RAW vuole ringraziare i membri del Zon e Davidson laboratori di ricerca per il loro contributo di innumerevoli contribuendo a sviluppare strategie che hanno progressivamente questa forma tecnica di dissezione in zebrafish adulti nel corso dell&#39;ultimo decennio. Inoltre, vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai membri del personale di Notre Dame Centro per la Ricerca Zebrafish per fornire un&#39;eccellente assistenza continua di allevamento per la nostra colonia zebrafish. RAW ha raccolto fondi per la ricerca del NIH-NIDDK DK083512 di assegnazione del contributo, e di laboratorio generosi finanziamenti di avviamento presso l&#39;Università di Notre Dame.

1. La dissezione del rene adulto zebrafish da un campione animale unfixed <ol><li> Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione. </li><li> Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 4-5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie si fermano e il cuore smette di battere. </li><li> Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l&#39;animale su un tovagliolo di carta. </li><li> Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell&#39;animale, effettuando un taglio subito dietro l&#39;opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. </li><li> Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell&#39;animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, percorso B). </li><li> Rimuovere gli organi interni dell&#39;animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2). Se è stato selezionato un pesce femmina, sarà necessario raccogliere le uova sviluppo fuori della cavità del corpo, che può essere più facile da fare usando una coppia di pinze ad angolo o una pinzetta. </li><li> Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo di un vassoio di dissezione, e l&#39;angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, tronco / sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l&#39;aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell&#39;organo. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base. </li><li> Posizionare con delicatezza il rene nel veicolo desiderato per ulteriori studi sulle cellule vive, come una provetta contenente PBS 1x per la preparazione FACS. </li></ol> 2. Preparazione e dissezione del rene adulto zebrafish da un campione di animali fisso <ol><li> Preparare una soluzione del 4% PBST paraformaldehyde/1X. Far bollire la soluzione per sciogliere il PFA in soluzione, poi raffreddare il composto a 4 ° C e aggiungere 0,1% dimetilsolfossido. Abbiamo avuto più successo con la conservazione dei tessuti da usare appena fatto soluzioni PFA al contrario di aliquote congelate. Preparare la soluzione sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione. </li><li> Riempire un vassoio di dissezione con una soluzione di fissaggio sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione. Eseguiamo i passaggi successivi con questo vassoio posizionato sotto il microscopio, che può essere collocato in una cappa chimica per minimizzare l&#39;esposizione agli odori fissazione. </li><li> Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione. </li><li> Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie e smettere di battere il cuore. </li><li> Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l&#39;animale su un tovagliolo di carta. </li><li> Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell&#39;animale, effettuando un taglio subito dietro l&#39;opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti rischio biologico, e subito posto l&#39;animale in PFA-vassoio contenente dissezione. </li><li> Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell&#39;animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, B percorso), e mantenere il corpo parzialmente sommerso durante la procedura. </li><li> Rimuovere gli organi interni dell&#39;animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2). </li><li> Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo, e l&#39;angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l&#39;aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell&#39;organo. </li><li> Fissare il campione durante la notte, mettendo il vassoio a 4 ° C quando si è fatto a organizzare i campioni desiderati. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere la soluzione PFA dal vassoio e sostituirlo con 1x PBST. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base. Il tessuto renale sarà morbida e flessibile dal DMSO nella soluzione di fissativo, che consente di sezionare l&#39;intero organo rene in un unico pezzo. </li><li> Utilizzare un ampioforo pipetta di trasferimento per posizionare il rene in una provetta. </li><li> Il rene può essere ulteriormente elaborato per condurre montare istologica o intero negli studi di espressione genica in situ sulla base dello studio desiderato. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: I passi che vengono rappresentata nella Figura 1 indicano la procedura di dissezione. Il rene può essere identificato in base alla sua caratteristica forma e colorazione, e la posizione anatomica sulla parete dorsale della cavità del corpo dell&#39;animale, come mostrato nella Figura 2. Dopo la dissezione di un campione fisso rene, montare tutto ibridazione in situ possono essere utilizzate per localizzare l&#39;espressione di un gene di interesse, come mostrato nella Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Procedura che consente l&#39;accesso diretto per sezionare il pesce zebra rene adulto. (A) zebrafish eutanasia è sezionato in modo graduale (indicato da numeri e frecce) per dare al ricercatore il più facile accesso al rene organo completo. Le immagini della cavità addominale prima (B) e dopo (C) la rimozione degli organi addominali. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2:. Visualizzazione del rene zebrafish in un campione unfixed dopo la rimozione di organi nella cavità del corpo, il rene appare come un unico organo appiattito che è aderente alla parete dorsale del corpo attraverso i tessuti connettivi (A), ed è stato schematizzato (B) per mostrare la sua forma anatomica. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: montare intero ibridazioni in situ effettuata su tutto l&#39;organo rene adulto. (A) cadherin17 trascrizioni vengono rilevati nel tubulo di nefroni rene adulto, ampliato nel (A &#39;). (B) trascrizioni mafba sono localizzate nefrone prossimale tipi di cellule nel rene adulto (confronta con tubulo intero pannello A). (B&#39; ) Una visione allargata di espressione mafba rivela che le trascrizioni sono specificamente localizzati al podociti (P), le cellule del sangue filtro (glomerulo) e contorto tubulo prossimale (PCT).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le cellule staminali adulte sono componenti dinamici ed essenziali che mantengono la forma adulta del corpo 1. Le cellule staminali adulte possono anche servire per contrastare i danni che il corpo subisce durante stati di malattia, e la disfunzione o la perdita di cellule staminali adulte possono portare al declino della funzione dell&#39;organo ed è stata coinvolta a guidare neoplasie maligne del cancro e contribuiscono all&#39;invecchiamento. Le cellule staminali adulte presentano proprietà cellulari che li distinguono dagli altri tipi di cellule differenziate. Al momento della divisione cellulare, le cellule staminali adulte sono in grado di auto-rinnovamento e la produzione di cellule progenitrici che a sua volta può dare origine a diversi prole differenziata. C&#39;è un grande interesse nella comprensione dei percorsi che regolano le decisioni il destino delle cellule e la potenza delle cellule staminali adulte per la loro importante ruolo nella omeostasi dei tessuti 1. Per esempio, molti scienziati oggi cercano di identificare i segnali che mantengono diverse popolazioni di cellule staminali adulte nella loro nicchia, o microambiente specializzati e di nicchia come questo è influenzato da fattori umorali. Cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono cellule pluripotenti che alimentano il continuo ringiovanimento delle cellule del sangue negli animali 8. Emopoiesi è un processo vibrante che è costantemente in corso durante la vita di un organismo vertebrato perché la differenziata tipi di cellule mature del sangue sono di breve durata e, quindi, devono essere alimentati regolarmente. Come si dividono, CSE fornire questa domanda cruciale da auto-rinnovamento e producendo una serie di progenitori che danno origine alla eritroidi, lignaggi megacariociti, linfoide e mieloide. Ognuno di questi tipi di cellule del sangue svolge funzioni uniche nella circolazione, compresa la fornitura di scambio di gas nei tessuti, un modo per sigillare le lesioni ai vasi sanguigni per mezzo di formazione di coaguli, o meccanismi di difesa contro i patogeni. Mentre le CSE sono stati riconosciuti da molti anni, una pletora di affascinanti domande rimangono senza risposta su queste cellule sorprendente. Studi recenti hanno identificato sottoclassi di cellule staminali con differenti a lungo termine di auto-rinnovamento proprietà, e la spiegazione dei componenti di nicchia e di segnali che modulano il comportamento HSC 8. Il pesce zebra è ora tra i capisaldi della ematopoiesi paradigmi di ricerca, in base agli attributi genetici e molecolari di questo modello animale 8. Ricerca utilizzando il pesce zebra ha portato a nuove intuizioni sulla biologia HSC che si conservano con maggiore vertebrati come i mammiferi, sottolineando la rilevanza biomedica di indagini del sangue di pesce 8. Storicamente, la conoscenza di CSE ha aperto la strada per le spedizioni che cercano di scoprire se altri organi del corpo sono mantenuti da cellule staminali adulte. Numerose popolazioni di cellule staminali adulte sono apprezzati di esistere, che spaziano tra diverse strutture del cervello verso l&#39;intestino, la pelle e muscolo scheletrico. Continui sforzi nel campo delle cellule staminali cercano di identificare come le cellule staminali adulte e anche altri tipi di cellule differenziate in grado di visualizzare una maggiore potenza in varie impostazioni. Per quanto riguarda il rene, c&#39;è stata grande dibattito fra nefrologi se le cellule staminali renali esistono 16. Risultati indipendenti hanno documentato le popolazioni di cellule renali nei mammiferi che possiedono diversi gradi di potenziale rigenerativo, ma una comprensione coerente di queste relazioni deve essere ancora raggiunto. È interessante notare che vi è una forte evidenza per sostenere l&#39;idea che molte specie di pesci possiedono cellule che possono robustamente carburante rigenerazione dei nefroni danneggiato, così come crescono nefroni completamente nuovo durante l&#39;età adulta 9. Studi recenti hanno identificato le caratteristiche molecolari delle cellule staminali adulte renali in zebrafish 10,11, e dimostrato l&#39;auto-rinnovamento potenza di questi cosiddetti renale cellule staminali / progenitrici (RPC) 11. Studi futuri sono necessari per verificare se le cellule renali analoghe sono presenti nei mammiferi. Tuttavia, le indagini continua sui meccanismi cellulari e molecolari che regolano RPC pesce può fornire indicazioni sul modo in cui prodezze rigenerativa può essere stimolato nel rene dei mammiferi. E &#39;evidente che c&#39;è ancora molto da comprendere circa RPC, e che tanti strumenti oggi a disposizione del ricercatore zebrafish possono essere implementate per affrontare queste domande intriganti. In questo protocollo, si descrive il nostro metodo per l&#39;identificazione e dissezione anatomica del rene adulto zebrafish. Procedura alternativa può essere utilizzato per analizzare il rene, come l&#39;apertura della cavità addominale con una incisione ventrale con le forbici dissezione, tuttavia, abbiamo incontrato più successo di accesso l&#39;intero organo quando la parete addominale è bloccata aperta e la testa è stata rimossa. Ricercatori del sangue e dei reni sia che vogliono isolare e lavorare con questi tipi di cellule possono utilizzare entrambi i metodi dissezione. Va notato che il metodo descritto per isolare e working con il rene adulto zebrafish non è certo limitato agli scienziati che intendono esercitare le domande di biologia delle cellule staminali adulte, come la dissezione di questo organo può facilitare gli studi di quei ricercatori che perseguono ricerche su argomenti che spaziano dalla fisiologia alla invecchiamento. Inoltre, questo metodo può essere accoppiato con altre tecnologie come transgenici, in modo da etichetta molecolare e poi purificare e studiare sottopopolazioni discreto di cellule del sangue o dei reni dal tipo selvatico o geneticamente mutante zebrafish 11. Guardando al futuro, quali le procedure di purificazione dettagliata dei tipi di cellule staminali e cellule progenitrici è fondamentale per acquisire conoscenza su come il loro comportamento è regolato, come i test operativi come il trapianto o la coltura progenitrici costituiscono la base dalla quale la potenza e l&#39;identità di queste cellule è definito. I recenti progressi nei metodi di coltura progenitrici ematopoietiche aperto molte nuove strade per lo studio, e può essere adattato a coltura delle popolazioni renale 17. Zebrafish genetica chimici sono riusciti ad individuare dei percorsi che modulano le CSE e progenitori renali nei diversi contesti 18-20, e continuerà ad essere una strada utile per testare in combinazione con le tecniche sopra biologia cellulare. Nel loro insieme, ci sono stati una serie di contributi innovativi ai campi di ematologia e nefrologia utilizzando il modello zebrafish, e ha continuato la ricerca in questi ambiti promette di esercitare ulteriori approfondimenti trasformazione nei prossimi anni.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Dissezione forbici </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Dissezione forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Pinza dissezione angolato </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Microscopia Elettronica Servizi </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

I ricercatori che lavorano nel campo in rapida crescita della biologia delle cellule staminali adulte cercano di capire i segnali che regolano il comportamento e la funzione delle cellule staminali durante la normale omeostasi e stati di malattia. La comprensione delle cellule staminali adulte ha implicazioni di vasta portata per il futuro della medicina rigenerativa 1. Per esempio, una migliore conoscenza della biologia delle cellule staminali adulte possono facilitare la progettazione di strategie terapeutiche in cui vengono attivati ​​gli organi di guarire se stessi o addirittura la creazione di metodi per la coltivazione in vitro organi che possono essere trapiantati nell&#39;uomo 1. Il pesce zebra è diventato un modello animale potente per lo studio della biologia delle cellule dei vertebrati 2. C&#39;è stata una vasta documentazione e analisi dello sviluppo embrionale del pesce zebra 3. Solo di recente gli scienziati hanno cercato di documentare anatomia adulto e le tecniche di dissezione chirurgica 4, in quanto vi è stato un movimento progressivo all&#39;interno della comunità zebrafish di ampliare le applicazioni di questo organismo di ricerca per gli studi per adulti. Per esempio, ci sono interessi in espansione con zebrafish per studiare la biologia delle popolazioni di cellule staminali adulte ed effettuare sofisticati modelli adulti di malattie come il cancro 5. Storicamente, l&#39;isolamento del rene adulto zebrafish è stato fondamentale per lo studio ematopoiesi, come il rene è la posizione anatomica della produzione di cellule del sangue nei pesci 6,7. Il rene è composto da unità funzionali nefrone trovato negli accordi arborized, circondato da tessuto emopoietico che è dispersa in tutto il spazi. La componente ematopoietiche consiste di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e la loro progenie che abitano il rene fino a quando non terminali differenziare 8. Inoltre, è ora apprezzato il fatto che un gruppo di renale cellule staminali / progenitrici (RPC) abitano anche l&#39;organo zebrafish rene e permettere sia la rigenerazione del rene e la crescita, come osservato in altre specie di pesci 9-11. Alla luce di questa nuova scoperta, il rene zebrafish è un organo che ospita la sede di due interessanti opportunità per gli studi di biologia delle cellule staminali adulte. E &#39;chiaro che molte questioni in sospeso potrebbe essere ben servita con questo sistema sperimentale. Per favorire l&#39;espansione di questo campo, è utile per documentare i metodi dettagliati di visualizzare e poi isolare l&#39;adulto organo rene zebrafish. Questo protocollo dettagli la nostra procedura per la dissezione del rene adulto da animali sia non fissati e fissi. Dissezione del rene organo possono essere utilizzate per isolare e caratterizzare le cellule staminali ematopoietiche e renale e la loro prole nell&#39;utilizzo di tecniche consolidate quali l&#39;istologia, la fluorescenza cell sorting attivato (FACS), 11,12, 13,14 profili di espressione, e il trapianto 11,15. Ci auguriamo che la diffusione di questo protocollo sarà fornire ai ricercatori le conoscenze necessarie per realizzare un più ampio utilizzo degli studi di zebrafish che alla fine può essere tradotto per l&#39;applicazione sull&#39;uomo.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l&#39;isolamento delle cellule, il trapianto, e studi di espressione del rene e / o popolazioni di cellule del sangue.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Research

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Biology

36.5K Views.  University of Notre Dame. Il rene zebrafish è la patria di entrambi renale ematopoietiche adulte e cellule staminali / progenitrici, e rappresenta una straordinaria opportunità per studiare questi tipi di cellule e la loro progenie in un organismo modello vertebrato. Qui, dimostriamo una procedura dettagliata dissezione che consente al ricercatore di identificare e rimuovere chirurgicamente il rene adulto pesce zebra, che può essere utilizzata per applicazioni quali l'isolamento delle cellu...

Video: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

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Biologia

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissezione lordo e Arti di epiteli sensoriali dell&#39;orecchio interno in adulti Zebrafish ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissezione di cuore in larvale, Zebrafish giovanile e degli adulti, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Zebrafish adulti

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...