Gli autori desiderano ringraziare la vita Freimann Science Center e il Centro per il personale di ricerca Zebrafish per la loro cura e manutenzione del zebrafish.

1. Risospendere Morpholino <ol><li> Diluire 300 Nm di fluoresceina-tagged morfolino in 100 microlitri di acqua priva di nucleasi di fare una soluzione circa 3 mM. La soluzione morfolino viene frazionato in più paraffina sigillati tubi da microcentrifuga e conservato a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. </li><li> Per determinare la concentrazione esatta morfolino, diluire 5 pl di soluzione di morfolino (o acqua come bianco) in 95 pl di 0,1 N HCl. Impostare una linea di base su uno spettrofotometro a 265 nm con il bianco acqua e quindi determinare la lettura della soluzione diluita morfolino. Moltiplicare l&#39;assorbanza morfolino dalla sua costante determinata e per il fattore di diluizione per determinare la concentrazione in ng / pl. La costante morfolino viene calcolato come: Morfolino costante = peso molecolare della assorbanza X morfolino 1000/molar. Il peso molecolare e assorbanza molare per il morfolino si trova sul &quot;Oligo &quot;foglio Proprietà fornito con il prodotto. Dividere la concentrazione morfolino, in ng / pl, dal peso molecolare per determinare la concentrazione in mM. Diluire il morfolino, se necessario, ad una concentrazione operativa, tipicamente 1,2 mM. </li></ol> 2. Fin Amputazione <ol><li> Anestetizzare zebrafish adulto sia in Tricaine o 2-fenossietanolo di 1,0 mg / ml in acqua serbatoio. </li><li> Amputare la pinna con una lama sterile bisturi o rasoio prossimale al primo punto lepidotrichial ramificazione. Questo dovrebbe essere fatto allo stesso prossimale / distale posizione su ogni singolo animale (ad esempio 7 segmenti ossei distali dalla cintura fin). IMPORTANTE: assicuratevi di tagliare perfettamente perpendicolare alla anteriore / posteriore piano dell&#39;animale. Tagli angolari si tradurrà nella crescita fin irregolare delle due metà dorsali e ventrali della pinna. </li><li> Ritorna il pesce ad un serbatoio. Noi di solito mantenere il pesce a 33 ° C per aumentare il tasso di rigenerazione. A seconda del disegno sperimentale, wait 0-2 giorni dopo l&#39;amputazione (dpa) per la rigenerazione fin iniziare prima di introdurre il morfolino. Approcci alternativi sono discussi nella discussione, al di sotto. </li></ol> 3. Morfolino iniezione <ol><li> Il giorno prima di iniettare il morfolino, effettuare una piastra di iniezione (Figura 2). Assicurarsi per tagliare una tacca ad una estremità del pozzo, che contribuisce a stabilizzare il pesce per la procedura microiniezione. </li><li> A 2 dpa, preparare la micro-iniezione di apparati e soluzioni morfolino. </li><li> Diluire la fluoresceina tag morfolino alla concentrazione adeguata (consigliamo di iniziare con 1,2 mm) e mettere in un bagno di acqua a 65 ° C, per 5 minuti. </li><li> Estrarre l&#39;ago di vetro per la micro-iniezione con un estrattore ago. </li><li> Caricare l&#39;ago con il morfolino (nota: a seconda che si tratti di back-front-fill o caricare l&#39;ago dovrà stabilire se si carica il primo ago, o tagliare la prima punta). </li><li> Tagliare la punta fuori l&#39;ago con unn angolo. </li><li> Seguire le istruzioni del vostro micro-sistema di iniezione per iniettare uno circa 5 nl bolla di morfolino per iniezione. Grandi volumi di morfolino potrebbe distruggere il tessuto. </li><li> Anestetizzare il pesce e posto sulla piastra di iniezione. Rimuovere tutto il liquido in eccesso e orientare l&#39;ago nella posizione appropriata, appena distale al raggio osseo (Figura 3). Utilizzando un microscopio e apparato microiniezione appropriato per morfolino iniettabili (cfr. tabella di reagenti specifici), iniettare il morfolino nella pinna da anteriore a posteriore, come mostrato nella Figura 3. Iniettando da posteriore al anteriore causa il tessuto pinna per arrotolare durante l&#39;iniezione ed è molto difficile. </li><li> Inserire l&#39;ago delicatamente nel tessuto rigenerativa, appena distale ad ogni raggio ossea (contrassegnata con &quot;1&quot; in figura 3) e spingere distalmente fino situato nel blastema (contrassegnata con &quot;2&quot; in figura 3). Fare attenzione a non spingere l&#39;ago attraverso la enfin pneumatico. Quando l&#39;ago è correttamente localizzata, iniettare il morfolino (cioè cliccare una sola volta). A 1,2 mm, la soluzione di fluoresceina-tagged morfolino appare giallo-verde, anche in condizioni di luce normali. Per ogni iniezione, un giallo &quot;soffio&quot; di soluzione morfolino possono essere visualizzati, che aiuta a localizzare l&#39;iniezione al blastema. Circa il 75 nl (10-15 clicks) di soluzione morfolino deve essere iniettato per ray ossea. Pause ~ 1 sec tra un clic. Abbiamo solo iniettare il lato dorsale, utilizzando il ventrale come elettroporazione solo controllo. In alternativa, si potrebbe ripetere questa procedura intero utilizzando un morfolino controllo sulla metà ventrale della pinna. </li></ol> 4. Elettroporazione della morfolino <ol><li> Immediatamente dopo l&#39;iniezione del morfolino, rimuovere la piastra di iniezione dal micro-iniezione apparato. Riempire la piastra pozzo di iniezione con la soluzione anestesia finché il pesce è sommerso. L&#39;elettroporazione è eseguita sotto la linea di galleggiamento. </li> &lt;li&gt; di 3 mm di diametro dell&#39;elettrodo di platino piastra pinzetta (Cuy 650-P3 pinzette, Protech International) localizza gli impulsi a circa metà della pinna. Fare attenzione a non toccare gli elettrodi al tessuto pinna. Per assicurarsi che gli elettrodi non toccare il tessuto pinna, ruotare il pesce sul lato dorsale e guarda dritto verso il basso la linea mediana per l&#39;elettroporazione. </li><li> Elettroporare sia la dorsale e ventrale (per il controllo per un non-specifici effetti elettroporazione) i lati della pinna utilizzando una squadra CUY21 Onda Elettroporatore (Protech International, Inc.). Pulire gli elettrodi con una Kimwipe umido dopo ogni elettroporazione per eliminare eventuali bolle che possono essersi formate. Se non vengono rimossi, una mini-carica si accumula, che attirerà il tessuto verso l&#39;elettrodo. I parametri di elettroporazione deve essere impostato a dieci impulsi consecutivi 50 msec, a 15 V con una pausa di 1 sec tra gli impulsi. </li><li> Mettere il pesce su un vetrino o una scatola Petri e rapidamente l&#39;immagine della pinna, avendo cura di nOTE l&#39;orientamento dorsale / ventrale. Questa immagine viene utilizzata per l&#39;analisi ricrescita il giorno successivo. Ritorna il pesce al serbatoio. </li></ol> 5. Analisi <ol><li> Se la proteina mirata che è stata abbattuta nel espressione è necessario per la rigenerazione fin corretta, una differenza enorme tra le due metà dorsali e ventrali della pinna dovrebbe essere evidente 1 giorno post-elettroporazione (Figura 5B). </li><li> A 3 dpa, scattare un&#39;altra foto della pinna di ogni pesce e abbinare questa immagine con l&#39;immagine corrispondente 2 dpa (Figura 5B). La variazione naturale del modello di pinna pigmentazione tra gli animali vi permetterà di identificare correttamente i singoli pesci. </li><li> Utilizzando immagini NIH, tracciare le 2 aree dpa e 3 dpa di entrambe le metà dorsale e ventrale (Figura 5B). </li><li> Per determinare l&#39;area% di utilizzo rispetto dorsale ventrale la seguente formula: (dorsali 3dpa - dorsali 2dpa) / (ventrale 3dpa -<html> 2dpa ventrale) X 100 = area% </li></ol> 6. Risultati rappresentativi <ol><li> Abbiamo sempre saggio per outgrowth fin a 3 hpe dpa, o 24 (ore dopo la elettroporazione). A questo punto, la fluoresceina-etichettato morfolino dovrebbe essere presente nella metà dorsale della pinna (supplementare Figura 1 e Figura 6A). È normale vedere qualche finali fino al livello di amputazione. </li><li> Non ci dovrebbe essere differenza tra i lati dorsale e ventrale nella pinna iniettato e elettroporate con il Morpholinos controllo (Figura 6B). </li><li> Se il morfolino sperimentale destinato a una proteina essenziale per la pinna escrescenza, una differenza drammatica tra i lati dorsale e ventrale deve osservare (Figura 6C). </li><li> Se l&#39;elettrodo ha toccato la pinna durante elettroporazione, il tessuto apparirà marrone (quasi bruciato in apparenza) e necrotico. </li></ol>&quot;Src =&quot; / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schematica dei vari eventi che si verificano durante la rigenerazione della pinna. I tempi alla base di ogni evento sono indicati in ore post-amputazione (hpa) e corrispondono ad una temperatura del serbatoio di 33 ° C. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig2.jpg" /> Figura 2. A. Schematica della piastra di iniezione, che è fatto di agarosio e contiene un pozzetto per tenere il pesce durante microiniezione del morfolino. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig3.jpg" /> Figura 3. Schema di microiniezione morfolino. A. Inserire il pesce nel piatto con la testa del pesce nella tacca tagliato fuori dal pozzo, che aiuterà il pesce resta stabile. B. A basso ingrandimento, disporre l&#39;ago in modo che è vicino al tessuto rigenerazione della pinna. C. </stro&gt; ng A maggiore ingrandimento, iniettare il distale per ogni raggio fin ossea (cioè in ogni blastema) morfolino. L&#39;ago deve entrare nel tessuto appena distale al raggio ossea (1), e poi proseguire fino alla posizione del blastema (2). Nota: i cerchi verdi nello schema servono solo per mostrare la posizione di iniezione. Il morfolino può brevemente essere visualizzato come una giallo / verde &quot;sfoglia&quot; dopo ogni iniezione, tuttavia, questo non persistono come mostrato nello schema. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di elettroporazione pinna. A. In seguito a microiniezione, mettere il pesce in una capsula di Petri piena di anestesia e elettroporare entrambe le parti dorsali e ventrali. B. Assicurarsi di non toccare il tessuto pinna. Elettrodi deve essere posto ~ 1 mm dal tessuto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig5.jpg" /> <strong&gt; Figura 5. Schema dei metodi utilizzati per calcolare l&#39;inibizione fin escrescenza. A. Scatta una foto della pinna di ogni pesce a 2 dpa, o immediatamente prima o dopo l&#39;iniezione morfolino ed elettroporazione. Tracciare la tessuti rigenerabili sia della dorsale (verde) e ventrale (blu) metà della pinna con NIH Image, (linee nere tratteggiate). B. A 3 dpa, scattare un&#39;altra foto di ciascuna aletta e di nuovo risalire le zone dorsale e ventrale di ricrescita usando l&#39;immagine NIH. C. Sottrarre la zona di ricrescita a 2 dpa dalla ricrescita totale a 3 DPA sia per i ricchi dorsale e ventrale. L&#39;area percentuale di dorsale rispetto ventrale ricrescita può essere calcolata utilizzando la formula: ((D 3dpa - D DPA 2) / (V 3dpa - 2dpa V)) X 100. Percentuale di inibizione = 100 - Area per cento. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig6.jpg" /> Esempi Figura 6. Di attesarisultati. immagine A. fluorescente che mostra una fluoresceina-tag controllo morfolino nella metà dorsale della pinna, 24 ore post-elettroporazione (hpe). B. immagine Brightfield di una pinna che è stato iniettato e elettroporata con un morfolino controllo nella metà dorsale . L&#39;immagine mostra la ricrescita parità di entrambe le parti dorsali e ventrali di una pinna, 24 hpe. C. Brightfield immagine di una pinna che è stato iniettato e elettroporate con un morfolino sperimentale nella metà dorsale. L&#39;immagine mostra inibizione della ricrescita sulla dorsale / iniettato lato. La linea mostra la quantità di ricrescita a 2 dpa, immediatamente prima dell&#39;iniezione morfolino ed elettroporazione. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig7.jpg" /> Figura 7. Schema di un&#39;iniezione alternativo e procedura di elettroporazione alle proteine ​​bersaglio coinvolti nella guarigione delle ferite e la formazione di blastema. A. Iniettare il morfolinotra ciascun raggio aletta ossea sul mezzo dorsale della pinna. B. elettroporare la morfolino come al solito. C. amputazione della pinna immediatamente prossimale (~ 1 segmento osseo) al sito di iniezione. D. La fluoresceina-morfolino etichettato può essere osservato nell&#39;epitelio delle ferite e blastema a 24 hpe. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig8.jpg" /> Figura 8. Utilizzando la tecnica di indirizzare l&#39;epitelio della ferita e la formazione blastema. A. Brightfield immagine di una pinna a 24 hpa che è stato iniettato e elettroporate con un morfolino controllo immediatamente prima dell&#39;amputazione. B. immagine fluorescente di pinna mostrato nella nota pannello A. che il mezzo iniettato dorsale della pinna mostra l&#39;assorbimento bene della morfolino nel tessuto rigenerativa. C -. C &quot;ingrandimento superiore della metà dorsale della pinna mostrato in pannelli A e B. I siti di iniezione sono spesso ancora visibili (frecce), Ma molte cellule bersaglio sono migrati a partecipare nell&#39;epitelio delle ferite e la formazione di blastema (freccia). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3632/3632fig9.jpg" /> Figura 9. Utilizzando la tecnica per colpire le cellule che migrano per formare l&#39;. Blastema A. fluorescente e le immagini che mostrano brightfield incasso una pinna iniettato e elettroporate con morfolino su entrambe le metà dorsale e ventrale. La pinna è stata poi amputata a due piani. La parte dorsale è stata tagliata immediatamente distale ai siti di iniezione, dove, come la metà ventrale è stata tagliata 9-10 segmenti ossei distali ai siti di iniezione. B. A 24 anni hpa, le immagini fluorescenti e brightfield incasso dimostrano che morfolino sia migrata alla dorsale rigenerare (1), ma non rigenerato ventrale (2), indicando che solo la cella immediatamente prossimale al sito di taglio partecipare alla formazione blastema. Le due serie di frecce bianche indicano il livello di ogni amputazioneaereo. Pannelli segnato 1 e 2 all&#39;estrema destra dell&#39;immagine mostra una vista ingrandimento maggiore delle due metà dorsali e ventrali della pinna, rispettivamente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3632/Suppl_Fig1_JoVE.mov">Supplementare Figura 1.</a> Un video di un microscopio confocale z-pila di una regione corrispondente alla posizione di un blastoma in una pinna iniettato e elettroporata con un morfolino controllo. L&#39;immagine è stata scattata a 24 hpe. Poiché una singola molecola fluoresceina non può essere visualizzata, non tutto il morfolino può essere visualizzata o quantificati. Tuttavia, queste immagini danno un&#39;idea dei vari gradi di assorbimento che possono essere visualizzati nelle cellule, da singoli punti puntata, alle cellule intere piene di morfolino fluorescente. Sul fermo immagine, l&#39;orientamento viene mostrato. Scale bar: 25 micron.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf-dependent+depletion+of+microRNA-133+promotes+appendage+regeneration+in+zebrafish.">Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish.</a> Genes Dev. 22, 728-733 (2008).</li><li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish:+a+new+tool+to+study+fin+regeneration.">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un potente perdita di funzione di approccio al condizionale proteine ​​atterramento di interesse durante la rigenerazione della pinna in zebrafish adulto. Questa tecnica è stata utilizzata per studiare i geni giunzioni gap, segnalando recettori, fattori di trascrizione, e microRNA durante escrescenza pinna rigenerativa 16, 20-22. Prevediamo che questa tecnica può anche essere usato per studiare geni necessari per la guarigione della ferita e formazione blastema adattando la tecnica. Ad esempio, abbiamo iniettato ed elettroporati uno morfolino controllo nello spazio tra i raggi della pinna ossee sulla metà dorsale della pinna prima amputazione (Figura 7). Abbiamo poi amputata la pinna immediatamente distale al piano di iniezione. 24 hpa, abbiamo osservato che le morfolino-targeting cellule erano migrate distalmente per formare sia l&#39;epitelio ferita e blastema (Figura 8), indicando che le cellule durante queste prime fasi di rigenerazione possono anche essere Targeted. La tecnica ha alcune limitazioni notevoli. Ad esempio, fluorescenza dal tag fluoresceina non persistono fissazione seguente e trattamento per immunoistochimica, che rende possibile correlare un particolare fenotipo cellulare (cioè la proliferazione cellulare) con la quantità di morfolino presente in una cellula. Inoltre, siamo stati in grado di raggiungere sempre l&#39;elettroporazione di plasmidi nella rigenerazione della pinna caudale, anche se un gruppo precedente ha fatto segnalare l&#39;elettroporazione di successo di DNA nel tessuto fin 23. Infine, abbiamo notato che il morfolino è efficace solo per ~ 48 ore dopo l&#39;elettroporazione 21, che vieta utilizzando questa tecnica nella sua forma attuale per testare i geni coinvolti nella differenziazione dei tipi di cellule nuove. Ulteriori test e modifica del procedimento può superare queste limitazioni attuali. Inoltre, è possibile che questa tecnica può essere utilizzatatestare proteine ​​coinvolte nella migrazione cellulare dal tessuto sottostante al blastema. Ad esempio, abbiamo iniettato ed elettroporati un controllo morfolino in entrambi i lati della pinna (come descritto nella Figura 7) prima amputazione. Abbiamo poi amputato metà dorsale della pinna immediatamente distale al piano di iniezione e amputato la pinna ventrale molto più distalmente. A 24 hpa, i morfolino cellule positive sul lato dorsale erano migrati dal sito di iniezione per l&#39;epitelio sovrastante ferita e blastema. Tuttavia, ciò non è avvenuto sul lato ventrale (Figura 9). Questo supporta l&#39;idea che solo le cellule che stanno alla base del piano di amputazione partecipare alla risposta rigenerativa. Questi dati suggeriscono inoltre ipotizzato che le proteine ​​devono essere richiesti per la migrazione delle cellule potrebbe essere testati utilizzando questa tecnica.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT o CUY21-SC Square wave elettroporatore </td><td> Protech internazionale </td><td> CUY21EDIT o CUY21SC </td><td> Entrambe le unità lavorare per questo protocollo </td></tr><tr><td> 3 mm di diametro paddle elettrodi </td><td> Protech internazionale </td><td> Cuy 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino devono essere progettati su misura per la vostra proteina di interesse </td></tr><tr><td> 2-Phenoxyethanol </td><td> Sigma </td><td> 77.861-1L </td><td> Anestesia, diluito 1:1000 in acqua i pesci sistema per la procedura, 1:500 per l&#39;eutanasia </td></tr><tr><td> Micro-injectisulla pompa </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> PV830 pneumatico PicoPump </td><td> Molti sistemi microiniezione differenti potrebbero essere utilizzati </td></tr><tr><td> Micro-manipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> MMJR </td><td> Mano destra (MMJL per mancini) </td></tr><tr><td> Micro-iniezione aghi, 1,0 mm di diametro esterno </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B100F-4 </td><td> Questi sono in vetro borosilicato capillari, tirato in un ago </td></tr><tr><td> Porta aghi </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5430-ALL </td><td> Nozzle Kit Pico, assicurarsi di incasso del 1,0 millimetri pipetta guarnizione </td></tr><tr><td> Needle puller </td><td> Sutter </td><td> P-97 </td><td> Altri micropipette / ago estrattori dovrebbe funzionare anche </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Leica, Nikon, Zeiss </td><td> Numero varia a seconda del produttore </td><td> Qualsiasi stereomicroscopio con ottica 20X e la possibilità di lavorare con micromanipolatori </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin

Alcune specie di urodeli e pesce teleosteo possono rigenerare i loro tessuti. Zebrafish sono diventate un modello ampiamente usato per studiare la rigenerazione spontanea di tessuti adulti, come il cuore 1, 2 retina, midollo spinale 3, 4 nervo ottico, cellule sensoriali 5, e alette 6. La pinna zebrafish è un&#39;appendice relativamente semplice che può essere facilmente manipolato per studiare le fasi più nella rigenerazione epimorphic. Classicamente, la rigenerazione della pinna è stata caratterizzata da tre fasi distinte: la guarigione della ferita, formazione blastema e outgrowth pinna. Dopo amputare parte della pinna, l&#39;epitelio circostante prolifera e migra sulla ferita. Al 33 ° C, questo processo si verifica entro sei ore post-amputazione (hpa, Figura 1B) 6,7. Successivamente, le cellule sottostanti da stirpi diverse (es. ossa, sangue, glia, fibroblasti) rientrare nel ciclo cellulare per formare un blastema proliferativa, wsebbene il epidermide sovrastante continua a proliferare (Figura 1D) 8. Escrescenza si verifica come cellule prossimali al blastema ri-differenziano nei loro rispettivi lignaggi per formare nuovo tessuto (Figura 1E) 8. A seconda del livello di amputazione, rigenerazione completa viene completato in una settimana per un mese. L&#39;espressione di un gran numero di famiglie di geni, tra cui WNT, Hox, FGF, MSX, acido retinoico, shh, tacca, bmp, e activina A-beta geni, è up-regolato durante le fasi specifiche di rigenerazione fin 9-16. Tuttavia, il ruolo di questi geni e loro proteine ​​codificate durante la rigenerazione è stato difficile da valutare, a meno che un inibitore specifico per la proteina esiste 13, un sensibile alla temperatura esiste mutante o un animale transgenico (o sovraespressione della proteina wild-type o dominante -negativo proteina) è stato generato 7,12. Abbiamo sviped una tecnica di genetica inversa per testare rapidamente e facilmente la funzione di ogni gene durante la rigenerazione della pinna. Morpholino oligonucleotidi sono ampiamente utilizzati per studiare la perdita di proteine ​​specifiche durante zebrafish, Xenopus, pulcino, e lo sviluppo topo 17-19. Morpholinos coppia di basi con una sequenza complementare a RNA o pre-mRNA splicing blocco o traduzione dell&#39;mRNA. Descriviamo un metodo efficiente per introdurre fluoresceina-etichettato antisenso Morpholinos in rigeneranti alette zebrafish per knockdown espressione della proteina bersaglio. Il morfolino è micro-iniettata in ogni blastema della pinna rigenerante zebrafish coda e elettroporate nelle cellule circostanti. Fluoresceina fornisce la carica per la elettroporare morfolino e per visualizzare il morfolino nel tessuto pinna. Questo protocollo permette atterramento condizionale proteine ​​per esaminare il ruolo di specifiche proteine ​​nel corso escrescenza fin rigenerativa. Nel Discussion, si descrive come questo approccio può essere adattato per studiare il ruolo di specifiche proteine ​​durante la guarigione di ferite o formazione blastema, nonché un potenziale marcatore di migrazione cellulare durante la formazione blastema.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l&#39;espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

16.9K Views.  University of Notre Dame. Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l'espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Cella singola elettroporazione in vivo all&#39;interno del cervello intatto in via di sviluppo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Elettroporazione di micobatteri

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Riepilogo

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