Questo studio è stato supportato da Juvenile Diabetes Research Foundation concedere 5-2007-97 (a PEV), dall&#39;Istituto Nazionale del Diabete e digestive e Malattie Renali concede R01DK064973 (a PEV), R01DK48494 (a LHP), T32DK07074 (supporto SCE), K01DK083552 (a MDK), e da P60DK20595 per L&#39;Università di Chicago Ricerca Diabete e Training Center. I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIDDK o il NIH.

1. Preparativi pre-iniezione <ol><li> Veloce il pesce per almeno 24 ore prima dell&#39;iniezione. Questo svuotare il bulbo intestinale (stomaco) contenuti. Il protocollo digiuno di base è quello di trasferire il pesce, a loro densità normale, ad un serbatoio pulito, poi trattenere il cibo. Per lungo periodo di digiuno che richiede condizioni più rigorose (ad esempio, per gli studi di glucosio nel sangue), vedi considerazioni aggiuntive alla discussione. </li><li> Preparare la soluzione salina Cortland (Perry et al., 1984). Per un volume di 100 mL, sciogliere le seguenti in acqua distillata: 725 mg NaCl (124,1 mM) KCl 38 mg (5,1 mm) 41 mg di Na 2 HPO 4 (2,9 mm) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm) 100 mg di NaHCO 3 (11,9 mm) 4 g Polivinilpirrolidone (PVP) (4%) 1.000 unità di eparina USP Filtro, sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare il microscopio. <ul><li> Coprire la base del microscopio con pellicola trasparente per la protezione in caso di fuoriuscita. </li><li> Mettete un tovagliolo di carta sulla parte superiore della pellicola trasparente. Il tavolo operatorio siederà sulla parte superiore del tovagliolo di carta. </li><li> Pre-la messa a fuoco visualizzando il tavolo operatorio e concentrandosi sulla spugna. </li></ul> Suggerimento: Metti il ​​tuo dito sopra la spugna e concentrarsi su quello. In questo modo eliminare o ridurre ulteriormente la regolazione focale una volta che il pesce è sul tavolo operatorio. </li><li> Pesare il pesce. <ul><li> Riempire un bicchiere da 500 ml circa 1 / pieno con pesci d&#39;acqua impianto di 3. </li><li> Tarare la bilancia. </li><li> Raccogliere il pesce con una rete. Wick l&#39;acqua in eccesso lontano dalla rete e il pesce con una breve tamponando la rete su carta assorbente. Trasferire il pesce nel becher. </li><li> Pesare il pesce. </li><li> Trasferire il pesce in una vasca pulita. </li><li> Trasferimento ogni pesce pesato proprio serbatoio etichettati. </li><li> Calcolare il volume di iniezione per ogni pesce in base al peso del pesce. </li></ul></li><li> Preparare la siringa d&#39;iniezione e delle attrezzature connesse. Per l&#39;iniezione, si consiglia una 35G ago smussato in acciaio e una microsiringa da 10 microlitri NanoFil. Preparare la siringa e il tubo NanoFil silflex seguendo le istruzioni del produttore. E &#39;importante rimuovere eventuali bolle dalla siringa e tubo. Dopo aver riempito la siringa e il tubo, montare la siringa sulla pompa, e programmare il volume di iniezione per il primo pesce. </li><li> Preparare il tavolo operatorio. <ul><li> Tagliare una spugna morbida (ad esempio # L800-D, Jaece Industrie) in modo che sia di circa 20 mm di altezza. Sulla superficie piatta, fare un taglio che è di 10-15 mm di profondità. Questo taglio è il tramite che conterrà il pesce per l&#39;iniezione. </li><li> Impostare la spugna in un piatto 60 millimetri Petri. </li><li> Impostare la piastra Petri con spugna in una di dimensioni adeguate e coperchio della scatola punta della pipetta. Il coperchio deve essere abbastanza grande da contenere acqua per aiutare a mantenere la temperatura di spugna, ma dovrebbe essere sufficiente per ottenere superficiale non nel modo. Noi usiamo un coperchio di una scatola P200 punta che è di 11,4 cm L x 7,7 cm L x 1,5 cm D. </li></ul> Questi tre elementi assemblati (spugna in Petri a coperchio della scatola) costituiscono il tavolo operatorio. </li><li> Preparare l&#39;anestetico. <ul><li> Fai utilizzando cubetti di ghiaccio tritato a base di pesci d&#39;acqua impianto. </li></ul> Suggerimento: l&#39;utilizzo dei cassetti tipico cubetto di ghiaccio, ci vorranno 3 vassoi per anestetizzare 10-12 pesci. <ul><li> Riempire un secchio pulito ghiaccio con il ghiaccio tritato. </li><li> Mettere il tavolo operatorio in un contenitore più grande, come un contenitore di 2,4 litro di stoccaggio degli alimenti Rubbermaid. </li><li> Versare un pò d&#39;acqua impianto (calda) nel contenitore esterno e il tavolo operatorio. Mantenere una riserva di acqua calda impianto nelle vicinanze. </li><li> Metti un termometro nel contenitore esterno. </li></ul></li></ol> 2. Anestesia, iniezione e di recupero <ol><li> Posizionare il contenitore esterno e anestetico tavolo operatorio adiacente al microscopio. Hanno il secchio di cubetti di ghiaccio vicine. </li><li> Portare la temperatura dell&#39;acqua fino a 17 ° C con l&#39;aggiunta di pezzetti di ghiaccio. Importante: non scendere sotto i 17 ° C per questo passo. </li><li> Utilizzare una rete per trasferire il pesce al contenitore esterno. </li><li> Lentamente aggiungere cubetti di ghiaccio al contenitore per portare la temperatura fino a 12 ° C, nel corso di diversi minuti. </li><li> Monitorare il comportamento dei pesci: A 17 ° C o leggermente inferiore, il pesce tipicamente diffonderà i suoi pettorali in orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Quando la temperatura scende, i pesci nuotano più lentamente e finalmente smettere di nuotare. Mentre l&#39;aereo chirurgico di anestesia si avvicina, ansimante si ferma e rallenta i movimenti opercolo. Il pesce è pronto per l&#39;iniezione quando non reagisce a essere maneggiati. Per la maggior parte dei pesci, 12 ° C è sufficiente. I pesci più grandi può richiedere più fredde water. </li><li> Come la temperatura desiderata viene raggiunta (~ 12 ° C o inferiore), premere sulla spugna per saturare esso. </li><li> Tenete le dita in acqua fredda a sufficienza in modo che non si riscalda il pesce e portarlo fuori di anestesia durante la manipolazione. </li><li> Con le dita fredde, delicatamente trasferire il pesce al trogolo della spugna. Posizionare il pesce con l&#39;addome e le branchie nel trogolo. </li><li> Trasferire rapidamente il tavolo operatorio alla fase microscopio. </li><li> Lavorare con rapidità, accuratezza inserire l&#39;ago nella linea mediana tra le pinne pelviche. L&#39;ago deve puntare cranialmente ed essere inseriti più vicino al cingolo pelvico che per l&#39;ano. Dovreste essere in grado di sentire quando l&#39;ago è profondo alla parete del corpo. Iniettare il volume appropriato e ritirare l&#39;ago. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, trasferire immediatamente il pesce alla sua acqua calda (~ 28,5 ° C) Serbatoio per il recupero rilasciando il pesce dalla spugna sopra l&#39;acqua del serbatoio. Suggerimento: se il pesce non inizia immediatamente nuoto, aiutarla a recuperare rimestando delicatamente acqua verso le branchie. </li><li> Controllare l&#39;ago. Occasionalmente una scala può essere fissata e deve essere rimosso prima della successiva iniezione. </li><li> Per le successive iniezioni, usare acqua tiepida struttura per portare la temperatura della camera anestetico acqua torna fino a 17 ° C prima di introdurre il pesce successiva. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentante risultati dopo l&#39;iniezione intraperitoneale di 0,5 mg / g di glucosio o di un veicolo. Pesci sono stati a digiuno per 72 ore prima dell&#39;iniezione. L&#39;asse x mostra il tempo, dopo l&#39;iniezione. Media ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Iniezione intraperitoneale prevede cinque fasi: il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Per ogni tappa ci sono buone pratiche che possono assicurare il successo. Successo include un paziente sano pesce, nonché un buon risultato sperimentale. Il digiuno: A 24 ore di digiuno dovrebbe svuotare il bulbo intestinale. Questa pratica è tratto dalla letteratura veterinaria pesce (per esempio, Brown, 1993). Ulteriori considerazioni digiuno sono discussi di seguito. A lungo termine il digiuno: Abbiamo scoperto che una di 72 ore di digiuno è richiesto di ridurre il glucosio nel sangue a un livello base prima dell&#39;iniezione (Eames et al, 2010).. Abbiamo anche scoperto che per gli studi di glucosio ci sono diverse procedure che sono necessarie per garantire che i pesci sono a digiuno in modo corretto. Inizia con un serbatoio pulito (senza residui sul fondo). Cisterne devono essere in linea, chiaramente etichettati come &#39;digiuno&#39;, e in una posizione dove entusiasta personale di assistenza di pesce non li alimentano. Valutare l&#39;ambiente esterno della cisterna e di prendere misure per evitare che il pesce venga sottolineato da disturbi, come lo stress è noto per aumentare la glicemia (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Per esempio, abbiamo avuto un esperimento digiuno in cui è stato operato una radio ogni giorno sulla panchina che aveva in mano le vasche dei pesci. Abbiamo scoperto che il glucosio nel sangue era insolitamente alto e ha concluso che i pesci erano sottolineato dalle vibrazioni. Un altro fattore di stress è il sovraffollamento. I pesci devono essere mantenuti a una densità che è conforme con le buone pratiche di allevamento dei pesci. Per i consigli, vedere Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Abbiamo avuto buoni risultati digiuno nostri pesci con una densità di 10-12 pesci in un acquario 9 litro (con 3 strati di marmi occupare parte di questo volume). La separazione dei sessi può causare stress, quindi si consiglia di mantenere un misto di sesso popolazione durante il digiuno. Ciò significa che le uova possono essere deposte, e le uova devono essere sequestrato in modo che non sarà mangiato. Un modo semplice per sequestrare le uova è di coprire il fondo della vasca con 2-3 strati di marmi. La qualità dell&#39;acqua deve essere mantenuto, eliminando uova e rifiuti e sostituendo circa il 10-15% dell&#39;acqua della vasca, tutti i giorni. Per la rimozione di uova e rifiuti, sifone funziona bene. Peso: quando pesare i pesci che non sono anestetizzate, si dovrebbe aver cura di ridurre al minimo il trasferimento di acqua dalla rete nel becher, per garantire la precisione di pesatura. Se la rete (con pesce) è cancellata su carta assorbente, la maggior parte l&#39;acqua in eccesso può essere rimosso, e il peso può essere misurata con precisione. Può essere più facile per anestetizzare il pesce prima della pesata, ma non abbiamo testato gli effetti possibili di anestetizzare un pesce due volte in un giorno. Abbiamo testato la nostra tecnica pesando il primo pesce con la rete / assorbente metodo e poi pesando il pesce dopo che è stato anestetizzato, e delicatamente asciugate. Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel peso tra i metodi (P = 0,7927, t-test). Inoltre, abbiamo testato se questa rete / assorbente di glucosio nel sangue colpite metodo, rispetto al semplice trasferimento del pesce al bicchiere non appena si compensano (senza assorbente). Abbiamo trovato alcuna differenza significativa nel livello di glucosio nel sangue tra i due metodi di trasferimento (p = 0,2241, t-test). L&#39;anestesia: l&#39;anestesia chimica può essere adatto a molti studi. Qui abbiamo dimostrato l&#39;anestesia acqua fredda, in alternativa, in quanto gli anestetici molti (tra cui tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentare il glucosio nel sangue. In studi precedenti, abbiamo stabilito che l&#39;acqua fredda non solleva glicemia nel pesce zebra (Eames et al., 2010). Per l&#39;anestesia acqua fredda, la temperatura deve essere ridotta lentamente. Il tasso di riduzione sembra dipendere dalle dimensioni del pesce, con pesci più piccoli di andare sotto più veloce di pesci più grandi. Dopo l&#39;iniezione, si può osservare che il pesce si sta riprendendo da troppo lentamente l&#39;anestetico (vedi sotto). Ciò può portare, quando sia la temperatura iniziale è troppo bassa, o quando la temperatura diminuisce troppo rapidamente. La temperatura di partenza è troppo bassa se il pesce si piega lateralmente entrando l&#39;acqua. Se la temperatura di partenza è corretto, il pesce mantiene il suo equilibrio inizialmente. Ruoterà sue pinne pettorali in posizione orizzontale, senza fiato, e hanno movimenti rapidi opercolo. Tipicamente, si nuotare. Al diminuire della temperatura, i movimenti si riduce e il pesce perde l&#39;equilibrio. Un aereo chirurgico di anestesia viene raggiunta quando il pesce può essere gestita senza reagire. Per mantenere il pesce in anestesia chirurgica, le dita devono essere fredde, in modo da tenerli in acqua prima del trattamento del pesce. La spugna deve essere mantenuto freddo alla stessa temperatura come l&#39;acqua utilizzata per anestetizzare i pesci. E &#39;importante saturare la spugna con l&#39;acqua che è sufficiently freddo per mantenere l&#39;anestesia una volta che il pesce viene posto su di esso. Iniezione: Prima di iniezioni di impresa, si consiglia di analizzare almeno un pesce per avere un&#39;idea dello spessore della parete del corpo. Questo può aiutare a valutare in quale misura l&#39;ago deve inserire per accedere alla cavità addominale. Inoltre, come si inserisce l&#39;ago, si può sentire la parete del corpo &quot;dare&quot; quando l&#39;ago entra nella cavità addominale. Durante l&#39;iniezione, prendere misure per mantenere il paziente felice. Assicurarsi che la spugna è saturata con l&#39;acqua fredda della temperatura corretta per evitare che il pesce da far rivivere durante l&#39;iniezione. Una spugna ben saturi e morbida è importante per minimizzare i danni alle scale e muco la copertura della cute. A ben saturi spugna è importante anche per mantenere le branchie aerato. Consigliamo vivamente la spugna in schiuma di seguito elencati sotto Materiali. Infine, una volta che il pesce è anestetizzato, lavorare velocemente per minimizzare il tempo che il pesce è sotto. Recupero: Il pesce deve riprendersi dalla anestesia praticamente entrando l&#39;acqua calda del serbatoio. Se il pesce non inizia immediatamente nuoto, capovolgere delicatamente l&#39;acqua verso le branchie per accelerare il recupero. Se il recupero è lento, poi il pesce è andato sotto troppo in fretta e si dovrebbe regolare la procedura di anestesia in modo appropriato. Le possibili cause della lenta ripresa sono discussi in Anestesia.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Un metodo conveniente per trattare chimicamente zebrafish è quello di introdurre il reattivo in acqua serbatoio, dove verrà ripreso dai pesci. Tuttavia, questo metodo rende difficile sapere quanto reagente viene assorbita o ripreso per i pesci. Alcune domande sperimentali, in particolare quelli relativi a studi metabolici, può essere meglio affrontata fornendo una quantità definita per ogni pesce, in base al peso. Qui vi presentiamo un metodo per intraperitoneale (IP) iniezione in zebrafish adulti. L&#39;iniezione è nella cavità addominale, posteriore al cingolo pelvico. Questa procedura è adattato da metodi veterinari utilizzati per pesci più grandi. E &#39;sicuro, come abbiamo osservato mortalità pari a zero. Inoltre, abbiamo visto sanguinamento nel sito di iniezione in solo 5 su 127 iniezioni, e in ciascuno di questi casi l&#39;emorragia è stata breve, della durata di alcuni secondi, e la quantità di sangue perso era piccola. Successo con questa procedura richiede una gestione delicata del pesce attraverso diversi passaggi tra cui il digiuno, pesatura, anestetizzante, iniezione, e il recupero. Precauzioni necessarie per minimizzare lo stress durante l&#39;intera procedura. Le nostre precauzioni includono l&#39;utilizzo di un piccolo volume di iniezione e un ago 35G. Noi usiamo soluzione salina Cortland come il veicolo, che è osmoticamente bilanciato per pesci d&#39;acqua dolce. L&#39;aerazione delle branchie è mantenuta durante la procedura di iniezione per prima cosa portare il pesce in un piano chirurgico di anestesia, che permette movimenti opercolo lenti, e la seconda, tenendo il pesce in una vasca all&#39;interno di un saturo d&#39;acqua spugna durante la stessa iniezione. Abbiamo dimostrato l&#39;utilità di iniezione IP, iniettando glucosio e il monitoraggio del livello del glucosio nel sangue e il suo successivo ritorno alla normalità. Lo stress è noto per aumentare il glucosio nel sangue nei pesci teleostei, mettiamo a confronto i livelli di glucosio nel sangue in adulti veicolo a iniezione e non per iniezione e dimostrare che la procedura non causa un significativo aumento del glucosio nel sangue.

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l&#39;uso di acqua fredda come anestetico.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

57.0K Views.  The University of Chicago. Dimostriamo iniezione intraperitoneale in zebrafish adulti. Usiamo una microsiringa da 10 microlitri NanoFil controllato da un controller Micro4 e UltraMicroPump III. Questa dimostrazione include l'uso di acqua fredda come anestetico.

Video: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

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Iniezione di dsRNA in femmine di A. aegypti Zanzare

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Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Zebrafish Cervello iniezione ventricolo

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...