Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01 HD050901 di MCM e americana Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041-01-DDC al TG.

<ol><li> Un pesce zebra maschio sarà sezionato per primo, seguito da un pesce femmina. Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare un pesce nello 0,2% Tricaine e poi l&#39;eutanasia dalla incubazione in acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Iniziare con una leggera accarezzando il pesce secco su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia dissezione. Esternamente, pesce zebra hanno un&#39;unica dorsale, pinna caudale e anale e associato pinne pettorali e pelviche (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Adulto pesci di sesso maschile con le pinne etichettati. </li><li> Pin il pesce al tappeto dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la parte ventrale della cavità oculare. </li><li> Tagliare la pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale per l&#39;opercolo (il rivestimento duro sopra la branchia) (Figura 2, punto 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Passi nella rimozione della pelle e la parete muscolare del corpo per esporre gli organi interni. </li><li> Quindi, rimuovere l&#39;opercolo e la pinna pettorale, tra cui la cintura pettorale (la spessa, regione ossea alla base della pinna) (Figura 2, punto 2). Tagliare la pelle e l&#39;inizio del muscolo sottostante dall&#39;alto del ora esposti branchie posteriormente lungo il lato del pesce e poi giù per la pinna anale (Figura 2, punto 3). </li><li> Rimuovere con cura la pelle e muscolo sottostante dal lato del pesce. Molti degli organi interni sono ora visibili (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Pesci adulti di sesso maschile con la parete del corpo e dei muscoli rimossi permettendo la visualizzazione degli organi interni. </li><li> I testicoli sono lunghe, bianche, organi accoppiati che sono attaccate alla parete dorsale del corpo. Rimuovere un testicolo e mettetelo in un piatto di PBS. Esaminare il testicolo di luce riflessa di visualizzare i tubuli seminiferi (Figura 4), che contengono le cisti con varie fasi di sviluppo di cellule germinali da spermatagonia a spermatidi (Leal et al., 2009). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Dissezione di un testicolo. Le strutture bianche tondeggianti sono i tubuli seminiferi. </li><li> Quindi, rimuovere il sistema gastrointestinale dalla cavità del corpo del pesce. Il fegato può essere identificato per le grandi dimensioni, morfologia lobi, colore tannish, e la vascolarizzazione estesa. La colecisti, un verde traslucido sacco pieno di liquido, e la milza, che appare rosso vivo, si trovano all&#39;interno del viscere. </li><li> Separare l&#39;intestino dal resto degli organi e tratto fuori. L&#39;anteriore, le regioni a metà, e posteriore dell&#39;intestino sono definiti da l&#39;altezza delle pieghe epiteliali (Wallace et al., 2005). </li><li> Posizionare un pezzo di intestino in PBS e osservare le pieghe epiteliali a luce trasmessa. </li><li> Successivamente, esaminare la vescica natatoria. La vescica natatoria è costituito da una camera posteriore, che è collegato all&#39;esofago attraverso il dotto pneumatico, e una camera anteriore, che è collegata all&#39;orecchio interno attraverso l&#39;apparato weberiano (Finney et al., 2006). </li><li> Rimuovere e gettare la vescica natatoria. Sblocca il pesce e ri-pin che lato ventrale fino a sezionare il rene, che si trova lungo la parete del corpo dorsale. Il rene è una struttura trasparente rosa, associata con l&#39;aorta dorsale e cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni della testa, corpo e coda (Figura 5). Sezionare un pezzo del rene e metterlo in PBS. Prendere in giro a parte il tessuto renale per rivelare i tubuli renali. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Posizione testa, corpo, e rene coda lungo la parete dorsale del corpo. </li><li> Sezionare un pesce femmina. Come descritto in precedenza, l&#39;eutanasia il pesce in acqua ghiacciata e pat asciugare prima di pinning al tappeto dissezione. Togliere la pelle dal lato del pesce come precedentemente dimostrato. L&#39;ovaio è una struttura bilobata che è sospeso nella cavità del corpo da un mesovarium vascolarizzato. </li><li> Rimuovere un lobo delle ovaie, è posto in PBS, ed esaminarlo con luce trasmessa. Gli ovociti possono essere presi in giro a parte utilizzando aghi sottili e poi messo in scena (Figura 6, Selman et al., 1993). Stadio I ovociti sono circa 10 - 150 micron di dimensione e traslucido. Ovociti fase II sono circa 150 - 350 micron nel formato e definito dalla comparsa di granuli corticali. Ovociti stadio III sono 350-750 micron e sono opachi a causa dell&#39;accumulo di tuorlo. Ovociti maturi stadio IV e V sono trasparenti e generalmente non si trovano nelle ovaie delle femmine che hanno recentemente accoppiato. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Palco dal vivo I, II, III e ovociti osservati sotto undissezione microscopio a luce trasmessa. </li><li> Successivamente, sezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova posteriore e ventrale alla branchia. Iniziate tagliando fuori il cuore e tutto il tessuto circostante e mettendolo in PBS. Con attenzione sezionare via il tessuto che circonda il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l&#39;atrio delicato. </li><li> Mettere il cuore sezionato in soluzione di Ringer per osservare il battito cardiaco. Identificare l&#39;atrio, ventricolo e bulbo arterioso (Figura 7, Hu et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Dissected cuore adulto. </li><li> Completa la dissezione rimuovendo il cervello dal pesce. Inizia unpinning il pesce e la rimozione della testa con una lama di rasoio. Rimuovere il più possibile i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Rimuovere gli occhi con le forbici piccola sorgente. Rompere il cranio e togliere l&#39;osso dalla parte ventrale del cervello. Ora posto la testa in un piatto di PBS e togliere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello. </li><li> Identificare i bulbi olfattivi, telencefalo, habenula, tetto ottico, cervelletto e midollo (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Dissected zebrafish cervello adulto. Vista dorsale, anteriore verso l&#39;alto. </li></ol>

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	<li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+(Danio+rerio).">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li><li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish.">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li><li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., N&#243;brega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., Fran&#231;a, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+(Danio+rerio)+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations.">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li><li>Schilling, T. F., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish.">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). , (2002).</li><li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish,+Brachydanio+rerio.">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li><li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish.">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li><li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , (1996).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla University of Animal Care Pennsylvania e del Comitato Istituzionale Usa.

Reagenti: 0,2% Tricaine (3-etil aminobenzoate) 200 mg polvere tricaine 97,9 ml di acqua DD ~ 1 ml di 1 M Tris (pH 9) Regolare il pH a 7,0 Tampone fosfato (PBS) 4,0 g di NaCl 0,1 g KCl 100 ml PO 4 0,1 M tampone, pH 7,3 150 ml di dH 2 O Soluzione di Ringer 6.7g di NaCl 0,2 g KCl 0,2 g CaCl 2 1.2g Hepes 1 LH 2 O Regolare il pH a 7,2 Attrezzatura: Dissezione piatto con tappetino Electron Microscopy Sciences Catalogo # 70540 Vännäs primavera forbici Strumenti Scienza multa Catalogo # 91500-09

dissection of organs from the adult zebrafish

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra è diventato un organismo modello potente per la comprensione dello sviluppo dei vertebrati e le malattie. Anche se l&#39;analisi sperimentale degli embrioni e larve è ampia e la morfologia è stato ben documentato, descrizioni di anatomia zebrafish adulti e studi di sviluppo delle strutture per adulti e degli organi, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti sono carenti. Gli organi della larva subire importanti cambiamenti nella loro struttura complessiva, la morfologia e la posizione anatomica durante le larve di transizione per adulti. Esternamente, la larva trasparente sviluppa il suo modello caratteristico pigmento strisce adulti e coppie pinne pelviche, mentre internamente, gli organi subiscono un&#39;enorme crescita e rimodellamento. Inoltre, il primordio bipotential gonade si sviluppa in entrambi i testicoli o ovaie. Questo protocollo identifica molti degli organi degli adulti e vengono utilizzati dei metodi per la dissezione del cervello, gonadi, apparato gastrointestinale, cuore, reni e del pesce zebra adulto. Gli organi sezionati può essere utilizzato per l&#39;ibridazione in situ, tecniche di immunoistochimica, istologia, estrazione di RNA, analisi delle proteine, e altri molecolare. Questo protocollo aiuterà a l&#39;ampliamento di studi nel zebrafish per includere la ristrutturazione degli organi larvali, la morfogenesi degli organi specifici per le indagini adulti e altri sistemi di organi adulti.

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Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Questo protocollo descrive una procedura per l&#39;individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

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Research

JoVE Journal

Biology

103.3K Views.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Questo protocollo descrive una procedura per l'individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.