Gli autori desiderano ringraziare Giuseppe LoTurco e Dennis Selkoe per le discussioni utili su questa tecnica. Gli autori ringraziano i donatori della Fondazione Americana Assistenza Sanitaria, per il supporto di questa ricerca.

Il protocollo di base per l&#39;elettroporazione in utero è stata descritta in dettaglio in un altro articolo JOVE dal laboratorio Kriegstein 1, 2. Questa tecnica è stata originariamente descritta nel laboratorio Osumi 3 e il nostro protocollo si basa su quello sviluppato nel laboratorio LoTurco 4. Vi forniremo una panoramica del nostro protocollo di elettroporazione in utero di embrioni di ratto, concentrandosi sui dettagli più importanti, seguita da una descrizione del nostro protocollo che si applica in elettroporazione utero allo studio della funzione dei geni nella crescita processo neuronale. 1. Elettroporazione in utero <ol><li> Preparazione aghi DNA e di carico Il primo passo per electroporations in utero è quello di progettare l&#39;esperimento per determinare quali costruisce il DNA da iniettare. Questo metodo è utile sia per misexpressing o abbattere i geni di interesse. Se state pensando di misexpressing o sovraespressione di un gene, assicurarsi di utilizzare un promotore che è attiva nelle cellule precursore neuronali. Si consiglia il promotore CAGGS, che consiste del promotore pollo beta-actina e il potenziatore CMV 5. Poiché solo un piccolo sottoinsieme di cellule sono transfettate con elettroporazione in utero, è fondamentale per includere un plasmide codifica una proteina fluorescente GFP, come in modo da poter seguire quelle cellule che sono state con successo elettroporate. Per la GFP codifica plasmide, si consiglia di preparare il DNA ad una concentrazione di 0,5 mg per microlitro. Per i costrutti shRNA, abbiamo scoperto che 0,5-1,0 g per i risultati microlitri efficiente abbattere del gene di interesse. Per sovraespressione o misexpression, usiamo tra 1,0 e 3,0 mg per microlitro, a seconda delle dimensioni del gene e il livello di espressione che l&#39;esperimento richiede. DNA sono preparati utilizzando una endotossina-free kit di preparazione Qiagen, e diluito in 1 x PBS. Noi iniettare circa 0,5-1,0 microlitri per cervello embrionale, così, per una cucciolata di animali che preparare 10 ml di miscela di DNA per l&#39;iniezione. Si aggiunge 1 ml di Green veloce al DNA in modo da poter seguire il DNA iniettato. Tirando aghi per la forma corretta è un passo critico. Walantus et al. Usa un sistema diverso per la consegna del DNA e quindi la loro preparazione ago è anche slighly diverso 1,2 allora la nostra. Le impostazioni che si utilizza per tirare il vostro aghi dipende dalla marca di aghi estrattore che hai. Noi usiamo modello 750 da David Kopf. Le impostazioni da noi utilizzati sono: Heat 1: 9.0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, dimensione filamento 3,0 mm, di prossimità riscaldamento: 3 mm, Tempo: 10 sec. Una volta tirato, abbiamo tagliato il nostro aghi con una lametta in una ~ angolo di 45 gradi in modo che la distanza tra la maggior parte dell&#39;apertura alla punta è di 11 mm. Siamo quindi caricare il DNA dal backend dell&#39;ago. Abbiamo poi riempire lo spazio rimanente nella ago con olio di mais. Per l&#39;iniezione del DNA, usiamo un Picospritzer III. A seconda della coppia conica esatto che viene tagliato per ciascun ago, abbiamo impostato il Picospritzer 4,0-6,0. Usiamo un pedale per fornire l&#39;aria pressurizzata che espelle il DNA dall&#39;ago. </li><li> Preparazione degli animali per la chirurgia Noi usiamo esenti da organismi patogeni ratti Sprague Dawley esclusivamente per questi interventi. Diversi altri laboratori uso topi di varia genotipi pure. Qui, descriviamo mostrare il nostro protocollo per l&#39;elettroporazione di E15 embrioni di ratto, ma in utero elettroporazione viene eseguita di routine nei ratti di età compresa tra E13 e E18. Mentre elettroporazione fase iniziale obiettivi strati profondi della corteccia, poi electroporations fase target strati più superficiali. Gli animali sono dato un pre-operatoria dose di buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) prima della chirurgia ha inizio. Ci sono opzioni multiple per anestetizzare l&#39;animale. Walantus et al. Isofuorane utilizza inalazione, mentre noi abitualmente uso iniezione intraperitoneale di ketamina (40-80 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg) 1,2. Un pizzico punta deve sempre essere eseguita per assicurare che gli animali siano completamente anestetizzati e non risponde. Gli animali sono tenuti al pad riscaldato per tutta la procedura chirurgica. Pelliccia dell&#39;animale è rasato nella regione di incisione, e lavati tre volte con etanolo seguito da tre volte con lo iodio. Un&#39;incisione è fatta nella pelle appena lateralmente alla linea mediana, seguita da una incisione nel muscolo. Le corna uterine sono esposti con molta attenzione. Sono gentilmente preso in giro dalla cavità del corpo con la punta delle dita. Mantenere gli embrioni idratata con PBS sterile mentre sono al di fuori della cavità del corpo. </li><li> Iniettando il DNA ed elettroporazione Al primo avvio di eseguire questi interventi, la parte più difficile è acquisire familiarità con cui è necessario iniettare il DNA in modo che si riempiono i ventricoli laterali, e abituarsi a quanto in profondità si inietta l&#39;ago per colpire la regione corretta. Embrioni vengono delicatamente manipolate con la punta delle dita in modo che possiate identficare dove la testa è, e se si guarda attentamente si sarà in grado di vedere la sutura linea mediana. Questo serve come punto di riferimento generale che è possibile utilizzare per determinare dove il ventricolo laterale si trova. Noi iniettare il DNA attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale. Usiamo un pedale per controllare l&#39;iniezione del DNA - impulsi multipli del DNA sono effettuati fino a quando il ventricolo laterale è pieno il DNA / miscela colorante. Abbiamo poi posizionare gli elettrodi pagaia su entrambi i lati della testa dell&#39;embrione e utilizzare un altro pedale per fornire l&#39;impulso attraverso la testa di un embrione. Il posizionamento degli elettrodi è fondamentale nel determinare quale regione della corteccia è elettroporate. Dal momento che il DNA è carico negativamente, il DNA si sposterà verso l&#39;elettrodo positivo quando una carica viene dissipato attraverso le pale. A seconda della posizione esatta degli elettrodi, diversi sottoinsiemi di cellule saranno mirati. Noi abitualmente posto l&#39;elettrodo positivo vicino al dorso-mediale posizioni in tutto il cervello. Tuttavia, il laboratorio LoTurco splendidamente mostrato che se si mette gli elettrodi nelle regioni più ventrale laterale del cervello è possibile indirizzare le cellule del cortico-striatale cellule confine e ha colpito del flusso laterale corticale 6. Ogni embrione può essere elettroporate, e diverse combinazioni di costrutti di DNA possono essere utilizzati in ogni embrione. </li><li> Sutura e post-operatorio A seguito di elettroporazione di tutti gli embrioni, le corna uterine sono accuratamente restituite alla cavità del corpo, ed entrambi lo strato muscolare e la pelle sono suturate. La tecnica per questo è indicato nella Walantus et al 1,2. Gli animali sono costantemente monitorati fino a quando non recuperare da anestesia, e la buprenorfina analgesico (0,05-0,1 mg / kg) è somministrato ogni 8-12 ore. </li></ol> 2. Coltura elettroporate neuroni corticali <ol><li> La raccolta cervelli elettroporate e sezionare regione elettroporate Per le analisi in vivo dopo l&#39;elettroporazione in utero, gli animali possono essere raccolti in un punto qualsiasi momento da 24 ore dopo l&#39;elettroporazione ai primi dopo la nascita fino all&#39;età adulta. Tuttavia, quando i neuroni coltura primaria abbiamo raccolto 24 ore dopo l&#39;elettroporazione in E16. A questo punto, gli embrioni elettroporate esprimono livelli rilevabili di BPA. Gli animali sono l&#39;eutanasia con l&#39;inalazione di biossido di carbonio e decapitazione rapida. Gli embrioni vengono sezionati fuori dell&#39;utero e messo in HBSS con cationi bivalenti, tenendo traccia dei quali embrioni sono stati elettroporate con cui plasmidi DNA. E &#39;fondamentale utilizzare HBSS filtrata, provette sterili e piatti, e gli strumenti in autoclave per la dissezione. Le cortecce vengono sezionati fuori e le meningi rimosso utilizzando un microscopio in un cappuccio. Queste cortecce vengono poi osservati al microscopio dissezione con la capacità di visualizzare GFP. Regioni GFP positive della corteccia sono stati identificati, e noi ue un paio di forbici Vanna per tagliare le regioni GFP positive da parte della corteccia. Questi pezzi sono posti in HBSS senza cationi bivalenti in un tubo da 15 ml. </li><li> Dissociare e placcatura neuroni Una volta che tutte le regioni GFP positive sono sezionati, HBSS viene sostituito con 0,25% tripsina, e incubate a 37 ° per 5 minuti. Tripsina viene rimosso, sostituito con terreni in piastra (DMEM + 5% FBS + Penn / strep glutammina +), e triturato 5-7 volte a dissociare le cellule. Volumi utilizzati dipendono dalla quantità di tessuto presente. Cellule dissociate sono poi placcato in CC2 diapositive camera rivestita. Per i due scivoli da camera, abbiamo piastra 200,000-350,000 cellule per camera in un volume di 1,5 ml di terreni in piastra. Dopo 4 ore, terreni in piastra è aspirato e sostituito con 1,5 ml di terreni di coltura neuronale (Neurobasal supporti + B27 + supplemento glutamax + gentamicina) per camera. </li></ol> 3. Analizzando escrescenza neuronale processo <ol><li> Fissaggio e immunocolorazione culture Al fine di misurare effecs breve termine della manipolazione genetica di queste cellule, raccogliamo i neuroni primari dopo tre giorni in vitro. Se i neuroni primari sono di essere colti più per ulteriori analisi, la metà dei media dovrebbero essere sostituiti ogni tre giorni. Per il fissaggio delle culture, abbiamo aspirare i media dalle camere, e fissare i neuroni nel 4% paraformaldhyde per 15 minuti. Fissazione seguito, le cellule vengono lavate due volte in PBS e poi mettere in soluzione bloccante (siero asino 2% con 0,1% Triton X-100 in PBS) per un&#39;ora. Le cellule vengono poi incubate in anticorpo primario per 1 ora. Per le analisi della crescita degli processo neuronale, si usa anticorpi anti-beta tubululin per identificare i neuroni - immunocolorazione beta tubulina II etichette neruonal il corpo cellulare, dendriti e assoni. Le cellule vengono poi lavate tre volte in PBS per cinque minuti, e poi incubate in Cy3-anti topo per 1 ora, seguita da altri tre lavaggi PBS, controcolorazione nuclei con DAPI e montaggio. </li><li> Misura neurite lunghezza Immagini di GFP positive, beta-tubulina III neuroni positivi sono invece acquistati su Axioskop Zeiss con un sistema di MC100 telecamera. Diverse variabili possono essere esaminate in queste cellule GFP positive tra cui la lunghezza di tutti i neuriti, lunghezza del più lungo dei neuriti, ramificazione dei neuriti, la dimensione del soma cellulare, ecc Abbiamo usato questo metodo per analizzare escrescenza sul processo neuronale abbattere o sovraespressione di geni relative al neurosviluppo e neurodegenerazione, con particolare attenzione alla lunghezza del processo neuronale. Al fine di misurare i processi neuronali escrescenza, usiamo AxioVision LE 4,4 software (dalla Zeiss). All&#39;interno di questo software, è disponibile un&#39;opzione per selezionare lo strumento &quot;bozza&quot;. Con questo strumento, è possibile utilizzare il mouse del computer per tracciare la lunghezza di ogni processo neuronale. È fondamentale per definire l&#39;obiettivo che si sta utilizzando al fine di ottenere una misura accurata del tuo neuriti. Per queste analisi, di solito usare un obiettivo 20x. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Abbiamo scoperto che Sprague Dawley numero dei nati varia tra i 6 ei 14 embrioni. Noi di solito electroporate tutti gli embrioni. Ogni embrione può essere elettroporate con una diversa combinazione di DNA. Tuttavia, di solito electroporate almeno quattro cervelli con la stessa condizione e la piscina questi cervelli prima di dissociazione e placcature. Abbiamo scoperto che con questa tecnica circa il 75% dei cervelli elettroporate sono mirati alla regione desiderata della corteccia, sia che si tratti dorsale della corteccia mediale o ventrale laterale (Figura 1). Inoltre, abbiamo trovato electroporations presto al E13-14 neuroni livello di destinazione profonde come Tbr1 neuroni positivi strato VI, mentre dopo electroporations target positivo CTIP2, TBR1 negativo cellule V strato, e più tardi ancora bersaglio electroporations Brn2 positivo strato II / III cellule. Un&#39;eccellente descrizione di marcatori diversi e la spiegazione delle specifiche sottotipo neuronale nella corteccia trovato in un articolo di Moleneaux et al 7. La Figura 2 mostra sezioni coronali del cervello elettroporate alle due giorni embrionale 15,5 o 17,5 e raccolte al giorno dopo la nascita 5. Visualizzati in rosso è immunocolorazione per Oct6. Potete immunostain per i marcatori di cultura per confermare ciò che le popolazioni strato di cellule che hanno preso di mira. Abbiamo scoperto che ci si può aspettare di indirizzare la stessa popolazione strato di cellule di cellule in ogni embrione della stessa cucciolata (in altre parole, l&#39;orientamento dipende dalla timepoint embrionale piuttosto che su altre variazioni tecniche). Nella cultura, la percentuale di cellule che sono GFP positive possono variare notevolmente a seconda di come conservatore voi quando sezionare la regione positivo GFP (Figura 3). Tuttavia, anche quando siamo molto conservatori e sezionare solo la patch di cellule GFP positive, la percentuale più alta che osserviamo è il 5-10% - anche se sono sezionare la regione della corteccia che è stato elettroporate, le cellule in un solo strato si essere mirati. Questo effciency trasfezione bassa è utile per identificare i processi che appartengono alla cella electoporated che si sta analizzando. Cellule placcatura in questa densità più elevata contribuisce ad avere heathier culture, tuttavia, è difficile capire quale processo appartiene a quale corpo cellulare nelle cellule GFP negativo (Figura 3). Se avete problemi a vedere tutti i processi belle delle cellule elettroporate, è possibile aumentare la concentrazione di DNA GFP che si sta electroporating per aumentare l&#39;espressione di GFP, oppure si può immunostain le cellule dissociate utilizzando un anticorpo anti-GFP (da Invitrogen ) con un anticorpo Cy2 secondario. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. E15.5 ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con plasmide GFP e raccolto tre giorni dopo. Sulla base del posizionamento degli elettrodi, diverse regioni della corteccia saranno mirati. AF mostrano fluorescenza GFP nel cervello intero. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. E15.5 (A) o E17.5 (B) ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con GFP plasmide e raccolta al giorno dopo la nascita 5. Cervelli sono stati fissati, sezionati coronale utilizzando un vibratome (100 sezioni micron), e immunostained per Oct6 (rosso). A e B mostrano le immagini confocale di sezioni immunostained. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. E15.5 ratti Sprague-Dawley sono stati elettroporate con plasmide GFP. 24 ore dopo l&#39;elettroporazione, i cervelli sono state raccolte e GFP-positive, le regioni elettroporate sono stati sezionati e dissociato, come descritto nel video. Dopo 3 giorni in vitro, le cellule sono stati fissati e immunostained per bIII-tubulina (rosso) e la colorazione dei nuclei con DAPI (blu) (A, C). La lunghezza del più lungo neurite è stata misurata utilizzando il software AxioVision(B, D).

<ol>
	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Studio in vitro su colture primarie neuronali consentono di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, costrutti shRNA o misexpression può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metod...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cortical Neuron Preparation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14185-052</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10X Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 )</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14065-056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES pH 7.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15630-080</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dishes and Vials:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>
</td>
<td>Fisherbrand</td>
<td>08-757-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 x 15 mm Petri Dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351007</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-547-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 mL conical vial</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>62-554-205</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection Tools:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>91402-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Standard Forceps</td>
<td>
</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11000-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Curved Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11273-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11255-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vannas spring scissors </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Miscellaneous:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>.25% Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hausser Scientific</td>
<td>1490</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hand-Held Tally Counter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z169021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plating Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11960-051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F4135</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Growth Medium:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NEUROBASAL Medium </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum-Free Supplement </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX -I Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin Reagent Solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immunostaining:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fixative, Washes, and Blocking Buffer:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4417</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9284</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>017-000-121 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antibodies:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>beta-III tubulin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>MAB1637</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MAP2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB15452</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy3 anti-mouse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>715-166-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Donkey Cy2 anti-chicken</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immuno</td>
<td>703-226-155 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>D3571</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide Preparation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>154852</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>KPL</td>
<td>71-00-16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48393-106 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear nail polish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>72180</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporation:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>995-2949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>4015809TV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>buprenorphine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Henry Schein</td>
<td>1118217</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Parker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BTX square wave electroporator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BTXECM830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>450488</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

Studio in vitro su colture primarie neuronali permette di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, shRNA o costrutti del DNA può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metodi. L&#39;uso di elettroporazione in utero ad introdurre i costrutti del DNA nella corteccia roditori embrionale permette di alcuni sottoinsiemi di cellule su cui agire: mentre elettroporazione dei primi strati embrionali obiettivi corteccia profonda della corteccia, elettroporazione a tarda timepoints embrionale obiettivi strati più superficiali. Inoltre, il posizionamento differenziale di elettrodi sulle teste dei risultati della singola embrioni nel individuazione delle regioni dorso-ventrale mediale contro-laterale della corteccia. A seguito di elettroporazione, le cellule trasfettate possono essere asportate, dissociato, e placcato in vitro per l&#39;analisi quantitativa di crescita dei neuriti. Qui, forniamo un passo-passo metodo per misurare quantitativamente escrescenza neuronale processo in sottoinsiemi di cellule corticali. Il protocollo di base per l&#39;elettroporazione in utero è stato descritto in dettaglio nei due articoli JOVE altri dal laboratorio Kriegstein 1, 2. Vi forniremo una panoramica del nostro protocollo di elettroporazione in utero, concentrandosi sui dettagli più importanti, seguita da una descrizione del nostro protocollo che si applica in elettroporazione utero allo studio della funzione dei geni nella crescita processo neuronale.

Watch this Scientific Journal Video about In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons at JoVE.com

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.6K Views.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

Video: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Ricerca

Neuroscienze

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rapida genotipizzazione degli animali Seguito da Stabilire colture primarie di neuroni del cervello

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...