Gli autori desiderano ringraziare Eva Hadzimova, Pierre Mattar e Christopher Kovach per il loro lavoro iniziale per stabilire nella tecnologia di elettroporazione utero in laboratorio CS. Questo lavoro è stato finanziato da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzioni (MOP 44.094) e CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging squadra di Grant (00933-000) per CS e bambini Alberta Hospital Research Foundation Grant a DMK. RD è stato sostenuto da una borsa di studio CIHR Speranza Canada, RC è supportato da un Studentship FFB e LML è stato sostenuto da una borsa di formazione CIHR in Genetica e sviluppo del bambino.

1. Set-up <ol><li> Set-up dell&#39;area chirurgica come mostrato in fig. 1A, A &#39;. I componenti chiave del set-up includono un Eppendorf FemtoJet microinjector, micromanipolatore Narishige con porta aghi, steromicroscope Leica, sistema di illuminazione a fibre ottiche, Piazza del sistema ECM 830 Elettroporazione onda con gli elettrodi, piastra elettrica e un vaporizzatore per isoflurano anestetico. </li><li> Pulire gli attrezzi con un pulitore ad ultrasuoni BRANSONIC utilizzando Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici. Sterilizzare gli strumenti in autoclave. Strumenti sterilizzati sono poi tenuti in Germex. </li><li> Preparare le siringhe con caldi soluzione fisiologica sterile e sterile Ringer lattato soluzione. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> Animale svolge all&#39;interno di un piccolo (12cm x 20cm) anestetico da camera. Utilizzando un vaporizzatore, consegnare il 5% anestetico isoflurano e ossigeno a 1L/min (fig. 1 A, A &#39;). In particolare, è importante raccogliere scarico isoflurano utilizzando un sistema di evacuazione fumi. </li><li> Rimuovere animale dalla camera quando il respiro diventa profondo e regolare. Pizzicare le dita dei piedi e test di riflessi batter d&#39;occhio sono utilizzate per garantire l&#39;anestesia totale. </li><li> Posizionare il mouse incinta sul dorso sopra una piastra elettrica (37 ° C). La piastra elettrica è prima sterilizzato strofinando con etanolo al 70%, e viene poi coperto con un sterilizzato, garza lintless. Utilizzare un tubo respiratore e apparecchi maschera per fornire isoflurano (2,25%) durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Iniettare buprenorfina (peso corporeo 0.1mg/kg) per via sottocutanea sotto la pelle alla nuca. </li><li> Monitor animali in tutta la chirurgia per la respirazione profonda e regolare. L&#39;animale non deve respiro, respirare superficialmente o rapidamente. Poco profondo, la respirazione veloce può essere un segno di luce anestesia, e il flusso di isoflurano dovrebbe essere aumentato. Se l&#39;animale comincia a boccheggiare, ridurre il flusso di isoflurano. Nel caso di un arresto respiratorio, spegnere isoflurano, e aumentare il flusso di ossigeno fino animale recupera. Riavviare isoflurano ad una concentrazione inferiore. </li></ol> 3. Preparazione degli animali per la chirurgia <ol><li> Nastro zampe anteriori di animali per il termoforo e controllare di nuovo per una risposta ritrattazione da pizzicare il piede posteriore con pinza contundente. </li><li> Usando un tampone di cotone sterile a punta, si sviluppa uno spesso strato di crema depilatoria (cioè, Nair) sul ventre. A colpi di azienda, assicurare il sottopelo è completamente rivestita. Lasciare agire per una media di tre minuti, controllando in modo intermittente con un tampone sterile pulito per la depilazione. Bagnate un tampone di garza sterile con acqua sterile e asciugare l&#39;addome fino a quando tutte le tracce sono scomparse. Ripetere con clorexidina (cioè Stanhexidine) pelle più pulita e più acqua. Asciugare l&#39;addome con garza pulita e sterile. </li><li> Sterilizzare sito di incisione con clorexidina (cioè Stanhexidine), seguito da più acqua sterile. Asciugare l&#39;addome con garza pulita e sterile. Ripetere questo passaggio utilizzando etanolo al 70% e un fresco, tampone di cotone sterilizzati. </li><li> Posizionare un tampone di garza sterile sopra l&#39;addome con una fessura nel mezzo attraverso il quale le corna uterine sarà tirato durante l&#39;intervento. </li></ol> 4. Incisione ed esposizione di corni uterini <ol><li> Per esporre le corna uterine, in primo luogo individuare la linea alba come la linea debole sotto la pelle sulla linea mediana. Utilizzando pinze, tirare la pelle dalla parete addominale e tagliate una piccola incisione direttamente dalla metà verso il basso addome con le forbici pelle (circa 1 cm di lunghezza). </li><li> Uso di pinze e forbici curve, ripetere il processo con il peritoneo. </li><li> Luogo garza sterile con una piccola fessura verticale sopra incisione e smorzare riscaldato con soluzione salina sterile. </li><li> Far scorrere pinze in incisione e individuare l&#39;utero. Tenere incisione aperta con una pinza e rimuovere le corna uterine. </li><li> Afferrare l&#39;utero tra gli embrioni prima e la seconda visibile ed estrarre gli embrioni sulla garza. Rimuovere entrambi i lati delle corna uterine, ponendo sulla garza sterile e contare il numero di embrioni, notando alcun riassorbimento o &quot;non sani&quot; (ad esempio dimensioni del corpo più piccolo) embrioni. Bagnare le corna uterine con soluzione salina e con cura la metà di ritorno dell&#39;utero nell&#39;addome. </li></ol> 5. L&#39;iniezione di DNA in ventricoli <ol><li> Aghi chirurgici sono preparati con un estrattore Sutter Flaming Micropipetta usando micropipette borosilicato con capillari (Programma: calore = 750, Pull = 30, Vel = 90, Tempo = 150). Utilizzando una lama bisturi sterile, la punta dell&#39;ago è leggermente rasato con un angolo di 45 gradi. </li><li> Per caricare l&#39;ago, pipette Pasteur sono tirati ad un diametro stretto sotto una fiamma. Un pezzo bocca è collegata alla pipetta carico di elaborare ~ 10 ml di 3mg/ml privo di endotossine DNA mescolato con 0,01% metil verde (nota: metil colorante verde consente iniezioni di DNA da visualizzare). L&#39;ago viene poi riempito montato su un supporto micromanipolatore e attaccato all&#39;iniettore FemtoJet. </li><li> Partendo con l&#39;embrione più vicino al ovaio, circolare forcipevengono utilizzati per trasformare delicatamente l&#39;embrione all&#39;interno della decidua in modo che sia posizionato &quot;faccia avanti&quot;, permettendo iniezioni a verificarsi in un rostrale alla direzione caudale. Una fonte di illuminazione a fibre ottiche per l&#39;illuminazione è usato per aiutare a visualizzare la linea mediana del cervello embrionale, che viene affiancata dalla grande ventricoli laterali nelle regioni rostrale (Fig. 1B, B &#39;). </li><li> L&#39;embrione viene tenuto in posizione mediante pinze circolare. L&#39;ago è posizionato sopra l&#39;utero in modo che l&#39;angolo di entrata nel cervello è di circa 45 gradi. Utilizzando il micromanipolatore, e un movimento veloce e costante, la punta dell&#39;ago viene inserito attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale dell&#39;embrione. Le iniezioni sono diretti verso i ventricoli laterali, terzo ventricolo o spazio sottoretinico di indirizzare la, diencefalo e telencefalo retina, rispettivamente. Si noti che le vescicole cerebrali embrionali sono aperte primi stadi embrionali tale che il DNA iniettato nei ventricoli laterali fluirà nel ventricolo 3 °. </li><li> Premere il pedale per iniettare privo di endotossine DNA (1-3 mL) con un Eppendorf FemtoJet microinjector. Un&#39;iniezione di successo è facilmente visualizzabile attraverso la diffusione del colorante verde metile in tutto i ventricoli del cervello embrionale. L&#39;ago viene poi lentamente rimosso da redazione il backup per evitare la rottura. </li></ol> 6. Elettroporazione <ol><li> L&#39;embrione iniettato (ancora all&#39;interno dell&#39;utero) è posto sulla garza sterile sovrastante sull&#39;addome della madre e bagnate abbondantemente con soluzione salina riscaldata. ** Si prega di notare l&#39;aggiunta di soluzione fisiologica alla superficie della membrana è essenziale per consentire il passaggio efficiente di una corrente elettrica. </li><li> GenePaddle elettrodi vengono utilizzati per afferrare l&#39;utero dopo l&#39;iniezione del DNA. Cinque impulsi elettrici piazza di 40-50V e 50 ms sono consegnati al ritmo di un impulso al secondo utilizzando un sistema di elettroporazione BTX ECM8300 (Fig. 1C, C &#39;). </li><li> Coprire l&#39;embrione iniettato / elettroporate con protezione garza umida e continuare per l&#39;embrione successiva. </li><li> Al termine della iniezione / elettroporazione di tutti gli embrioni desiderati, spingere con attenzione le corna uterine nuovamente dentro l&#39;addome (Fig. 1D). </li><li> Rimuovere con attenzione l&#39;altro corno uterino e ricominciare con l&#39;embrione più vicino al dell&#39;ovaio. </li></ol> 7. Sutura e pinzatura <ol><li> Una volta che tutti gli embrioni sono tornati dentro l&#39;utero, aggiungere alla cavità addominale ~ 2-3 ml di soluzione salina calda. </li><li> Per chiudere la ferita, iniziare rimuovendo il velo sul ventre e identificare i lati del peritoneo. Iniziare la sutura del peritoneo con linea nera di seta intrecciata. Non è raccomandato l&#39;uso di fili riassorbibili per questa procedura in quanto è generalmente più debole e può portare a sanguinamento post-operatorio e infezioni. Ancorare la linea sul peritoneo più vicina allo sterno e procedere al punto di distanza dal ancoraggio. Assicurarsi che tutte le suture sono stretti, e che non gli organi sottostanti o pelle è stata inavvertitamente cucito nel peritoneo. Agganciare la linea di sutura rimanente e scartare. </li><li> Tirare la pelle chiuso oltre la linea di sutura con una pinza. Reflex con 9 millimetri ™ pelle chiusura a punti metallici, clip la pelle sopra la ferita, facendo attenzione a non graffetta sottostante linea di sutura, o per tirare la pelle troppo stretto. Il metodo preferito è quello di tenere la pelle in alto e lontano dal corpo con una pinza, e sono disponibili in un angolo di 90 gradi con lo strumento di base. Continuare fino ferita è chiuso (circa tre punti). Una volta finito, garantire graffette sono stretti premendo delicatamente con lo strumento di sutura (Fig. 1D &#39;). </li></ol> 8. Post-chirurgica Cura <ol><li> Per monitorare il recupero anestetico, girare femminile sullo stomaco e spegnere isoflurano. Mantenere volto dell&#39;animale all&#39;interno del respiratore, trasformare l&#39;ossigeno fino al 3% per contribuire alla ripresa dall&#39;anestesia. L&#39;animale deve essere collocato su un blocco pulita garza sulla parte superiore della piastra elettrica per prevenire l&#39;ipotermia. </li><li> Mentre l&#39;animale è groggy, iniettare 2 ml di Ringer soluzione per via sottocutanea sotto la pelle del collo dell&#39;animale. </li><li> Continuare a tenere l&#39;animale in condizioni di flusso di ossigeno per alcuni minuti e garze riscaldamento al fine di risvegliare l&#39;animale. Verificarsi brevi spruzzi di movimento da l&#39;animale deve essere osservato come si ritorna a un modello di respirazione normale. Osservare per alcuni minuti fino a quando animale sembra cosciente e sveglio. </li><li> Spray addome della femmina con gentamicina spray e avvolgere l&#39;animale in una garza sterile. </li><li> Trasferire l&#39;animale in una gabbia sterile con biancheria da letto in autoclave e custodia di cartone. </li><li> Bottiglie d&#39;acqua devono essere accuratamente puliti, sterilizzati e riempita con acqua sterile. A 500 ml di acqua aggiungere 2 ml di antibiotico sulfamethazine (25% azioni). </li><li> Somministrare 0,05 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina la chirurgia mattino seguente. </li><li> Monitorare da vicino la femmina per le prime 24 ore post-operatorie. Se gli animali vengono tenuti più di 24 ore, le femmine vengono spostati ster nuovogabbie ile il giorno 2. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati Neocorteccia La neocorteccia è la regione del sistema nervoso centrale che è responsabile per l&#39;elaborazione visiva e senso-motori e più alto funzionamento cognitivo. E &#39;composto da neuroni di proiezione glutammatergica e interneuroni GABAergici che derivano dal telencefalo dorsale e ventrale, rispettivamente. Per affrontare i ruoli dei diversi geni nello sviluppo neocorticale, usiamo elettroporazione in utero a uno misexpress o bloccare l&#39;espressione (ad esempio, attraverso l&#39;uso di costrutti shRNA) di geni diversi nella dorsale o ventrale telencefalo 1,3,4. Per misexpress geni nel telencefalo embrionale, usiamo un vettore di espressione bicistronic (pCIG2), contenente un CMV βactin promotore-enhancer e un sito interno ingresso ribosoma (IRES) con capacità di proteina fluorescente verde (EGFP; in pCIG2) cassetta, permettendo transfettate cellule per essere rilevato da epifluorescenza (Fig. 2A-C). Abbiamo utilizzato questa tecnologia per introdurre i costrutti di espressione nel telencefalo da E11.5 a E15.5 (dati riportati sono a E12.5;. Fig. 2). Consentendo di sviluppare embrioni diversi giorni post-elettroporazione, siamo in grado di monitorare la differenziazione e la migrazione di GFP-etichettata progenitori. Come procede la differenziazione, 3 giorni dopo l&#39;elettroporazione GFP + cellule si differenziano e migrano dalla zona ventricolare (VZ), zona subventricolare (SVZ) e la zona intermedia (iz) e nella piastra corticale (cp;. Fig. 2C). Se il cervello elettroporate a E12.5 vengono analizzati dopo 24 ore, siamo in grado di monitorare eventi precedenti nella maturazione progenitrici e migrazione neuronale dal co-etichettatura con i marcatori dei progenitori apicale (cioè, Pax6;. Fig. 2A), progenitori basale (cioè, Tbr2; . Fig. 2B) e postmitotic neuroni neocorticale (cioè, Tbr1;. Fig. 2C). Diencefalo L&#39;ipotalamo è alla base ventrale del sistema nervoso centrale e funge da gateway tra il sistema endocrino e sistema nervoso autonomo. Durante lo sviluppo, i nuclei multipli che compongono l&#39;ipotalamo maturo differenziano da una zona progenitore comune che riveste la regione più ventrale del diencefalo embrionale. Attualmente, le vie molecolari che regolano la proliferazione delle cellule progenitrici, la differenziazione neuronale e la formazione dei nuclei ipotalamici sono poco conosciuti. Abbiamo usato elettroporazione in utero ad obiettivo di espressione genica giornalista al diencefalo embrionale, iniettando il DNA nel 3 ° ventricolo di E12 embryos.We poi seguito la distribuzione di GFP nel differenziare in neuroni E14. Con questa metodologia, abbiamo mirato con successo espressione GFP al talamo, pre-talamo e ipotalamo (Fig. 3A). Analisi di sezioni coronali rivela che siamo riusciti a mirati espressione GFP alle cellule progenitrici che rivestono la zona ventricolare del 3 ° ventricolo e neuroni che migrano verso la zona di mantello per formare nuclei (Fig. 3B) Retina La retina è lo strato neurale dell&#39;occhio, responsabile della conversione fotoni di luce in impulsi elettrici trasmessi al cervello. Si sviluppa come un outpocketing del diencefalo embrionale, e quindi, è derivato dal tubo neurale. La retina neurale si sviluppa da un compartimento progenitore apicale che si trova adiacente allo spazio sottoretinico, una cavità che separa l&#39;occhio dal mesenchima testa. Targeting costrutti di DNA per cellule progenitrici della retina richiede pertanto che le iniezioni sono fatte in una piccola area di destinazione. Utilizzando micromanipolatori, siamo riusciti a bersaglio con successo questa piccola area in embrioni a E13.5 E15.5 (indicato è E15.5 electroporations di PCIC con la giornalista mCherry; Fig. 4).. Se elettroporate retina vengono esaminati 24 ore post-trasfezione, si osserva che la maggior parte delle cellule + mCherry si trovano nello strato esterno neuroblasti (onbl), dove si trovano progenitori divisione, e non nello strato delle cellule gangliari della retina (GCL; immagine nel riquadro), dove le cellule postmitotic localizzare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Introduzione al elettroporazione utero set-up e metodologia. (A) I componenti chiave del set-up chirurgico includono un Eppendorf FemtoJet microinjector (1), micromanipolatore Narishige con porta aghi (2), steromicroscope Leica (3), illuminazione a fibre ottiche sistema (4), 830 ECM Onda quadra sistema di elettroporazione con elettrodi (5) e piastra elettrica (6). (A &#39;) L&#39;animale viene anestetizzato con un vaporizzatore per isoflurano anestetico. (B, B &#39;) In breve, dopo l&#39;anestesia, le corna uterine sono esposti e DNA mescolato con verde veloce è iniettato nel cervello vescicole embrionali. Un&#39;iniezione di successo viene visualizzato tenendo traccia del digiuno colorante verde (B &#39;). (C, C &#39;) Dopo che il DNA è iniettato con successo, gli elettrodi pagaia sono posti ai lati dell&#39;utero, positioning l&#39;embrione in modo che il DNA sarà tirato verso il polo positivo nella regione del cervello di scelta. (D, D &#39;) Una volta che tutti gli embrioni desiderati vengono iniettate, l&#39;utero è spinto indietro nell&#39;addome (D), il peritoneo viene suturata, e la pelle è cucito con punti metallici (D&#39;). La femmina incinta è poi permesso di recuperare e elettroporate i cuccioli vengono raccolti presso i punti di tempo desiderato. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Esempio rappresentativo di dorsale elettroporazione telencefaliche. (AC) Micrografia di una sezione coronale attraverso un telencefalo dorsale E13.5 elettroporate a E12.5 con pCIG2. Elettroporate cellule GFP + vengono analizzati per la loro espressione di marcatori di cellule progenitrici apicale (Pax6 +, rosso, A), progenitori basale (Tbr2 +, rosso, B) e neuroni postmitotic (Tbr1 +, rosso, C). cp, corticale piastra; SVZ, zona subventricolare, vz; zona ventricolare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Esempio rappresentativo di elettroporazione diencefalo. (A) Una vista ventrale di un cervello E14 che è stato elettroporate a E12 con pCIG2. GFP epifluorescenza è visibile nel talamo, pre-talamo e ipotalamo, a dimostrazione della diffusione del pCIG2 microiniettati plasmide in tutto il 3 ° ventricolo. (B) Micrografia della sezione coronale del cervello attraverso elettroporate, dimostrando la migrazione di cellule GFP + fuori dalla zona ventricolare e nella zona del mantello, in cui nuclei ipotalamici formeranno. 3V, terzo ventricolo; T, talamo, Hy, l&#39;ipotalamo, mz, mantello zona; Tel, telencefalo; Pret, prethalamus; vz, zona ventricolare. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Esempio rappresentativo di elettroporazione della retina. Sezione coronale attraverso un occhio E16.5 elettroporate con PCIC a E15.5 che mostra l&#39;accumulo di cellule mCherry + neuroblasti dello strato esterno e non in Brn3b + cellule gangliari della retina nello strato delle cellule gangliari. L&#39;inserto è un&#39;immagine più alto ingrandimento della zona in scatola. GCL, strato delle cellule gangliari della retina, le, lente; onbl, neuroblasti strato esterno; re, retina.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In utero elettroporazione può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di processi di sviluppo. Per esempio, la trasfezione di geni reporter come GFP, mCherry o della fosfatasi alcalina può essere utilizzato per condurre esperimenti di lineage tracing e migrazione neuronale. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere transitoriamente espresso per eliminare selettivamente un allele floxed in un spazialmente e / o temporalmente modo controllato. Inoltre, shRNA o dominante costruisce negativo può es...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Categoria </th></tr><tr><td> Forbici </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14078-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Forbici iris, curva </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 14061-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Delicato Porta aghi </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 12002-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Anello pinze, 9mm </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11103-09 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Occhio spogliatoio Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11051-10 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11271-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX Pinza </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11251-30 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Tessuto pinza-Adson </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 11027-12 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex applicatore clip </td><td> Strumento di precisione mondo </td><td> 500343 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Mestolo forato, 15 mm di diametro </td><td> Belle Scienza Tools Inc. </td><td> 10370-18 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Autoclip Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Di seta nera intrecciata sutura </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> Reflex pelle Chiusura in acciaio inossidabile ferita clip </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500346 </td><td> Strumenti chirurgici </td></tr><tr><td> ECM 830 Onda quadra sistema di elettroporazione </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 5 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Pinzetta w / Variabile Gap 2 Giornata 7 millimetri elettrodi Piastra Platinum </td><td> Protech International Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Comando a pedale per Eppendorf FemtoJet Microinjector </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (misc.) </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> BRANSONIC modello Ultrasonic Cleaner 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995 CPN-534-952-118 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Sutter P97 micropipetta Puller </td><td> Sutter strumento, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipette - borosilicato con filamento OD: 1 mm, ID: 0,78 mm, 10 cm di lunghezza </td><td> Sutter strumento </td><td> BF100-78-10 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> 3-Axis Manipolatore Coarse </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Tenendo dispositivo magnetico per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> M1 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Piastra di base in acciaio per micromanipolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5052 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta Holder </td><td> Pr mondoDECISIONE Instruments </td><td> MPH3 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Micropipetta maniglia </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 5444 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Stereomicroscopio </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Vaporizzatore per anestetici isoflurano </td><td> Porter Strumenti Azienda </td><td> MODELLO 100-F </td><td> Strumenti </td></tr><tr><td> Metriclean2 soluzione a bassa formazione di schiuma per sonicating strumenti chirurgici </td><td> Metrex Research Corporation </td><td> 10-8100 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Gentamicina 40mg/ml in 0,2 g di blu di metilene spruzzo antibiotica dopo la sutura </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Germex per sterilizzare gli strumenti chirurgici </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> BNP pomata oftalmica </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Distribuito da Church &amp; Dwight Co., Inc. </td><td> disponibili in commercio </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Stanhexidine 4% w / v pelle pulita </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Buprenorfina (Temgesic) analgesico </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Sulfamidici &quot;25&quot; sulphamethazine antibiotico orale </td><td> Professionale Veterinary Laboratories </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Ringer lattato soluzione </td><td> Baxter Corporation </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Saline - sodio cloruro 0,9% </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Inalazione anestetico - isoflurano USP </td><td> Partner farmaceutica del Canada Inc. </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr><tr><td> Verde fast FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Reagenti chirurgici </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

La capacità di manipolare l&#39;espressione genica è la pietra angolare della moderna embriologia giorno sperimentale, che porta alla spiegazione di molteplici vie di sviluppo. Diverse tecnologie potenti e ben consolidata transgenici sono a disposizione per manipolare i livelli di espressione genica nel topo, consentendo la generazione di entrambi perdita e guadagno di funzione dei modelli. Tuttavia, la generazione di topo transgenici è sia costoso e richiede tempo. Metodi alternativi di manipolazione genetica sono stati quindi ampiamente ricercato. In utero elettroporazione è un metodo di consegna del gene in embrioni di topo 1,2 vivere che abbiamo adattato con successo 3,4. È in gran parte sulla base del successo nel campo delle tecnologie di elettroporazione ovo che sono comunemente utilizzati in pulcino 5. In breve, il DNA è iniettato nei ventricoli aperto di sviluppo del cervello e l&#39;applicazione di una corrente elettrica provoca la formazione di pori transienti nelle membrane cellulari, permettendo l&#39;assorbimento del DNA nelle cellule. Nelle nostre mani, gli embrioni possono essere efficacemente elettroporate fin dal giorno embrionale (E) 11,5, mentre l&#39;orientamento dei giovani embrioni richiederebbe un eco-guidata protocollo microiniezione, come descritto in precedenza 6. Al contrario, E15.5 è l&#39;ultima tappa si può facilmente electroporate, a causa della insorgenza di differenziazione dell&#39;osso parietale e frontale, che ostacola microiniezione nel cervello. Al contrario, la retina è accessibile fino alla fine di embriogenesi. Gli embrioni possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento durante il periodo embrionale o postnatale precoce. L&#39;iniezione di un costrutto giornalista facilita l&#39;identificazione delle cellule transfettate. Ad oggi, l&#39;elettroporazione in utero è stata più utilizzata per l&#39;analisi dello sviluppo neocorticale 1,2,3,4. Studi più recenti hanno preso di mira la retina embrionale 7,8,9 e 10,11,12 talamo. Qui vi presentiamo una versione modificata del protocollo di elettroporazione in utero, che può essere facilmente adattato a bersaglio diversi domini del sistema nervoso embrionale. Noi dimostrare che utilizzando questa tecnica, si può avere come bersaglio l&#39;embrionale telencefalo, diencefalo e della retina. Risultati rappresentativi sono presentati, in primo luogo che mostra l&#39;uso di questa tecnica per introdurre costrutti espressione del DNA nei ventricoli laterali, che ci permette di monitorare la maturazione progenitrici, la differenziazione e la migrazione nel telencefalo embrionale. Mostriamo anche che questa tecnica può essere usata per bersaglio del DNA per i territori circostanti diencefalo il 3 ° ventricolo, consentendo le rotte migratorie di differenziarsi in neuroni dei nuclei diencefalo da monitorare. Infine, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di micromanipolatori ci permette di introdurre con precisione i costrutti del DNA in aree bersaglio piccolo, incluso lo spazio sottoretinico, che ci permette di analizzare gli effetti della manipolazione dell&#39;espressione genica per lo sviluppo della retina.

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Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K Views.  University of Calgary. Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

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Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Ricerca

Neuroscienze

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

Tecnica mouse Microchirurgia infusione per Targeted Sostanza consegna nel sistema nervoso centrale<i&gt; via</i&gt; Carotide interna

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...