Vorrei ringraziare il Dott. Jennifer Curtiss per la foto in fig. 1 e Jeremy Fagan e il Dr. Marlow Firenze per la lettura critica del manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal NIH concedere 1R01GM088202.

1. Vola dissezione testa <ol><li> Assicurarsi di avere tutti i materiali a portata di mano (compresi gelatina vetrini rivestiti). Preparare glutaraldeide e fissativi osmio (vedi sotto). Per genotipo di inserire, aliquota 200μl soluzione fissare glutaraldeide in provette da 1,5 ml su ghiaccio. </li><li> Anestetizzare vola sul CO 2 pad (che di solito sezionare sette teste volare a incorporare sei per genotipo nel caso in cui una testa è distrutto durante la procedura). </li><li> Attesa e premete leggermente il torace del lato volare, dorsale alto, con le pinzette e utilizzare un bisturi affilato per tagliare la testa. </li><li> Stabilizzare la testa vola toccando il collo con le pinzette e con attenzione fetta fuori una piccola parte di un occhio. Questo aumenta la penetrazione del fissativo (se si intende utilizzare le sezioni occhio per l&#39;analisi clonale, tagliare l&#39;occhio con cloni senza o meno). Evitare di toccare e di danneggiare l&#39;occhio intatto, che sarà poi sezionato. </li><li> Toccare la testina con le pinzette o il bisturi sulla superficie del cut off e trasferimento occhio della testa in glutaraldeide / fosfato fissativo su ghiaccio (le teste spesso galleggiante sopra il fissativo) Le teste dissezionato non dovrebbero essere tenuti in glutaraldeide fissare più a lungo di 15 minuti prima l&#39;aggiunta di osmio. Ripetere i passaggi 1,2-1,5 con le mosche che altri lo stesso genotipo. </li></ol> 2. Fissazione e di inclusione (utilizzo di guanti per tutte le fasi!) <ol><li> Gira la flyheads in centrifuga Eppendorf per 1 minuto a 10.000 giri. Continua anche se il capo non affondare. </li><li> Aggiungere 200μl di OsO 4 soluzione e fissare per almeno 30 minuti e fino a 1 ora su ghiaccio. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere la glutaraldeide / osmio soluzione (assicurarsi di utilizzare le corrette procedure di smaltimento dei rifiuti!) E sostituirlo con una soluzione di osmio 200μl. Incubare in ghiaccio per 1-6 ore. Assicurarsi sempre le teste sono completamente ricoperto di liquido e mai rimuovere tutta la soluzione come la testa o gli occhi potrebbe crollare! </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, scartare fissativo, aggiungere 0,5-1ml 30% etanolo e incubare per almeno 5 minuti in ghiaccio (assicurarsi di utilizzare correttamente le procedure di smaltimento dei rifiuti in quanto l&#39;etanolo contiene ora osmio!). </li><li> Ripetere la stessa operazione con il 50%, 70%, (80%), il 90% e due volte di etanolo al 100%. Includere il passo etanolo all&#39;80% se si utilizzano gli occhi per l&#39;analisi al microscopio elettronico. Dopo la fase di lavaggio del 70%, i campioni possono essere rimossi dal ghiaccio. </li><li> Sostituire l&#39;etanolo con un uguale volume di ossido di propilene (volatili, continuano a lavorare nel cappuccio). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere ossido di propilene lavare. Lavoro in batch in caso di trattamento genotipi in parallelo per evitare collasso degli occhi a causa dell&#39;evaporazione di ossido di propilene. </li><li> Eliminare la maggior parte di ossido di propilene e l&#39;utilizzo di una pipetta di plastica trasferimento, aggiungere circa 500μl di un 1:1 in resina: soluzione di ossido di propilene. Equilibrare la notte a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Incorporare e disposizione in stampi <ol><li> Assicurarsi che tutti gli stampi sono etichettati in modo da tenere traccia delle differenti genotipi, quindi riempire gli stampi con il 100% resina. Non riempire troppo (no &#39;alte colline&#39; su tutta la superficie degli stampi, quando guardando dritto su tutta la superficie dello stampo). Usa resina dura per l&#39;analisi EM. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, togliere la resina 50% dal teste, sostituire con il 100% di resina, e incubare per 3-4 ore a temperatura ambiente. Come teste sono infiltrati con la resina, essi si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Utilizzando uno stuzzicadenti che è stato colpito su una superficie dura, una volta per creare un gancetto, una testa di trasferimento al momento in uno stampo. </li><li> Posizionare un foglio di alluminio sulla zona di lavoro della vostra portata dissezione per la protezione contro le fuoriuscite di resina. </li><li> Utilizzando un ago da dissezione e guardando se il vostro scopo, agitare la testa leggermente nella resina e con attenzione si sposta verso il fondo dello stampo vicino l&#39;estremità appuntita. </li><li> Allineare con cura la superficie del intatta (!) Occhio (o il vostro aereo future sezionamento se si vuole avere sezioni) collo in giù con la parete frontale dello stampo, avendo cura di mantenere la superficie tangenziale dell&#39;occhio circa la metà a testa diametro di distanza dalla parete dello stampo. In rari casi, un occhio che crolla può essere visto come uno spazio vuoto tra la superficie dell&#39;occhio e la cuticola testa. Se avete un occhio crollato, sostituirlo con l&#39;occhio 7 ° di ricambio. </li><li> Ripetere con tutte le teste. Una volta fatto con tutti i tracciati, ricontrollare tutti gli occhi per assicurarsi che non si muove quando è stato rimosso l&#39;ago della resina. </li><li> Se avete problemi con occhi che si muovono quando si rimuove l&#39;ago dissezione, posizionare l&#39;occhio come desiderato, in modo rapido ritrarre l&#39;ago un po &#39;lontano dalla testa e si estrae quindi lentamente l&#39;ago completamente. </li><li> Cuocere gli stampi durante la notte a 70 ° C. </li></ol> 4. Rifilatura e di sezionamento <ol><li> Rimuovere i blocchi indurito dagli stampi piegando gli stampi, keeping traccia di quale blocco corrisponde a quale genotipo (ad esempio, memorizzare in fiale di scintillazione di piccole dimensioni). </li><li> Per il taglio, utilizzare un mandrino appropriato per il microtomo che è montato a faccia in su un blocco di plexiglas o alluminio. Montare il blocco di tagliare, gli occhi in su, nel mandrino. </li><li> Nell&#39;ambito di applicazione dissezione con un rasoio rivestiti in Teflon ordinò, accuratamente tagliato fuori solo lo strato superiore del blocco. Questo lascerà una superficie trasparente attraverso la quale si dovrebbe vedere l&#39;occhio e può quindi prevedere il piano futuro di sezionamento. Evitare di tagliare le dita! </li><li> Tagliare l&#39;eccesso di plastica su entrambi i lati della testa e sulla parte anteriore (cioè quella che era la parte superiore dello stampo quando si allinea gli occhi) finché la maggior parte della plastica intorno alla testa è tagliata. E &#39;meglio per avvicinarsi lentamente alla testa da tagliare più sottili strati di plastica. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio pulito, rimuovere con attenzione strati sottili dalla parte superiore dell&#39;occhio nel piano esatto volete sezione successiva (di solito tangenzialmente ad occhio, con una leggera angolazione verso la superficie dello stampo originale). </li><li> Continuare fino a poco iniziano a tagliare la superficie esterna dell&#39;occhio. Assicurarsi di utilizzare aree pulite della lama per ottenere una superficie lucida e trasparente, che rende più facile allineamento nel microtomo. </li><li> Per risparmiare sulle lame di rasoio, usare vecchie lame per il taglio greggio intorno ai lati del blocco e l&#39;uso di una lama fresca per il taglio sottile (primo taglio e 4.6). Alla fine si avrà una piramide su tre lati con un po &#39;inclinato, cut-off superiore che corrisponde al piano di sezione futuro. </li><li> Montare il blocco nel microtomo. Sezionamento effettiva varia a seconda del tipo di microtomo e non saranno descritte in dettaglio qui. Usiamo un Sorvall MT5000 con un coltello di diamante di qualità isto di tagliare 0,5 a 1μm sezioni. Per la luce analisi al microscopio, lievi variazioni di spessore sezione non importa. Se cloni sezionamento segnato da un bianco + transgene, sezione 1μm sezioni per assicurare di avere granuli di pigmento abbastanza adiacente alla rhabdomeres per sezione (Fig. 2). </li><li> Sezioni galleggia sull&#39;acqua. Sollevare primi 20-30 sezioni con una punta schiacciata di legno Q-tip da sotto la superficie dell&#39;acqua in un movimento di rotazione e trasferirli in una goccia d&#39;acqua su un vetrino da gelatina vetro rivestito (tenuto su una piastra di riscaldamento a circa 100 ° C ). </li><li> Ripetere con altri 20-30 sezioni. Attendere fino a quando l&#39;acqua è evaporata e sezioni bastone alla diapositiva. Di solito, le sezioni di 3 occhi disposti in tre colonne (tre occhi) da filari twp (alto / basso sezioni) si adattano bene su una diapositiva. </li></ol> 5. Colorazione e analisi al microscopio <ol><li> A meno che cloni di sezionamento, sezioni macchia. Porre il vetrino con sezioni su un blocco di riscaldamento a 90 ° C. Dispensare toluidina-blu soluzione colorante da una siringa da 30 ml collegata ad un filtro 0.22μm sul vetrino e macchia per 10 secondi. Sciacquare immediatamente a lungo con acqua distillata. Asciugare all&#39;aria. </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica trasferire, distribuire 3 gocce di DPX montaggio medio sul vetrino e coprire con un coprioggetto. Top con 3 monetine e lasciare che il montaggio di media indurire (per esempio durante la notte a temperatura ambiente). </li><li> Immagine con un microscopio ottico. Utilizzare una lente 5x o 10x per trovare una buona sezione e quindi passare a una lente 63x immersione in olio per l&#39;analisi dettagliata e fotografare. Noi di solito utilizzare le impostazioni di contrasto di fase, campo scuro ma l&#39;ottica funziona altrettanto bene. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Il più delle volte, gli occhi sono incorporate in plastica per una dettagliata analisi dei fenotipi esterno dell&#39;occhio rough rilevato come parte di uno screening genetico o in fase di test interazioni genetiche con geni noti per influenzare sia la struttura generale degli occhi o polarità. Risultati tipici di sezioni occhio sono mostrati in Figura 3. Wild-type ommatidi (Fig. 3A) mostrano la serie completa dei fotorecettori circondata da un reticolo di cellule del pigmento. Al contrario, in un strabismo (stbm, alias van gogh-7) mutante, la polarità ommatidial si perde e, anche se il complemento fotorecettore completo è presente, la rotazione e la chiralità sono randomizzati (Fig. 3B). Inoltre, poiché l&#39;allele stbm è stato sezionato in aw - sfondo, i granuli di pigmento sono mancanti in fig. 3B. Figura 3C mostra un esempio di analisi clonale. Drosophila Rho-chinasi (drok) è necessario per la rotazione ommatidial nonché per l&#39;integrità strutturale dell&#39;occhio 8. Omozigote drok 2 cloni possono essere identificate per l&#39;assenza di pigmento nelle cellule del pigmento e la rhabdomeres (tipicamente, i cloni sono indotte usando senza occhi-FLP e un P-elemento con un gene marcatore fortemente espresso bianco a complemento di w sfondo - mutazione allo stato brado tipo e tessuto eterozigote). E &#39;così possibile identificare le aree mutante dalla mancanza di pigmento. A causa della cellula-autonomia della pigmentazione nel gruppo R-ceLLS accennato in precedenza, genotipi dei singoli R-cellule possono essere determinato (vedi punte di freccia in fig. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Drosophila L&#39;occhio è un sistema eccellente modello per i biologi in quanto, in contrasto con la superficie liscia di una wild-type occhio (A), la superficie di un occhio mutante esternamente è spesso approssimativa (B), indicativo di fenotipi occhio sottostante . In tutte le figure, è anteriore a sinistra e dorsale è alto. Immagini gentilmente concesse da Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Luce immagini microscopiche dei singoli ommatidi sezionato con il metodo descritto. Solo sette R-cellule sono visibili in un momento per ommatidium, dal momento che R7 si trova in cima R8. (A, A &#39;) A livello R7, il corpo cellulare di R7 viene rilevato tra R1 e R6 (freccia gialla in A&#39;). Al contrario, a livello R8 (B), il corpo cellulare di R8 si rileva tra R1 e R2 (freccia gialla in B &#39;). Punte di freccia blu segnano i granuli di pigmento che può essere usato come una cellula-autonomo marcatore pigmento. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Sezioni tangenziale attraverso wild-type (A), stbm (B) e drok (C) mutanti adulti occhi di Drosophila. Schemi sotto le sezioni indicano la polarità di ommatidi (vedi (A) per le frecce). Cerchi rappresentano ommatidi con difetti nel complemento di fotorecettori. Linee gialle rappresentano la linea dorsale / ventrale di simmetria (equatore). In contrasto con la ben orientata ommatidi di wild-type (A), l&#39;organizzazione planare si perde nella mutante stbm (B). Si noti che la sezione del mutante stbm mostrato manca di pigmento per la sua w - sfondo mutante. (C) Perché drok mutazioni sono letali, devono essere analizzate in cloni. Così, le cellule pigmentate sono wild-type o eterozigoti (riempito punte di freccia blu), mentre la R-cellule del pigmento manca (aperto punte di freccia blu) sono omozigoti mutanti. Oltre a difetti di rotazione, i mutanti drok mostrano anche difetti strutturali compresi i numeri mancanti o in eccesso di R-cellule. Si noti che per l&#39;analisi clonale, le sezioni non sono macchiate di evitare oscurando i granuli di pigmento.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando Drosophila come organismo modello, schermi genetica ha portato all&#39;identificazione di molti dei membri fondatori di famiglie di geni essenziali per la maggior parte delle vie di segnalazione altamente conservata in eucarioti superiori inclusi gli esseri umani. Dal momento che, in condizioni di laboratorio, un occhio funzionale è dispensabile per la sopravvivenza, l&#39;occhio è un tessuto particolarmente adatto per la scoperta delle funzioni nuovo gene e la valutazione delle reti genetiche. Analisi ultrastrutturale dell&#39;occhio volo usando il metodo descritto così portato a scoperte fondamentali rilevanti per lo sviluppo e la malattia. Inizialmente, l&#39;analisi singola cellula clonale è stata effettuata utilizzando raggi X cloni indotti combinato con nota strettamente associata marcatori recessiva cellule autonome. Più recentemente, la disponibilità del FLP / FRT sistema per generare cloni ha notevolmente facilitato l&#39;analisi fenotipica delle mutazioni letali nelle sezioni occhi 6,9. Analisi delle sezioni occhio non è limitato alle sezioni tangenziali descritto qui. Se lo si desidera, le teste possono essere allineati in qualsiasi orientamento negli stampi e le sezioni trasversali possono essere ottenuti per studiare strati più profondi nella testa, come la lamina e midollo. Il protocollo qui descritto è quindi un metodo versatile per l&#39;analisi delle strutture oculari e della testa Drosophila adulti.

Attrezzature generiche: <ul><li> Per l&#39;allevamento volare generale vedi 10 </li><li> Dissezione microscopio standard (ad esempio Nikon SMZ-645 Zoom Stereo Microscope), con una sorgente di luce ad anello per evitare che un&#39;ombra delle tue mani. </li><li> CO 2 pad Fly, coperto con carta Whatman 3MM per fornire una protezione contro lo sporco durante la dissezione. </li><li> Gelatina vetrini rivestiti: sciogliere 10 g di gelatina e 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O in acqua 1L su una piastra di riscaldamento (portare quasi a ebollizione, dura circa 2 ore). Immergere i vetrini ben lavati (sapone) e risciacquati (dH 2 O) in porta in soluzione di gelatina e asciugare coperti con un foglio di notte. </li><li> Forno di riscaldamento (70 ° C; forni a vuoto vecchi che sono stati utilizzati per l&#39;asciugatura del filtro di nitrocellulosa sono adatte per questo scopo). </li><li> Capace di sezionamento ultrasottili (0.5-1 sezioni micron di spessore) microtomo, ad esempio quelli utilizzati dalle strutture di microscopia elettronica. Usiamo un Sorvall MT5000 Ultramicrotomo con un coltello di diamante di qualità Histo. Coltelli di vetro anche di lavoro. </li></ul> Fissazione soluzioni: <ul><li> Preparare una soluzione madre di 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,2. </li><li> Preparare il 2% glutaraldeide in tampone di fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2 (può essere conservato a 4 ° C per 4 settimane). Fare almeno abbastanza per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare. Tenere su ghiaccio. </li><li> Osmio soluzione: 2 OsO 4% in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2. Fare solo quanto basta per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare, dal momento che la soluzione non può essere memorizzato. Tenere su ghiaccio. </li></ul> E glutaraldeide OsO 4 sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura in una cappa ben ventilata. Utilizzare puntali con filtro quando si maneggia OsO 4 per evitare l&#39;annerimento della vostra pipetta. Disidratazione: Fai 30%, 50%, 70%, (80%), il 90%, e le soluzioni di etanolo al 100%. Preferibilmente fresco 30%, 50%, 70% di etanolo sul ghiaccio prima dell&#39;uso. Soluzione colorante: 1% toluidina-blu 1% borace. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Morbido </th><th> Difficile </th></tr><tr><td> Una resina </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Indurente B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Acceleratore C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plastificante D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Resina preparazione Per preparare la resina, con attenzione, ma mescolare bene tutti gli ingredienti in un bicchiere di plastica con un agitatore magnetico con ancoretta di grandi dimensioni. Evitare bolle. Dopo la miscelazione, aliquota in fiale di scintillazione standard o contenitori simili e congelare a -20 ° C. Usa resina morbida per tutte le applicazioni meno che il vostro impianto di EM chiede la formulazione più dura. Usare i guanti per maneggiare resina (cancerogeno nella sua forma non polimerizzato). Per polimerizzare resina su attrezzature e rifiuti, cuocere in forno a 70 ° C durante la notte. Rifiuti può quindi essere tranquillamente eliminate e attrezzature pulito e riutilizzato. Versato in resina non polimerizzato può essere pulito con isopropanolo. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Fornitore </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Fly Pad </td><td> ad esempio Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> Pescatore </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Maniglie bisturi, per # 3 </td><td> Pescatore </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Lame di bisturi # 11 </td><td> Pescatore </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> Trasferimento di pipette </td><td> Pescatore </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM resina </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Acciaio ago dissezione </td><td> Pescatore </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> Beem stampo embedding piatto </td><td> Microscopia Elettronica Fantascienza. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Lame di rasoio Teflon </td><td> Microscopia Elettronica Fantascienza. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-tip (tamponi sterili) </td><td> Pescatore </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Pescatore </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Coprioggetto n. 1, 22x60 millimetri </td><td> Pescatore </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescatore </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodecaidrato </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Diamante Histo coltello, 6mm </td><td> Diatome Stati Uniti </td><td> 60-La sua </td></tr><tr><td> Blu toluidina O </td><td> Pescatore </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Borace (Na-tetraborato) </td><td> Pescatore </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX montaggio medio </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Materiale

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila è stato a lungo utilizzato come sistema modello per studiare lo sviluppo, principalmente a causa della facilità con cui è geneticamente trattabili. Nel corso degli anni, una pletora di ceppi mutanti e trucchi tecnici sono stati sviluppati per permettere domande sofisticate per essere chiesto e ha risposto in un ragionevole lasso di tempo. Intuizione fondamentale nella interazione dei componenti di tutte le note principali vie di segnalazione sono state ottenute in avanti e indietro studi di genetica della Drosophila. L&#39;occhio vola ha dimostrato di essere particolarmente adatto per l&#39;analisi mutazionale, dal momento che, in condizioni di laboratorio, le mosche possono sopravvivere senza gli occhi funzionali. Inoltre, la superficie degli occhi degli insetti è composto da circa 800 occhi singola unità (faccette o ommatidi) che formano una regolare, liscia, visto sotto un microscopio da dissezione. Così, è facile vedere se una mutazione potrebbe influenzare lo sviluppo degli occhi o la crescita di esternamente alla ricerca per la perdita della superficie liscia (fenotipo &#39;occhio grezzi&#39;; Fig. 1.) O la dimensione complessiva degli occhi, rispettivamente (per gli esempi di schermi basati su morfologia occhio esterno si veda ad esempio 1). Successive analisi dettagliate dei fenotipi occhio richiedono fissazione, di inclusione e sottile sezionamento degli occhi adulti. L&#39;occhio di Drosophila sviluppa dal cosiddetto disco occhio immaginale, un sacco di cellule epiteliali che proliferano e si differenziano durante le fasi larvali e pupa (per una rassegna si veda ad esempio 2). Ogni ommatidium costituito da 20 celle, tra cui otto fotorecettori (PR o R-cellule;. Fig. 2), quattro lenti che secernono coni, le cellule del pigmento (&#39;esagono&#39; intorno a R-cell cluster) e una setola. I fotorecettori di ogni ommatidium, più facilmente identificati dai loro organelli sensibile alla luce, la rhabdomeres, sono organizzati in un trapezio formato da sei &quot;esterno&quot; (R1-6) e due &quot;interiore&quot; fotorecettori (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] è sotto R7 e quindi visto solo nelle sezioni da zone più profonde degli occhi). Il trapezio di ogni sfaccettatura è proprio in linea con quelli dei suoi vicini e gli assi antero-posteriore e dorsoventrale complessivo dell&#39;occhio (Fig. 3A). In particolare, il ommatidi della dorsale e ventrale (frecce nere e rosso, rispettivamente) metà degli occhi sono immagini speculari l&#39;uno dell&#39;altro e corrispondono a due forme chirali stabilito durante la segnalazione di polarità planare delle cellule (per una rassegna si veda ad esempio 3). Il metodo per generare semi-sottili sezioni occhio (come quelli presentati in fig. 3) descritto qui è leggermente modificato rispetto a quello originariamente descritto da Tomlinson e Ready 4. Consente l&#39;analisi morfologica di tutte le cellule tranne le cellule cono trasparente. Inoltre, il pigmento di R-cellule (punte di freccia blu in fig. 2 e 3) può essere usato come una cellula-autonomo marcatore per il genotipo di un R-cell, i requisiti così genetica dei geni in un sottogruppo di R-cellule possono essere facilmente determinata 5,6.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Un approccio standard per la preparazione degli adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli occhi semi-sottile e leggero sezionamento analisi microscopica è presentato qui. Il protocollo può essere utilizzato per lordo analisi morfologica di difetti dell&#39;occhio, o con le modifiche indicate possono essere utilizzati per determinare i requisiti genetica dei geni in tipi cellulari specifici degli occhi (ad esempio l&#39;analisi clonale dei fotorecettori) o per analisi al microscopio elettronico.

Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

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JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.0K Views.  Albert Einstein College of Medicine. Un approccio standard per la preparazione degli adulti Drosophila Gli occhi semi-sottile e leggero sezionamento analisi microscopica è presentato qui. Il protocollo può essere utilizzato per lordo analisi morfologica di difetti dell'occhio, o con le modifiche indicate possono essere utilizzati per determinare i requisiti genetica dei geni in tipi cellulari specifici degli occhi (ad esempio l'analisi clonale dei fotorecettori) o per analisi al micr...

Video: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sezionamento sottile fetta di preparativi per immunoistochimica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Ricerca

Biologia

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Monitoraggio ad alta risoluzione video di locomozione per adulti in Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissezione di giro dentato ippocampale di topo adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparazione del Drosophila Cellule S2 per la microscopia ottica

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Creazione automatica di grafici dello spazio visivo degli occhi composti di Housefly

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Valutazione della tossicità chimica nella Drosophila melanogaster adulta

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...