tratta di un approccio noto rumore che è difficile da eseguire in modo costantemente riproducibile 8. In generale, i tempi di esaurimento può essere utilizzato come un endpoint per risolvere grandi differenze tra i gruppi sperimentali, come quelle tra le linee del mouse alcuni topi knockout e wild-type 9. Manipolazioni sperimentali che producono differenze più sottili, come ad esempio alcune prove farmaceutiche, non può risolvere le divergenze di sopra del rumore associati a questa tecnica. Al fine di massimizzare la riproducibilità e la sensibilità di queste tecniche, è importante mantenere le condizioni per la sessione a sessione molto da vicino. L&#39;ora del giorno gli animali sono esercitate, nonché le condizioni di caldo periodo di presentazione utilizzata, sono fattori importanti e dovrebbero rimanere costanti da prova a prova. Effetti di deformazione può avere un impatto significativo sulla progettazione di protocolli di tapis roulant come alcuni ceppi di topi può funzionare per molto più tempo sul tapis roulant di altri ceppi e rispondono in modo diverso di esercitare la resistenza 10. Come regola generale, i topi molti saranno in grado di eseguire 200-300 metri totali in uno studio di esaurimento con aumento costante della velocità del tapis roulant (5 m / m velocità iniziale di 1 m / m aggiunto per ogni minuto dopo l&#39;avvio). Per un esercizio di resistenza del topo può essere eseguito tra 9-12 m / m per 30 minuti 2 o 3 volte a settimana. Tuttavia, studi individuali di solito richiedono una ottimizzazione del protocollo per soddisfare esigenze individuali sperimentale. L&#39;UV-laser procedura danno è stato dimostrato di essere un metodo efficace per misurare la capacità di riparazione della membrana delle fibre muscolari scheletriche 3,6,11. Un componente essenziale per il successo di questi esperimenti è quello di utilizzare le fibre muscolari che visualizzano solo un diritto, aspetto a forma di asta con uno schema regolare di striature e di un sarcolemma liscia che non appare rugosa. Se le fibre muscolari sono selezionati altri danni membrana possono essere già presenti in queste fibre e l&#39;interpretazione dei risultati di questi esperimenti può essere complicata. E &#39;anche importante che l&#39;orientamento delle fibre e la definizione della regione irradiata essere definito in Figura 1. Questo fornisce una lesione di dimensioni riproducibili, in modo da permettere un raffronto tra le fibre. Se la regione definita di lesioni si trova completamente all&#39;interno della fibra, una lesione interna verrà creato, piuttosto che interrompere il sarcolemma. Inoltre, il valore calcolato per ΔF / F 0 è molto sensibile alla regione di interesse selezionate per la misurazione della fluorescenza media. Una superficie di circa 200μm 2, adiacente e incluso il sito della lesione, è appropriato. A differenza della regione definita per infortunio, questa area dovrebbe trovarsi completamente all&#39;interno della fibra. Se si include lo spazio al di fuori della fibra, l&#39;area risulta vuota aumenterà ΔF / F 0 in fibre con poco colorante riducendo al contempo l&#39;ingresso ΔF / F 0 in fibre con un fenotipo più grave. Questo diminuisce la sensibilità del dosaggio, rendendo così il confronto tra le fibre più difficile. Per l&#39;analisi danno micropipetta, l&#39;angolo tra la micropipetta e fondo piatto di vetro dovrebbe essere di circa 45 gradi in modo da danneggiare in modo efficace la membrana cellulare. Le cellule sono state scelte per danni micropipetta deve essere strettamente collegato al fondo del piatto e le cellule arrotondate non deve essere utilizzato poiché la maggior parte è probabile che si staccano dopo micropipetta frugando. Esperimenti permeabilzation saponina sono meno tecnicamente impegnativo e piuttosto veloce da eseguire rispetto alla micropipetta test di penetrazione. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni per i danni saponina, comprese che solo una cellula può essere utilizzato per ogni piatto dal saponina si diffonderà e danneggiare le altre cellule in quel piatto.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Roditori tapis roulant </td><td> Columbus Strumenti Esercizi 06/03 o equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo al 70% </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Strumenti di dissezione tra cui pinze punta fine, forbici primavera </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td></td></tr><tr><td> 2 mg / ml collagenasi di tipo I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode tampone (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 HEPES mM, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mm di Ca 2 + Tyrode tampone (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 HEPES mM, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controllabile agitatore orbitale </td><td> New Brunswick o equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Delta TPG Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 con un microscopio confocale laser UV Enterprise 80 mW o equivalente microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43-64 FM4 o coloranti </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato Capillari Dimensione 0,8-1,0 x 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Codice 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> modello P-97 </td></tr><tr><td> 3 assi micromanipolatore </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 microscopio a scansione laser confocale microscopio o equivalente </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

Riparazione di lesioni acute alla membrana cellulare è un processo elementare di normale fisiologia cellulare e difettosa riparazione della membrana è stata collegata a molte malattie degenerative umane. La recente scoperta della MG53 come componente chiave della macchina medesima membrana permette una migliore comprensione della biologia molecolare di base della riparazione dei tessuti, così come per potenziali applicazioni traslazionale in medicina rigenerativa. Qui dettaglio i protocolli sperimentali per esplorare la funzione in vivo di MG53 nella riparazione di lesioni muscolo utilizzando protocolli di esercizio al treadmill in modelli murini, per testare la capacità di membrana ex vivo riparazione misurando ingresso colorante in fibre muscolari isolate, e per il monitoraggio del processo dinamico della MG53-mediata traffico di vescicole e membrana riparazione cellulare nelle cellule in coltura di cellule vive usando la microscopia confocale.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.

Visualizzazione di MG53-mediata di riparazione della membrana cellulare Utilizzando In vivo E In vitro Sistemi

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K Views.  Robert Wood Johnson Medical School. Qui descritte sono protocolli utilizzati per visualizzare il processo dinamico della MG53-mediata riparazione membrana cellulare in animali interi ed a livello cellulare. Questi metodi possono essere applicati per studiare la biologia cellulare della medesima membrana plasmatica e la medicina rigenerativa.

Video: Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Utilizzando Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) per sviluppare strumenti diagnostici

Ricerca

Biologia

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Analisi di Schwann-astrociti Interazioni utilizzo In Vitro Saggi

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Proteine ​​di membrana Overlay saggio: un protocollo di prova interazione tra proteine ​​solubili e insolubili In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Imaging Membrana cellulare Pregiudizio e processi subcellulari coinvolti nella riparazione

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

Analisi delle reazioni RNA di trasformazione che utilizzano cellulari Sistemi gratis: 3 &#39;Fine Decolleté di pre-mRNA Substrati<em&gt; In vitro</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

In Vitro e In Vivo approcci per determinare la permeabilità intestinale delle cellule epiteliali

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.