Gli autori ringraziano Tracy Young-Pearse e Atsushi Kamiya per la fornitura di plasmidi. Questo lavoro è stato finanziato dalla NEURON-ERANET DISCover di OR e CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) per CK, e (DE 792/2-4) a MASSA

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati autorizzati dalla Landesministerium responsabile für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW, 87-51.05.2010.A301), in conformità con la legislazione nazionale ed europea. 1. Elettroporazione in utero Questo metodo è stato descritto in dettaglio in JoVE per il ratto Walantus et al. 3, nonché Rice et al. 4 ed è qui riassunte brevemente. Una dimensione cucciolata di 6-8 cuccioli produce un buon risultato. Ci dovrebbe essere almeno due embrioni non elettroporate al fine di aumentare il tasso di sopravvivenza globale (vedi sotto). <ol><li> Preparare DNA-Miscela contenente 1,5 mg / mL di target-plasmidi (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 sovraespressione: pCAX 21), 0.5 mg / mL Luciferase contenenti plasmidi (pCAX), 0.5 mg / mL GFP contenenti plasmide (pCAGGS 22) in 1x PBS soluzione macchiato blu chiaroe con Fast verde Dye. </li><li> Preparare aghi da iniezione di capillari di vetro con un ago Pipetta Puller. E sterilizzare strumenti chirurgici sia in autoclave o incubazione con un disinfettante a base di alcool (kodan Tinktur forte). </li><li> Somministrare una dose pre-operatoria di buprenorfina (0,05 mg / kg) 15 min prima di un intervento chirurgico per un topo incinta 16 giorni dopo la fecondazione (E16). Poi anestetizzare l&#39;animale in una camera isoflurano. <ol><li> Su anestesia, collocare il ratto in posizione supina su un tavolo operatorio 37 ° C-riscaldato con maschera di respirazione collegato al dispositivo di anestesia, usando impostazione ossigeno a 0,4 L / min e isoflurano al 1,8%. </li><li> Dopo la rasatura l&#39;addome, disinfettare la zona rasata tre volte con kodan Tinktur Forte (un disinfettante a base di alcool). </li><li> Coprire il ratto con panni sterili, esponendo solo il campo di funzionamento rasata. </li></ol></li><li> Eseguire elettroporazione in utero. <ol><li> Tagliare l&#39;addome con un scissor lungo la linea alba (circa 2 cm). </li><li> Esporre attentamente le corna uterine con una pinza ad anello. </li><li> Fate attenzione a mantenere la parete dell&#39;utero bagnato con PBS sterile riscaldato durante tutto l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Iniettare soluzione di DNA con un ago di vetro sottile in uno del ventricolo laterale degli embrioni. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo 7 millimetri intorno alla testa dell&#39;embrione. Per colpire una popolazione cellulare di strati corticali superiori, eseguire l&#39;IUE a E16 23 e posizionare l&#39;elettrodo positivo sul semisfera sopra il ventricolo iniettati con una leggera tendenza dorsale / laterale. Per indirizzare le cellule ippocampali cambiare il posizionamento dell&#39;elettrodo positivo sul lato opposto rispetto al ventricolo iniettato con laterale a leggermente direzione dorsale (Figura 1). </li><li> Eseguire elettroporazione da cinque a 50 impulsi msec a 55 V con 950 interruzioni msec con un quadrato dell&#39;onda di polso elettroporatore. </li><li> Pezzi primo embrione alla fine di ogni vaginale corno dell&#39;utero per aumentare tha possibilità di sopravvivenza di tutti gli embrioni. </li><li> Mettere le corna utero indietro nel ratto madre. </li><li> Stich la parete addominale con un Vicryl materiale assorbibile sutura chirurgica. </li><li> Chiudere la pelle con il materiale di sutura Vicryl o con suture. </li><li> Posizionare il topo madre nella gabbia di casa e tenerlo al caldo per 2-3 ore. </li><li> Tenere solo i topi nella loro gabbia casa nella sala stabulario e dei mangimi ad libitum. Essi danno vita tra E22-24. </li><li> Mantenere i cuccioli di ratto con la madre per tre settimane e separarli successivamente per sesso. </li></ol></li></ol> 2. Bioluminescenza Immagini dal vivo della reazione enzimatica Luciferase Questo metodo viene utilizzato per analizzare la posizione delle cellule trasfettate in utero. Co-elettroporate cDNA luciferasi di lucciola è tradotto in luciferasi attiva, che su di metabolizzare D-luciferina a oxyluciferin, emette un fotone (Figura 2 </strong&gt;). La luminescenza risultante può essere rilevato nel cervello di ratti giovani elettroporate positivi in un Spectrum IVIS fino all&#39;età di circa 35 giorni dopo la nascita (Figura 4). Nel presente studio, la rappresentazione luciferasi saggio e bioluminescenza è stata effettuata a partire P7. Questo punto di tempo è stato scelto per permettere madre e cuccioli di recuperare dallo stress nascita. Quando si lavora inizialmente con i cuccioli a P0, sopravvivenza della prole è stata gravemente colpita dal fatto che i cuccioli sono stati trovati morti o mangiati dalla madre. Inizialmente, i cuccioli di ratto con l&#39;elettroporazione di successo sono identificati da una foto 2D bioluminescenza, con un tempo di esposizione di tre minuti. Successivamente, cuccioli positivi vengono utilizzati per la creazione di immagini in 3D per specificare la posizione della zona elettroporate. <ol><li> Diluire sale sodico D-luciferina in PBS ad una concentrazione di 15 mg / ml e sterilizzare per filtrazione con un filtro a siringa sterile. </li><li> Pesare i cuccioli. </li><li> Prendere il cucciolo in una mano con l&#39;addome sulla parte superiore e allungare l&#39;addome leggermente. Iniettare 10 ml / g di peso corporeo di luciferina soluzione intraperitoneale. Per i più anziani e più agili, pre-anestetizzare i cuccioli con isoflurano nella camera di induzione prima di iniettare il luciferina. </li><li> Accendere l&#39;afflusso isoflurano del XGI-8 Gas anestesia sistema all&#39;interno della Spectrum IVIS con il 3% isoflurano. </li><li> Mettere il muso dell&#39;animale nei coni naso di vetro del sistema di anestesia. </li><li> Tenere l&#39;animale in posizione prona finché è in anestesia profonda (2-3 min). Quindi ridurre l&#39;afflusso isoflurano al 1,5%. </li><li> Scegli una misurazione 2D-bioluminescenza per selezionare cuccioli positivi da tutta cucciolata. Utilizzare le seguenti impostazioni <img alt="Schermata 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol><li> Impostare un checkmark sulla Fotografia con binning media e F / Stop alle 8, la fotocamera scatta una foto dall&#39;alto dopo aver iniziato la misurazione. </li><li> Set filtro di eccitazione: block. </li><li> Set filtro per le emissioni: aperta. </li><li> Impostare binning medio. </li><li> Set F / Stop a 1. </li><li> Impostare il livello di Fase A. </li><li> Impostare luminescenza tempo di esposizione di 180 sec. </li></ol></li><li> Per la creazione di immagini in 3D al fine di quantificare meglio la zona elettroporato dai cuccioli positivi, utilizzare le seguenti impostazioni DLIT per la luciferasi di lucciola. <img alt="Schermata 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol><li> Impostare un segno di spunta sulla fotografia, la fotocamera scatta una foto dall&#39;alto dopo aver iniziato la misurazione. </li><li> Impostare un segno di spunta sulla struttura, la superficie dell&#39;animale viene analizzata dal IVIS prima della misurazione bioluminescenza. </li><li> Use a seguito di emissione filtri e le impostazioni tempo di esposizione fino all&#39;età di due settimane: Filtro per le emissioni 1: 590 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro per le emissioni 2: 600 nm, tempo di esposizione 240 sec Filtro per le emissioni 3: 620 nm, tempo di esposizione 180 sec Filtro di emissione 4: 640 nm, tempo di esposizione 120 sec Per i topi di età superiore a P20 1 filtro di emissione: 600 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro per le emissioni 2: 620 nm, tempo di esposizione 300 sec Filtro 3 di emissione: 640 nm, tempo di esposizione 300 sec <img alt="Schermata 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . A causa della diminuzione della potenza del segnale in animali più vecchi, il tempo di esposizione è ingrandita per i tre filtri migliori emissione. </li><li> Impostare il livello di Fase B </li><li> Impostare binning medio. </li><li> Set F / Stop a 1 </li></ol></li><li> Dopo la misurazione, mar<html> k i ratti da un codice earhole per differenziarli l&#39;uno dall&#39;altro e di abbinarli alle tabelle IVIS Imaging Live </li><li> Al termine della procedura di misurazione, spegnere isoflurano afflusso e mantenere il ratto sul piatto riscaldato per alcuni minuti prima di tornare alla sua gabbia. </li></ol> 3. Analisi della bioluminescenza Immagini La generazione di immagini 3D, film 3D e la quantificazione del volume della sorgente del segnale è effettuata dal software Living Immagine preinstallato sul IVIS Spectrum. <ol><li> Generazione di immagini 3D <ol><li> In primo luogo, ricostruire una topografia superficiale, quindi impostare soglia tra 20-30%. <img alt="Schermata 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Schermata 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Inizia DLIT ricostruzione 3D con una soglia di immagine di 10% per ogni lunghezza d&#39;onda. <img alt="Schermo 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Schermo 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Schermata 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . </li><li> Crea film in 3D utilizzando il pulsante animato all&#39;interno della barra degli strumenti 3D. </li><li> Scegliere diversi orientamenti del 3D, così come lo zoom di vista come fotogrammi chiave e premere il tasto &#39;Record &amp; #39; pulsante, registrando il passaggio da una posizione / orientamento a un altro. <img alt="Schermata 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . </li></ol></li></ol> 4. Test comportamentale Test comportamentali è stata effettuata al fine di determinare se le manipolazioni genetiche IUE-mediate nel ratto potrebbero iniziare effetti a lungo termine che persistono in età adulta. Nel caso particolare, l&#39;effetto di transitorio, unilaterale piena lunghezza DISC1 umano corticale sovraespressione dopo IUE è stato studiato testando locomozione in un campo aperto (OF), con e senza una bassa dose di anfetamina, come un test specifico per la dopamina relativi comportamenti 24. In una procedura simile esercitata da Niwa et al. Nei topi IUE utilizzando DISC1 smontabile, topi IUE ma non controlli hanno mostrato ipersensibilitàall&#39;anfetamina 18. Ratti che sono stati in utero elettroporazione con un DISC1 iperespressione vettore si sono svolte in condizioni di laboratorio con la luce 12 ore 07:00-7:00 e sono stati alimentati ad libitum. A 3 mesi di età, i ratti sono stati sottoposti a test comportamentali. Per quantificare la locomozione come un visualizzatore di effetti anfetamine, un campo aperto di un sistema di attività Tru Scan situato in una camera di suono e luce-isolato è stato utilizzato. Questo sistema misura la durata e la distanza l&#39;animale si muove, il tempo e la distanza trascorsi in margine o al centro del campo aperto, così come l&#39;allevamento di comportamento 25. <ol><li> Il primo giorno, prova dopo l&#39;iniezione di soluzione salina <ol><li> Pesare gli animali. </li><li> Iniettare per via intraperitoneale 1 ml / g di peso corporeo di una soluzione salina (PBS 1x). </li><li> Subito dopo l&#39;iniezione, la soppressione dell&#39;animale nel campo aperto ed avviare la misura del sistema TruScan. Record per 15 minuti und suddividere i dati in 3 x 5 min parti. </li><li> Mettere l&#39;animale di nuovo nella sua gabbia casa. </li></ol></li><li> Secondo giorno, test di iniezione anfetamine <ol><li> Pesare gli animali. </li><li> Iniettare per via intraperitoneale 1 ml / g di peso corporeo di un / soluzione anfetamine ml 0,5 mg. </li><li> Subito dopo l&#39;iniezione soppressione dell&#39;animale nel campo aperto e avvia la misura del sistema TruScan. Record per 15 min e suddividere i dati in 3 x 5 min parti. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia casa. </li></ol></li><li> Analizzare locomozione e comportamento allevamento generato dal software specifico Tru Scan. Creare grafici con GraphPad (Prism) e calcolare le statistiche dal software SPSS Statistics. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

Gli autori di questo studio non hanno interesse finanziario in questo studio e non sono state sponsorizzate dall&#39;industria per questo studio. Tariffe di accesso aperto sono state fornite da posta pubblicazione PerkinElmer Inc..

Il nostro studio dimostra che IUE è adatto per generare ratti adulti con neuroni esprimono un transgene in una zona selettiva del cervello e che, come risultato di questo intervento, questi animali mostrano cambiamenti nel comportamento indica funzionalità della manipolazione eseguita. In questo studio, come esempio, ratti overesprimono DISC1 unilateralmente in una piccola parte della corteccia prefrontale mostrato ipersensibilità verso anfetamina (Figura 9). Selezione dei ratti per l&#39;elettroporazione successo in vivo bioluminescenza è stato efficace nel controllare la variabilità intrinseca della transfezione delle cellule IUE ed è stata applicata per generare i gruppi con una superficie IUE omogenea di bassa variabilità inter-soggetto per le indagini successive. In questo studio, siamo stati in grado di selezionare cuccioli elettroporati dalla cucciolata dalla rilevazione della fluorescenza GFP-indotta co-elettroporate in animali appena nati, anche though allo stesso tempo e nello stesso animale un segnale di bioluminescenza della luciferasi ugualmente co-elettroporate potrebbe essere rilevato dopo l&#39;iniezione luciferina (Figura 6), e la GFP che esprimono neuroni erano ancora presenti nel cervello in età di sei mesi. Concludiamo che, nel ratto, la reazione luciferasi / luciferina è adatto per differenziare animali con cervelli elettroporate successo (Figura 3). Il monitoraggio quantitativo del successo IUE relativo alla resistenza del segnale di bioluminescenza che viene misurata dai conteggi di fotoni entro lo stesso tempo di esposizione (figura 3) e corrisponde all&#39;attività enzimatica di co-espressi luciferasi. Piccoli segnali bioluminescenza sono rilevabili da 100-200 conteggi di fotoni, e, in un fulgore di ~ 1x10 4 fotoni / sec / cm 2 / spettacolo steradiante 1000-2000 cellule GFP-tinto in istologia in 6 mesi cervello di ratto. La massima disp segnalearredare una luminosità fino a ~ 5x10 6 fotoni / sec / cm 2 / steradiante e ~ 64.000 conteggi. Nel ceppo ratto Sprague Dawley usato, abbiamo osservato un indebolimento del segnale di bioluminescenza longitudinalmente con l&#39;età e il segnale scomparve oltre l&#39;età di P35 (Figura 4). A questo punto, non sappiamo se sia transitorio, plasmide di espressione basati su vettori di luciferasi diminuisce, o se il segnale di bioluminescenza si indebolisce a causa della crescente massa cerebrale, o entrambi sono le cause della scomparsa del segnale. Per il saggio funzionale presente nei ratti adulti, la selezione per studi comportamentali stava semplicemente fatta in base alla posizione del segnale, ma non con la forza del segnale di bioluminescenza. Anche se il monitoraggio bioluminescenza quantitativa 3D permesso differenziazione tra ambiti elettroporate (Figura 5), sua precisione era limitata per cellule situate nel dime profonditànsion del cervello. Figura 6 mostra un esempio di elettroporazione dell&#39;ippocampo in cui la misura bioluminescenza in 2D e l&#39;immagine 3D indicato un buon posizionamento del elettroporazione. Nel cervello post mortem sezionato, un segnale GFP-fluorescenza è stata rilevata a circa la stessa posizione del segnale di bioluminescenza, indicando corretto orientamento dei dell&#39;ippocampo. Ma mostra istologici che anche cellule nella corteccia dorsale dell&#39;ippocampo erano stati mirata (Figura 7). Ciò indica che il saggio di bioluminescenza è uno strumento utile per rilevare positivi, cuccioli IUE ed anche per avere un&#39;idea dell&#39;area elettroporate, ma, in ultima analisi, imaging non può sostituire mortem istologia post per localizzare esattamente cellule bersaglio positivamente. La nostra dimostrazione indica promessa per l&#39;applicazione della tecnologia IUE per generare sottili manipolazioni mirate di regioni cerebrali corticali o ippocampali per simulare aberrances in cmigrazione ortical o altri difetti dello sviluppo neurologico che possono influenzare l&#39;animale adulto. Mentre elettroporazione bilaterale 26 presenta il vantaggio di un effetto probabile maggiore comportamento, c&#39;è anche più mortalità di embrioni. Elettroporazione unilaterale stato scelto al fine di confrontare i due emisferi con uno come controllo interno, nonché per mostrare che manipolando IUE in un unilaterale, piccola regione è sufficiente cambiare comportamento. Cambiamenti IUE-indotti nella connettività o architettura tra neuroni possono quindi essere indotti senza evocare una lesione e la partita desiderata della regione a-essere-IUE-regolante con la prova comportamentale appropriata dipende dalla questione scientifica. Risoluzione dei problemi Dimensione cucciolata Ridotto Ci sono diversi suggerimenti per quanto riguarda l&#39;aumento della sopravvivenza dei cuccioli IUE. In primo luogo, l&#39;uso di capillari di vetro molto sottili durante elettroporazione per minimizzare lesio tessutoSi raccomanda n. In secondo luogo, non elettroporazione il primo embrione alla fine vaginale di ogni corno dell&#39;utero: la morte dei primogeniti degli embrioni aumenta le probabilità di una interruzione di tutti gli altri embrioni. In terzo luogo, dopo la nascita, i topi madri spesso uccidono parte della loro progenie a causa di stress perinatale. Al fine di ridurre lo stress aggiuntivo, non iniziare con l&#39;imaging dal vivo subito dopo la nascita, ma aspettare per sette giorni. Rilevamento GFP-fluorescenza dei cuccioli A una settimana dopo la nascita, nessun segnale di fluorescenza o utilizzando vivo fluorescenza binoculare di imaging microscopico o l&#39;imaging di fluorescenza con la IVIS Spectrum (modalità epifluorescenza e transfluorescence, per GFP eccitazione / emissione: 465/520 nm e 500/540 nm). E &#39;possibile che sia, la trasmissione limitata di breve lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di emissione di luce attraverso i tessuti come il cranio e il fondo elevato autofluorescenza della pelle impedisce utilizzando fluorescenza sotto la desccondizioni ribed nel ratto. Come mostrato in Figura 6, il segnale luciferasi nell&#39;animale vivo può anche essere rilevata nel cervello sezionato (senza cranio) e lì, anche un segnale di fluorescenza è rilevabile (Figura 6D). Differenziazione della bioluminescenza in aree cerebrali ravvicinati Anche nella figura 3D l&#39;ubicazione della zona di bioluminescenza non può essere prevista al 100%. In particolare le cellule sopra o al di sotto della zona predetto possono essere accidentalmente mirati e transfettate. La posizione esatta deve essere controllato da post mortem (fluorescenza) istologia (vedere la Figura 7).

Lo sviluppo della elettroporazione in utero metodo (IUE) che permette una modulazione dell&#39;espressione genica nel cervello di sviluppo, è stato un break-through, dato che consente studiando neurodevelopment con relativa facilità. 1-7 variazioni dei livelli di espressione di un gene bersaglio in una regione specifica del cervello durante lo sviluppo embrionale e / o perinatale nei roditori sono stati dimostrato criticamente influenza la proliferazione neuronale, migrazione, arborization, e la connettività. 8-10 La schizofrenia è una malattia mentale complesso con sintomi acuti e cronici che si è legati ad anomalie dello sviluppo neurologico 11, 12 e quindi molti dei geni candidati identificati per la schizofrenia sono indagati per i potenziali effetti modulanti sui neurosviluppo, come ad esempio per il interrotto-in-schizofrenia -1 (DISC1) gene 13-15. Lo sviluppo del cervello è regulatEd da fattori genetici e le loro interazioni con l&#39;ambiente che svolgono ruoli nella pre-, periodi di sviluppo peri-e postnatale. Un importante fattore di rischio genetico per vari disturbi comportamentali è il DISC1 16 gene. DISC1 porta atterramento di difetti di migrazione nei topi 13, 17, e la manipolazione di espressione DISC1 nella corteccia di sviluppo da IUE ha dimostrato di influenzare il comportamento di topi adulti 18. Manipolazione genica cervello IUE ha diversi vantaggi 19 durante la generazione di linee di animali transgenici. In primo luogo, l&#39;espressione genica all&#39;interno di aree di interesse si ottiene nel giro di settimane o mesi, piuttosto che diverse generazioni di allevamento linee di roditori transgenici. In secondo luogo, si evitano meccanismi di compensazione durante lo sviluppo precoce che possono schermare fenotipi in linea germinale-ingegneria animali 20. Terzo, indirizzando solo una popolazione cellulare specifica o determinata area del cervello, migratio differenze di proliferazione possono essere confrontati direttamente con la non-mutante o controllare lato controlaterale se si scelgono electroporations unilaterali. D&#39;altra parte, IUE non ha l&#39;accuratezza di temporizzazione CRE promotore-driven / lox indotta di espressione e solo una sottopopolazione di cellule in una certa area è mirata portando ad una sorta di mosaico pattern di espressione genica. Per molte applicazioni sperimentali in roditori adulti, una trasfezione transiente di un numero limitato di cellule in una regione del cervello può essere sufficiente, o addirittura desiderato, in modo che il principale vantaggio di roditori, stabili germinali transgenico è trascurabile. Infatti, IUE è utile verificare se alcune celle anormalmente sviluppati possono influenzare una intera rete di cellule o circuiti. Un altro vantaggio può essere la capacità di dimostrare effetti non cellule autonomo di un gene causa della natura mosaico del colpo. Inoltre, la generazione di topi transgenici e knockout è ancora nella sua infanzia e l&#39;usodi IUE in questa specie per studiare aberranti conseguenze per lo sviluppo del cervello è di grande interesse. Finora, uno dei principali ostacoli di utilizzo IUE per indagare le conseguenze di intervento in tali animali come gli adulti è la mancanza di successo di monitoraggio elettroporazione. Finora, GFP-co-trasfettate neuroni fluorescenti in diretta cuccioli di ratto appena nati non potevano essere rilevati con un microscopio a fluorescenza binoculare adatto o con l&#39;imaging di fluorescenza del IVIS Spectrum. Per superare questo ostacolo, ci cotrasfettate un gene reporter luciferasi e svolta bioluminescenza imaging dal vivo di cuccioli da 3 dimensioni (3D) quantificazione della zona del cervello IUE. Come esempio per dimostrare l&#39;applicabilità di questo metodo in un saggio funzionale di provarne la manipolazione genetica sviluppo neurologico, un co-iniezione di plasmidi contenenti DISC1 umano, luciferasi, e GFP nel ventricolo laterale di embrioni di ratto <sup&gt; 3 seguito da elettroporazione con un elettrodo pinzetta stata eseguita. Mentre segnali di fluorescenza non potevano essere rilevati in fasi postnatali in vivo, un segnale di bioluminescenza solido derivato dal metabolismo luciferina mediante co-trasfettate gene della luciferasi è stato rilevato fino a cinque settimane dopo la nascita. 3D-misure della zona del cervello quantificazione permesso elettroporato cui cuccioli con elettroporazione insufficiente o fuori luogo sono stati identificati sin dall&#39;inizio, quindi, consentendo l&#39;assegnazione degli animali IUE (gene di interesse e strapazzate controllo) per gruppi sperimentali con le aree del cervello elettroporate abbinati a bassa variabilità . L&#39;uso di ratti adulti IUE in paradigmi comportamentali è stata dimostrata come esempio dell&#39;utilità di questo protocollo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

Elettroporazione in utero (IUE) è una tecnica che permette di modificazione genetica delle cellule del cervello per studiare lo sviluppo neuronale. Finora, l&#39;uso di IUE per indagare il comportamento o neuropatologia nel cervello adulto è stato limitato dai metodi insufficienti per il monitoraggio della IUE successo trasfezione con tecniche non invasive negli animali post-natale. Per il presente studio, ratti E16 sono stati usati per IUE. Dopo l&#39;iniezione intraventricolare degli acidi nucleici nei embrioni, il posizionamento degli elettrodi pinzetta era critica per il targeting o la corteccia di sviluppo o dell&#39;ippocampo. Ventricolare co-iniezione ed elettroporazione di un gene luciferasi permesso un monitoraggio delle cellule trasfettate postnatally dopo l&#39;iniezione luciferina intraperitoneale nel anestetizzato P7 vivo cucciolo da bioluminescenza in vivo, utilizzando un dispositivo Spectrum IVIS con software 3D quantificazione. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Definizione Area di bioluminescenza poteva chiaramente distinguere tra electroporations corticali e dell&#39;ippocampo e rilevare un segnale longitudinalmente nel corso del tempo fino a 5 settimane dopo la nascita. Questa tecnica di imaging permesso di selezionare cuccioli con un numero sufficiente di cellule trasfettate assunte necessaria per innescare effetti biologici e, successivamente, effettuare indagini comportamentali alle 3 mese di età. Come esempio, questo studio dimostra che IUE con la lunghezza gene DISC1 umano nella corteccia di ratto hanno portato a anfetamine ipersensibilità. GFP cotrasfettate potrebbe essere rilevato in neuroni di post mortem microscopia a fluorescenza in criosezioni indicanti l&#39;espressione genica presente alla ≥ 6 mesi dopo la nascita. Concludiamo che postnatale di imaging bioluminescenza consente di valutare il successo di trasfezioni transienti con IUE nei ratti. Indagini sull&#39;influenza di manipolazioni genetiche topici durante neurodevelopment sul cervello adulto e la sua connettività è notevolmente facilitato. Per molte questioni scientifiche, questa tecnica può integrare o addirittura sostituire l&#39;uso di topi transgenici e fornire una nuova tecnologia per le neuroscienze comportamentali.

<html> La figura 3 mostra dal vivo le misure di imaging di tre cuccioli di ratto al P7 dopo l&#39;iniezione di 150 mg luciferina / kg di peso corporeo. Differenze di potenza del segnale che indicano la variabilità nella efficienza del IUE sono visibili. Segnali bioluminescenza forti sono stati registrati fino P36 (Figura 4). Nella Figura 5, la capacità di definire corticale (Figure 5A e 5C) e dell&#39;ippocampo (figure 5B e 5D) elettroporazione da imaging bioluminescenza sono raffigurati. Correlazione del segnale di bioluminescenza (Figura 7A) con il suo segnale di fluorescenza dopo la rimozione del cranio (Figura 7B) e le corrispondenti cellule GFP-elettroporate nel cervello cryosectioned (Figura 8) a P14 sono rappresentati nelle Figure 6-8. Di nota, non c&#39;era rilevazione di un segnale di fluorescenza in ratti vivi in ​​qualsiasi punto nel tempo. tenda &quot;&gt; In vivo bioluminescenza consente discriminazione approssimativa di differenti aree del cervello elettroporate da 2D (Figure 5A e 5B) che è notevolmente migliorata con il programma DLIT del software Spectrum IVIS generando immagini 3D (Figure 5C e 5D). Negli esempi mostrati , elettroporazione della corteccia prefrontale e ippocampo potrebbe essere distinto. Occorre notare che mentre mira a elettroporazione l&#39;ippocampo, alcune cellule progenitrici per la corteccia sdraiata dorsale dell&#39;ippocampo possono anche essere colpiti (Figura 7). Rats unilateralmente in utero elettroporate con pCAX vettore nella corteccia e successivamente che iperesprimono piena lunghezza DISC1 umano sono stati studiati sia per la spontanea e iperattività anfetamine indotta da adulti. Ratti elettroporate con pCAX-DISC1 sono ipersensibili a una bassa dose di anfetamina. Questi ratti spostato significativamente more dopo il trattamento anfetamine che dopo di iniezione salina, mentre gli animali di controllo non ha (Figura 10). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Figura 1. Schema della posizione degli elettrodi per A) corteccia elettroporazione e B) elettroporazione ippocampale; verde = iniettato DNA-Mix all&#39;interno del ventricolo. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Figura 2. Reazione Luciferase. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Figura 3. Misurazione luminescenza di ratti P7 dopo l&#39;iniezione di 150 mg / kg di peso corporeo luciferina, tempo di esposizione 180 sec; A) ratto senza segnale luminescente; B) ratto<html> con un segnale di bioluminescenza debole C) ratto con un segnale forte luminescenza. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Figura 4. Linea temporale delle misure di bioluminescenza consecutive dello stesso ratto dopo iniezione di 150 mg / kg luciferina dimostrando una finestra temporale in cui grande successo IUE può essere rilevato. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Figura 5 Illustrazione delle differenze tra elettroporazione corticale e ippocampale a P7 A) e B) immagini 2D;. C) e D), le immagini in 3D, A) e C) da corteccia, B) e D) da ippocampo.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Figura 6. Illustrazione di E16 elettroporazione ippocampale di un cucciolo di ratto a P14 A) 2D-picture di bioluminescenza B) Illustrazione 3D del segnale C bioluminescenza) sezionato il cervello con il segnale di bioluminescenza D) cervello con GFP segnale epi-fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Figura 7. Dettaglio di un&#39;immagine fluorescenza da una sezione crio 20 micron dello stesso P14 ratto cervello elettroporate con GFP contenenti plasmide e luciferasivettore, nuclei colorazione con DAPI; CA1-3 = Cornu Ammonis 1-3; DG = giro dentato, FC = Fasciolarum cinereum. Video 1. Animazione 3D di un ippocampo elettroporata ratto a P14. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Figura 8. Sistema di prove Amphetamine: iniezione di soluzione salina primo giorno prima della prova di 15 min, 24 ore dopo l&#39;iniezione di anfetamine prima della prova nella camera di campo aperto. <img alt="Figura 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Figura 9. Prova Amphetamine. Grafico a barre che mostra la distanza spostato (in cm) dell&#39;animale registrato da un sistema TrueScan oltre 15 min barre bianche = gruppo di controllo;. Barre grigie = DISC1 gruppo sovraespressione; gruppo di controllo n = 10; DISC1 gruppo sovraespressione n = 11; ANOVA: Geno * trattamento p = 0.043; T-Test per il tempo salino totale vs ns anfetamine = non significativo pCONTROL = 0,172, pDISC1 = 0.001.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

I geni possono essere manipolati durante lo sviluppo della corteccia o nell&#39;ippocampo di ratto mediante elettroporazione in utero (IUE) a E16, per permettere modifiche rapide e mirate in termini di connettività neuronale per gli studi successivi di comportamento o neuropatologia negli animali adulti. Postnatale imaging in vivo per il controllo di successo IUE è eseguita da bioluminescenza di attivare luciferasi co-trasfettate.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K Views.  Medical School Düsseldorf.  I geni possono essere manipolati durante lo sviluppo della corteccia o nell'ippocampo di ratto mediante elettroporazione in utero (IUE) a E16, per permettere modifiche rapide e mirate in termini di connettività neuronale per gli studi successivi di comportamento o neuropatologia negli animali adulti. Postnatale imaging in vivo per il controllo di successo IUE è eseguita da bioluminescenza di attivare luciferasi co-trasfettate. 

Video: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

Generazione di topi transgenici per uso topico

Riepilogo

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Capitoli in questo video

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Neuroimaging funzionale con l'impiego dell'ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell'ippocampo mouse utilizzando

La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso

Simultaneo

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille