Gli autori desiderano ringraziare la Vita Freimann Science Center e il Centro per il personale di ricerca Zebrafish per la loro cura e manutenzione del pesce zebra.

1. Morfolino preparazione: <ol><li> Tutti oligo morfolino devono essere progettati su misura e ordinato tramite GeneTools (Philomath, OR). Usiamo la carica positiva lissamina-tagged Morpholinos per guidare il Morpholinos elettroporate verso l&#39;elettrodo negativo. Abbiamo provato, senza successo, di bersaglio caricati negativamente fluoresceina tag Morpholinos per l&#39;elettrodo positivo utilizzando questa tecnica. Diluire 300 nmol di morfolino in 100 ml di acqua priva di nucleasi per produrre una soluzione di 3 mm. Aliquota del morfolino in più paraffina sigillati tubi microcentrifuga. Conservare al riparo dalla luce a temperatura ambiente. </li><li> Determinare la concentrazione morfolino diluendo 5 ml di morfolino (o l&#39;acqua usata per diluire il morfolino come bianco) in 95 ml di 0,1 N HCl. Impostare la lunghezza d&#39;onda spettrofotometro (λ) a 265 nm. Calcolare la costante per la vostra morfolino usando la seguente equazione: Costante = peso molecolare particolare ad ogni tua morfolino X assorbanza 1000/molar. </li><li> Troverete il peso molecolare e dati assorbanza molare sulla &quot;Oligo Proprietà&quot; foglio fornite con ogni morfolino. Analizzare il vuoto di verificare le letture di riferimento e le letture di ogni diluito morfolino. Moltiplicare l&#39;assorbanza a 265 nm di ogni morfolino dal suo costante e determinato per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione in ng / mL. Dividere questo numero per il peso molecolare per determinare la concentrazione in mm. Diluire il morfolino, se necessario, ad una concentrazione di lavoro. </li></ol> 2. Rimuovere strato esterno della cornea: <ol><li> Anestetizzare 6-12 mesi zebrafish adulto in Tricaine o 2-fenossietanolo a 1,0 mg / ml in acqua serbatoio di zebrafish. </li><li> Zebrafish avvolgere in un asciugamano inumidito pezzo di carta, che copre le branchie, ma lasciando l&#39;occhio esposto. Il pesce avvolto è posto sotto uno stereoscopio e l&#39;ingrandimento è aumentata fino al diametro dell&#39;occhio riempie circa un terzo deiil campo visivo (Figura 1). </li><li> Utilizzando Dumont # 5 pinzette, afferrare la cornea esterna nei pressi della fessura ottica. Questo tessuto è colorato in rosso e viene etichettato come &quot;OC&quot; in Figura 1. C&#39;è una leggera sporgenza o labbro indicato dalla freccia etichettata &quot;CL&quot;. Tirare con un angolo basso (cioè 10 gradi) attraverso l&#39;occhio di rimuovere la cornea esterna. Con la pratica, questo può essere completata in un unico movimento. Se la polizza di pinzette, ri-prendere il tessuto e poi tirare con un angolo basso fino alla rimozione. A ben collegata cornea può causare l&#39;occhio ad essere sloggiato dalla presa quando tirato. È possibile mantenere l&#39;occhio di diventare soppiantate da stabilizzando con un&#39;altra serie di pinzette. </li></ol> 3. Incisione della cornea e iniezione morfolino: <ol><li> Subito dopo la rimozione della cornea esterna, fare una piccola incisione nella cornea in cui la pupilla incontra l&#39;iride (Figura 2). Questo viene fatto usando uno zaffiro bisturi (vedere Materiali). </li><li> Carico 0,5 l di soluzione 3,0 mm morfolino in un Hamiltsu siringa dotata di un manometro rimovibile 33, smussato-end ago (vedi materiali). Pipetta su e giù per rimuovere le bolle d&#39;aria nella linea. Inserire con cautela l&#39;ago nel vitreo attraverso l&#39;incisione (Figura 2). Non inserire l&#39;ago troppo o si forare la retina o spostare l&#39;obiettivo. </li><li> Iniettare lentamente la soluzione morfolino nello spazio vitreali. A seconda dell&#39;età del pesce, lo spazio vitreali terrà ~ 0,5 microlitri. Dovreste visualizzare vitreo incolore fuoriuscire l&#39;incisione in quanto è spostato dalla soluzione morfolino. Iniettare fino a quando una piccola quantità di perdite di soluzione morfolino fuori dell&#39;incisione. Si consiglia di visualizzare chiaramente il lissamina-tag morfolino all&#39;interno dell&#39;occhio. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, ritorno il pesce al serbatoio per il recupero. Noi di solito solo iniettare l&#39;occhio sinistro, con l&#39;occhio destro come controllo uninjected, ma elettroporazione di entrambi gli occhi è possibile. </li></ol> 4. Elettroporazione: <ol><li> Seguitol&#39;iniezione di circa 10 pesci, ri-anestetizzare un pesce iniettato e avvolgerla in un pezzo di tovagliolo di carta inumidito, solo che coprono le branchie, ma lasciando l&#39;occhio esposto. Trasferire il pesce ad una piastra di Petri. Indossare guanti in lattice o simili per evitare l&#39;esposizione al anestesia. Mentre delicatamente tenendo il pesce sul fondo del piatto, riempire il piatto con l&#39;anestesia (Figura 3, pannello di sinistra). </li><li> A 3 mm di diametro elettrodo piatto di platino (vedere Materiali) localizza gli impulsi di elettroporazione per circa la metà della retina. Noi di solito bersaglio la retina dorsale. Premere delicatamente l&#39;elettrodo positivo verso il basso sulla metà ventrale dell&#39;occhio. Con la cornea esterno rimosso, l&#39;occhio è facilmente ruotato, esponendo la parte dorsale del bulbo oculare. </li><li> Mentre ancora premendo verso il basso sul lato ventrale degli occhi, posto l&#39;elettrodo negativo vicino (~ 1 - 2 mm), la metà dorsale esposta dell&#39;occhio. Fare attenzione a non toccare l&#39;elettrodo negativo direttamente ad occhio, che si tradurrà in dannila retina dorsale. Dopo aver determinato la giusta distanza tra gli elettrodi, utilizzare la vite di regolazione sul manico degli elettrodi a sostenere che la diffusione quando electroporating. Ciò mantiene l&#39;elettrodo negativo una distanza ottimale dal bulbo oculare quando l&#39;elettrodo positivo è premuto in posizione. </li><li> Electroporate l&#39;occhio con un onda CUY21 Piazza Elettroporatore (vedere Materiali). I parametri di elettroporazione dovrebbe essere impostato su due consecutivi 50-msec impulsi, a 75 V con una di 1 secondo di pausa tra gli impulsi. </li><li> Ritorno di pesce al serbatoio. Noi di solito iniziamo il nostro protocollo per la luce costante degenerazione retinica indotta subito dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Per 3-5 giorni dopo l&#39;elettroporazione (a seconda della stabilità del morfolino), l&#39;etichetta lissamina possono essere visualizzati in tutti gli strati della retina in una retina sezionato (Figura 4). Questo serve come una conferma per la presenza dil&#39;etichetta morfolino. </li><li> Siamo in grado di raggiungere knockdown pieno di proteine ​​fino a 3-5 giorni dopo l&#39;elettroporazione, a seconda dell&#39;efficacia del morfolino (Figura 5). Di solito, durante gli studi il trattamento della luce, raccogliamo gli occhi a 3 o 4 giorni dopo l&#39;elettroporazione morfolino. Questo viene fatto rimuovendo l&#39;intero occhio con Dumont pinze # 5B con estremità ricurva (Figura 6, materiali) e la lavorazione del tessuto per immunoistochimica 15. Come con qualsiasi tecnica smontabile, una dimostrazione di knockdown efficiente deve essere indicato al fine di convalidare il fenotipo. Pertanto, si consiglia di ottenere antisieri per la proteina di interesse. In alternativa, se e degli anticorpi non è disponibile e la morfolino è diretto sia alle accettore giunzione o del sito donatore nel pre-mRNA, bloccherà splicing efficiente del mRNA. In questo caso, è possibile utilizzare trascrittasi inversa-PCR per amplificare le sequenze fiancheggianti nell&#39;RNA morphant e determinare l&#39;efficienza di bloccare il normale splicmodello ing. </li><li> Quando le retine sono sezionati da nasale a temporali lungo l&#39;asse dorsale ventrale, le caselle ombreggiate blu (Figura 6) rappresentano le aree della retina che sono più spesso danneggiati dall&#39;evento elettroporazione stesso. La casella ombreggiata rosa rappresenta l&#39;area cui è destinato l&#39;introduzione morfolino in cellule della retina dalla elettroporazione. </li></ol><img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica raffigurante la rimozione degli strati epiteliali della cornea. Il pannello a sinistra mostra le principali caratteristiche strutturali degli occhi, compresa la lente (L), il vitreo (Vit), la retina (R), la cornea esterna (OC), la cornea interna (IC), e la sporgenza della cornea ( CL). L&#39;orientamento degli occhi viene mostrato in basso a destra del primo pannello e viene etichettato anteriore (A), posteriore (P), dorsale (D) e ventrale (V). La colorazione rossa indica l&#39;esterno della cornea che viene rimosso. Il pan secondo<html> el mostra come le pinze sono usate per afferrare la sporgenza della cornea e per tirare la cornea esterna attraverso l&#39;occhio ad un angolo basso (terzo pannello). Il pannello di destra mostra come un secondo paio di pinze possono essere usati per regolare l&#39;occhio mentre si tira la cornea. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig2.jpg" /> Figura 2. Schematica delle fasi coinvolte nel iniezione intravitreale di morfolino. Una piccola incisione viene fatta negli occhi, dove la pupilla incontra l&#39;iride (pannello a sinistra). Il divario risultante dovrebbe essere appena abbastanza grande per un ago da 33 gauge, che viene riempito con la soluzione morfolino, da inserire (pannello centrale). Iniettare lentamente 0,5 ml di soluzione nel vitreo (pannello di destra). Si consiglia di visualizzare una piccola quantità di soluzione vitreali uscire l&#39;incisione come il vitreo è parzialmente sostituito da con-lissamina tag morfolino (pannello di destra). ig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Schematica della procedura di elettroporazione generale. Il pesce anestetizzato, che è stato iniettato il intravitreally morfolino, viene delicatamente avvolta in un tovagliolo di carta umido (pannello a sinistra). Il tovagliolo di carta dovrebbe coprire le branchie, ma non ostruire l&#39;occhio (pannello centrale). Premere delicatamente l&#39;elettrodo positivo verso il basso sulla parte ventrale dell&#39;occhio, permettendo la metà dorsale dell&#39;occhio per ruotare dalla presa. Posizionare l&#39;elettrodo negativo di circa 1 mm dalla metà dorsale dell&#39;occhio e avviare l&#39;elettroporazione (pannello di destra). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig4.jpg" /> Figura 4. Immagine confocale a confronto una retina elettroporate senza intravitreally iniettando una lissamina-tagged morfolino (A), e una retina intravitreally iniettato e elettroporate con la lissamina-tag morfolino (B). L&#39;etichetta lissamina si trova in tutti gli strati della retina e tipi di cellule. ROS, asta esternasegmenti; ONL, strato esterno nucleare; INL, strato interno nucleari; GCL, strato di cellule gangliari. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig5.jpg" /> Figura 5. Immagini confocale confronto immunolocalizzazione PCNA nelle retine elettroporate con un morfolino controllo (pannelli a sinistra) e retine elettroporate con un anti-PCNA morfolino (pannelli di destra) prima di luce indotta la morte cellulare dei fotorecettori. Dark-adattato zebrafish adulto albini sono stati messi in luce costante intenso per 1, 2 o 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione della morfolino. Il morfolino controllo non è riuscito a reprimere l&#39;espressione PCNA crescente alla luce-retine danneggiate. L&#39;anti-PCNA morfolino efficiente abbattuto l&#39;espressione della proteina PCNA attraverso tre giorni di costante danno luce intensa. <img alt="Figura 6." src="/files/ftp_upload/3603/3603fig6.jpg" /> Figura 6. Schematica (pannello di sinistra) che mostra l&#39;enucleazione dell&#39;occhio per pProcessing e criosezionamento, che è fatto lungo l&#39;asse dorsale ventrale. La scatola rosa ombreggiata (pannello di destra) mostra la regione della retina con la maggiore quantità di proteine ​​knockdown utilizzando questa tecnica. Le caselle blu ombreggiate rappresentano le aree che sono più spesso danneggiati dall&#39;evento elettroporazione. L&#39;orientamento degli occhi è l&#39;etichetta anteriore (A), posteriore (P), dorsale (D) e ventrale (V).

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Non abbiamo nulla da rivelare

Recentemente, due analisi microarray ha esaminato i cambiamenti di espressione genica che si sono verificati durante la rigenerazione sia della luce danneggiati retina o di una patch chirurgicamente asportato retina 10, 16. Entrambi gli studi hanno rivelato numerosi geni che mostravano significativi cambiamenti di espressione, sia aumentando o diminuendo, che probabilmente sono necessari per i diversi eventi che si verificano durante la rigenerazione della retina, come il rientro della glia Müller nel ciclo cellulare, ha continuato la proliferazione e la migrazione dei progenitori neuronali per lo strato di danneggiamento della retina, e la differenziazione dei progenitori neuronali nel tipo corretto delle cellule neuronali. Mentre un confronto diretto di questi due dati di microarray set rivelano geni candidati che possono essere coinvolte in questi eventi cellulari, in ultima analisi, questi geni e le proteine ​​codificate devono essere testati per determinare se sono necessarie per la rigenerazione neuronale. Qui, descriviamo un potente perdita di funzione approccio alla conditionalmente knockdown proteine ​​di interesse nella retina zebrafish adulto. Questa tecnica è stata utilizzata per studiare sia le proteine ​​extracellulari e intracellulari, così come molecole di segnalazione, di fattori di trascrizione e proteine ​​necessarie per la replicazione del DNA 17-19. Quindi, questo metodo ha notevolmente aiutato la nostra comprensione del meccanismo molecolare alla base adulto la rigenerazione della retina in zebrafish. Abbiamo testato i parametri di elettroporazione multipli (tensione, numero di impulsi, il tempo tra gli impulsi) prima di un protocollo di successo è stato raggiunto. Un rapporto precedente di electroporating Morpholinos nella pinna caudale rigenerante zebrafish utilizzate 10 impulsi a bassa tensione (15 V) 20. Poiché la retina zebrafish adulto è circondata da più strati di cellule e non è facilmente accessibile agli elettrodi pinzetta, i parametri utilizzati nella pinna non hanno avuto successo in modo efficiente electroporating Morpholinos nella retina adulta. Al contrario, un alto voltaggio (100 V) spesso resulted nella morte ai pesci. Recentemente, 5 impulsi di 80 V è stato descritto per electroporate DNA plasmidico nella retina topo neonato cucciolo 21. Abbiamo trovato che un po &#39;meno intenso 2 impulsi di 75 V portato a elettroporazione successo del Morpholinos nella retina zebrafish adulto con la sopravvivenza del 100% del pesce trattata. Inoltre, abbiamo scoperto che la rimozione del più esterno (o esterno-la maggior parte), componente della cornea notevolmente aumentato l&#39;efficienza elettroporazione. Aumentare il numero di impulsi può eliminare la necessità per la rimozione di questo tessuto, ma possono anche causare danni ai tessuti più grande. Studi ampio controllo hanno dimostrato che questi parametri non ha causato alcun decesso significativo delle cellule della retina o alterare le risposte specifiche cellulari osservato durante la rigenerazione dei fotorecettori 19. Guadagno di funzione studi non sono attualmente possibile usare questa tecnica in vivo, a causa della nostra incapacità di electroporate costantemente grandi acidi ribonucleico in tutte le rcellule etinal. Tuttavia, il successo di electroporating plasmidi nella retina del mouse in vivo e la retina zebrafish in espianti suggerisce che è ancora una possibilità in zebrafish 21, 22. Uno dei punti di forza di questa tecnica è l&#39;elettroporazione sembra introdurre efficacemente il morfolino in tutti i diversi tipi di cellule della retina. Tuttavia, un potenziale punto debole è che l&#39;elettroporazione in modo efficiente consegnato il morfolino nel solo le regioni dorsali e centrale della retina. Un evento elettroporazione secondo verso la metà ventrale della retina risultati in termini di orientamento del bene a tutti i livelli, ma spesso provoca danni. Questa restrizione spaziale probabilmente era dovuto alla forma e il posizionamento degli elettrodi. L&#39;uso di custom-designed elettrodi a forma di coppa che potrebbe essere collocato intorno agli occhi può migliorare questa debolezza. Questa limitazione spaziale della consegna morfolino limita l&#39;uso di questa tecnica e preclude l&#39;uso di un suc testh come l&#39;analisi ERG che richiederebbe una valutazione globale della retina. Va notato che, come per qualsiasi esperimento morfolino, si consiglia di confermare i risultati con un secondo, non si sovrappongono morfolino per l&#39;mRNA bersaglio. In alcuni casi, è possibile electroporate anche due Morpholinos diversi contemporaneamente per knockdown l&#39;espressione di due proteine ​​diverse. Abbiamo dimostrato questa abbattendo l&#39;espressione sia del Pax6a Pax6b e proteine, individualmente e in combinazione 18. Anche se abbiamo dimostrato l&#39;utilizzo di questa tecnica con il nostro modello di danno luce, potrebbe probabilmente essere utilizzati per studiare la rigenerazione di altri modelli di danno 2-8 o utilizzato per esaminare la funzione delle proteine ​​nella retina danneggiata. Per esempio, elettroporazione di Morpholinos potrebbero essere utilizzati per knockdown l&#39;espressione di specifici canali o molecole di trasduzione del segnale nelle cellule gangliari e amacrine e quindi studiare la funzione di queste segnalazionipercorsi di elaborazione visiva. Tuttavia, come Morpholinos riguardano solo la traduzione di nuova proteina, si dovrebbe attendere fatturato proteina endogena si verifica prima che un test possa essere eseguito. A seconda della stabilità della proteina, che può variare da ore a giorni 18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> CUY21-EDIT o CUY21-SC onda quadra elettroporatore </td><td> Protech internazionale </td><td> CUY21EDIT o CUY21SC </td><td> Entrambe le unità di lavoro per questo protocollo </td></tr><tr><td> 3-mm di diametro pagaia elettrodi </td><td> Protech internazionale </td><td> Cuy 650-P3 </td><td></td></tr><tr><td> Morfolino </td><td> GeneTools, LLC </td><td></td><td> Morfolino dovrebbero essere progettati su misura per la vostra proteina di interesse </td></tr><tr><td> 2-fenossietanolo </td><td> Sigma </td><td> 77861-1L </td><td> Anestesia; diluire 1:1000 in acqua i pesci sistema per la procedura, 1:500 per l&#39;eutanasia </td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinzette </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td>14095 </td><td> Qualsiasi # 5 pinzette con il lavoro </td></tr><tr><td> Pinzette Dumont # 5B con punte angolate </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500234 </td><td> Utilizzato per l&#39;eutanasia a seguito occhio enucleare </td></tr><tr><td> Sapphire lame, il doppio bordo lancia, 1 mm di larghezza, con manico coltello Sapphire </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> Blade: 500314 Maniglia: 500317 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton siringa con manometro rimovibile 33 ago smussato-end </td><td> Hamilton società </td><td> Siringa: 87930 Ago: 7762-06 </td><td> Rimuovere l&#39;ago che viene fornito con siringa e sostituirlo con 33-gauge smussato-end ago </td></tr></tbody></table>

in vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina

Molte malattie ereditarie degli occhi devastanti provocare cecità progressiva e irreversibile, perché gli esseri umani non possono morire o rigenerare i neuroni della retina malata. Al contrario, la retina zebrafish adulto possiede la capacità di rigenerare spontaneamente robusto qualsiasi classe neuronale che si perde in una varietà di differenti modelli danni alla retina, tra cui puntura di retina, ablazione chimica, concentrato ad alta temperatura, luce ed intenso trattamento 1-8. Il nostro laboratorio ampiamente caratterizzato la rigenerazione dei fotorecettori seguenti costante trattamento con luce intensa e interiore neuroni della retina dopo iniezione intravitreale ouabain 2, 5, 9. In tutti i casi, residenti glia Müller rientrare nel ciclo cellulare per la produzione di progenitori neuronali, che continuano a proliferare e migrare verso lo strato proprio della retina, dove si differenziano in neuroni carente. Abbiamo caratterizzato cinque fasi diverse durante la rigenerazione della luce-damaged retina che sono stati evidenziati da specifici risposte cellulari. Abbiamo identificato diversi geni espressi in modo differenziale in ogni fase della rigenerazione della retina mediante l&#39;analisi microarray mRNA 10. Molti di questi geni sono critici per lo sviluppo oculare. Per verificare il ruolo di ogni gene candidato / proteine ​​durante la rigenerazione della retina, avevamo bisogno di sviluppare un metodo per limitare in modo condizionale l&#39;espressione di una proteina candidato solo a volte durante la rigenerazione della retina adulta. Oligo morfolino sono ampiamente utilizzati per studiare la perdita di funzione di proteine ​​specifiche durante lo sviluppo di zebrafish, Xenopus, pulcino, mouse e tumori in xenotrapianti umani 11-14. Queste basepair modificato oligo con sequenza complementare di RNA per bloccare sia la giunzione o la traduzione del RNA bersaglio. Morpholinos sono stabili nella cellula e possono eliminare o espressione &quot;knockdown&quot; proteina da tre a cinque giorni 12. Qui,descriviamo un metodo efficiente per l&#39;espressione della proteina knockdown bersaglio nella retina zebrafish adulto. Questo metodo impiega lissamina-tagged Morpholinos antisenso che vengono iniettati nel vitreo dell&#39;occhio zebrafish adulto. Utilizzando pinze elettrodo, il morfolino viene poi elettroporate in tutti i tipi di cellule della retina e dorsale centrale. Lissamina fornisce la carica sul morfolino per l&#39;elettroporazione e possono essere visualizzati per valutare la presenza del morfolino nelle cellule della retina. Knockdown condizionale nella retina può essere usata per esaminare il ruolo delle proteine ​​specifiche in diversi momenti durante la rigenerazione. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per studiare il ruolo di specifiche proteine ​​nella retina non danneggiato, in processi come la trasduzione visiva e di elaborazione visiva dei neuroni di secondo ordine.

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In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l&#39;iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

19.1K Views.  Wayne State University School of Medicine. Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.

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Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotipica di Retina Coniglio adulti

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Ricerca

Biologia

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Cella singola elettroporazione in vivo all&#39;interno del cervello intatto in via di sviluppo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Iniezione intraperitoneale in Zebrafish adulti

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Consegna diretta di Morpholinos MIF Into the Otocyst Zebrafish di iniezione e di elettroporazione influenza lo sviluppo dell&#39;orecchio interno

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...