Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health di Grant GM086822. Gli autori desiderano ringraziare Drs. Alec Pakhomov &amp; Paul Wallace (Univ. di Funzione utente Nanotechnology di Washington (NTUF)) e Andrea Slade (Bruker AXS) per la loro assistenza tecnico esperto. DNA imaging AFM è stato condotto presso l&#39;Univ. NTUF di Washington, membro della Rete Nazionale Infrastrutture Nanotechnology. Il 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmide è stato gentilmente fornito dal laboratorio del Dr. Keith Yamamoto (Univ. of California, San Francisco).

1. Preparazione di campioni di DNA e proteine ​​per essere ripreso privo di contaminanti <ol><li> Isolare biomolecole di essere ripreso e posto in un buffer adatto acquosa. Le proteine ​​per essere ripreso possono essere purificati mediante cromatografia liquida 6, immunoadsorbimento seguita da rimozione di anticorpi e pellet 1,2, o purificazione Profinity eXact e la rimozione tag 7 (Figura 2A). Isolare molecole di DNA ad essere ripreso dalla purificazione miniprep (Figura 2B). </li><li> Confermare la composizione e la purezza dei campioni di proteine ​​da acquisire mediante SDS-PAGE e Western blotting. Per il DNA, conferma la sequenza e la purezza completando una restrizione digerire ed elettroforesi su gel di agarosio. </li><li> Incubare i campioni in un buffer di adsorbimento AFM per promuovere l&#39;adesione del campione di mica. Per i campioni di proteine, 10 mM tampone HEPES possono essere utilizzati. Ulteriori bassa forza ionica sali o altri cofattori possono essere aggiunti pure. Per i campioni di DNA, includere un catione bivalente (es. Mg 2 + o Ni 2 +) per promuovere l&#39;adsorbimento al substrato di mica. Un Mg 2 + adatto contenente tampone per il DNA è di 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 3. Un&#39;alternativa Ni 2 + tampone è di 10 HEPES mM, pH 6,8, 10 mM NiCl 2. </li><li> Diluire il campione ad una concentrazione di 5 mg / ml in tampone di adsorbimento. Mescolare delicatamente. Memorizzare sul ghiaccio mentre il microscopio è in preparazione. </li></ol> 2. Montaggio della sonda AFM <ol><li> Mettere il liquido titolare sonda cella sul corrispondente docking station per l&#39;installazione a sbalzo. </li><li> Individuare il lungo, sbalzo di spessore (di seguito cantilever la &#39;B&#39;) della forte leva di nitruro (BN) sonda da utilizzare per l&#39;imaging. Con attenzione trasferirlo al titolare liquido sonda cella, assicurando che la punta rimane in posizione eretta. Nota tecnica: la cura estrema deve essere pagato mentre la sonda è in transito, come cadere da qualsiasi altezza può danneggiare o distruggere la cantilever o la punta. Un microlever SNL (MSNL) sonda può essere utilizzata come alternativa alla sonda SNL. </li><li> Rimuovere il supporto della sonda dalla docking station ed esaminare le sbalzo sotto un microscopio ottico per assicurarsi che sia integro e correttamente nel supporto liquido sonda cella. </li><li> Rimuovere con attenzione la testa AFM dal gruppo di coda di rondine strumento stringendo la vite di fissaggio testa zigrinata. Nota tecnica: la cura estrema deve essere pagato mentre manipolando la testa AFM, farlo cadere anche da una breve distanza (ad esempio se non inserita correttamente nel montaggio a coda di rondine) possa arrecare danni sostanziali. </li><li> Invertire la testa AFM e premere con forza il liquido titolare sonda cella sui quattro perni alla base della testa AFM. Cura restituire la testa AFM nel gruppo strumento a coda di rondine. Rilasciare la vite di serraggio testa zigrinata per fissare la testa AFM nello strumento. </li></ol> 3. Individuazione punta a sbalzo, allineamento laser, e regolando fotorilevatore <ol><li> Utilizzando il software dello strumento AFM, individuare la punta sbalzo muovendo le manopole del microscopio ottico a bordo. Regolare l&#39;illuminazione del microscopio, se necessario, per migliorare l&#39;identificazione punta. Portare la fine della punta a sbalzo in prossimità del mirino visualizzato sul software dello strumento. </li><li> Tenga la punta del cantilever a fuoco regolando le frecce su e giù del regolatore ottica sul software. Usa lento (S) o media (M) velocità durante la regolazione delle ottiche. </li><li> Allineare il laser per la punta a sbalzo utilizzando le manopole di regolazione laser. Spostare le manopole di regolazione fino a quando il punto laser rosso si trova all&#39;interno della macchia illuminazione bianca. Traccia lungo il braccio a sbalzo con un percorso a zig-zag fino a quando il laser è posizionato sulla punta cantilever. Se correttamente allineata, un punto forte riflessione apparirà nella finestra anteriore della testa AFM. </li><li> Centrare il fotorilevatore regolando le manopole fotorilevatore sulla testa AFM. Questo allineare il punto laser nel mirino del display fotodetettore del software dello strumento. La somma segnale osservato dovrebbe essere di circa 4-6. </li></ol> 4. Posizionamento testa AFM e messa a punto a sbalzo <ol><li> Posizionare un foglio appena spaccati di mica attaccato ad un disco metallico campione AFM sul titolare del campione magnetizzato in cima al portatarga AFM. Questa configurazione verrà utilizzato per posizionare la testina di imaging AFM prima il campione di DNA o proteine ​​preparata nella fase 1. <ol><li> Nota tecnica: il titolare del campione magnetizzato e liquido titolare sonda cella sono più spessi di altro campione di fissaggio meccanismi e titolari sonda. Se non vi è attualmente insufficiente spazio tra il mica-campione di assemblaggio titolare e la testa AFM, muovere la testa AFM fino selezionando l&#39;icona ritirare il software dello strumento più volte. </li></ol></li><li> Ruotare la piastra di supporto AFM in modo che il disco di preparato è posizionato per l&#39;immagine iniziale. Assicurarsi che il substrato mica è centrata sotto la testa AFM. </li><li> Spostare la testina di AFM verso ilsuperficie del campione mica disco utilizzando la superficie di controllo focus del software dello strumento. Selezionare il (M), velocità media del motore Z, e proseguire verso la superficie fino a quando la testa AFM è di circa 2 mm sopra la mica. A questo punto, passare ad usare il lento (S) Z velocità del motore al fine di evitare il contatto improvviso tra la sonda e la superficie (di seguito crash punta). </li><li> Procedere per spostare la sonda più vicino alla superficie del substrato mica fino caratteristiche distinte sulla superficie mica o il riflesso punta sono a fuoco. Alterna tra la superficie e aerei riflessione punta focale utilizzando il &quot;Focus on:&quot; icona dal software dello strumento. </li><li> Selezionare l&#39;icona melodia dal software dello strumento e sintonizzare il cantilever. La frequenza di risonanza della BN raccomandata e le sonde a sbalzo MSNL è 20-60 kHz. Selezionare un picco del 5% di offset. Nota tecnica: messa a punto a sbalzo adeguata è essenziale per l&#39;imaging campione adeguato. </li></ol> 5. Imaging mica superficie del campione <ol><li> Inserire la sonda sulla superficie di mica. Imposta la dimensione iniziale di scansione a 10 micron e velocità di scansione a 1 Hz. Guadagno integrale e guadagno proporzionale può essere inizialmente impostata a 0,2 e 0,4, rispettivamente. Regolare guadagni come necessario per avere scansioni di rintracciare e ripercorrere circa sovrappongono. Diminuire il setpoint ampiezza aumenterà l&#39;interazione tra la sonda e la mica e garantire l&#39;impegno. </li><li> Catturare immagini scansione completa del campo 10 micron. Diminuire dimensioni di scansione a 5, 1 e 0,5 micron e catturare immagini complete di ogni campo. Regolare gli utili e le velocità di scansione, se necessario. Catturare le immagini della superficie mica fornisce una base di riferimento per il confronto con il DNA e proteine ​​contenenti campioni. </li><li> Sganciare la sonda con un semplice clic sul disimpegno icona sul software dello strumento. </li></ol> 6. Biomolecole Imaging di interesse <ol><li> Mescolare delicatamente il campione di DNA o delle proteine ​​preparata nella fase 1 e si preparano a caricarlo sulla superficie mica immagine. Mescolare 5 ml di campione preparato con 45 ml di tampone fresco adsorbimento (concentrazione del campione finale = 0,5 mg / ml). </li><li> Aggiungere con cautela 50 microlitri della mg 0,5 / ml di biomolecole contenenti soluzione direttamente sulla superficie di mica. Fate questo senza muovere la testa o la sonda AFM, e garantire la soluzione del campione (ma non punta della pipetta) entra in contatto con la sonda. </li><li> Pausa di 5 minuti per consentire le biomolecole nel campione di aderire alla superficie mica. </li><li> A conclusione di 5 minuti, pipetta un ulteriore 5-10 ml di buffer di adsorbimento nel supporto liquido sonda cella facendo attenzione a non toccare la sonda, testa AFM, mica o con la punta della pipetta. Questo formerà un menisco e consentire l&#39;imaging AFM toccando in modo fluido. Figura 3 mostra la disposizione finale della cella fluido, a sbalzo, campione, portacampioni, e menisco. </li><li> Regolare la cellula fotoelettrica e riallineare il laser per il cantilever, se necessario. Nota tecnica: la visualizzazione della punta della sonda e di allineamento laser è complicato a causa del modello di diffrazione causati con l&#39;aggiunta di buffer di campione nel supporto sonda. Risintonizzare manualmente il cantilever, se necessario. </li><li> Coinvolgere nuovamente la sonda utilizzando il software dello strumento. Regolare deflessione verticale, guadagno integrale, proporzionale e guadagno, se necessario. Questo inizierà il processo di re-imaging sezione di mica acquisiti immediatamente prima di assaggiare l&#39;aggiunta e la cattura delle immagini. </li><li> Aumentare la dimensione di scansione (500 nm-10 micron) per identificare le regioni di interesse. Zoom-in e ridurre i tassi di scansione a 0,5 Hz per migliorare la risoluzione delle immagini </li><li> Una volta che l&#39;imaging è completo, liberare la sonda selezionando ritirare icona sul software dello strumento più volte. Garantire uno spazio sufficiente tra la testa AFM e disco di preparato prima di smontare la cella di liquidi o disco di preparato. </li><li> Sciacquare il liquido titolare sonda cella e disco di preparato con acqua distillata per evitare la formazione di cristalli di sale come residuo evapora buffer di adsorbimento. Asciugare con aria compressa. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Esempi di immagini AFM sono presentati nella Figura 4. Mica substrato (A) fornisce una superficie piatta sulla quale molecolare del DNA e le proteine ​​possono assorbire. Imaging mica prima di campioni biomolecole fornisce un controllo negativo e valutazione del rumore di imaging. Fornisce anche un livello di garanzia che il cantilever è correttamente sintonizzato e immagini campione successive avrà successo. DNA a doppia elica plasmide (B, D), presuntivamente superavvolto, è facilmente identificato dal suo aspetto asimmetrico e uniforme deposito sul supporto precedentemente mica irrilevante. Complessi proteici di dimensioni delle particelle discrete (C, E) sono univocamente distinguibili dal substrato di mica. Differenze di dimensione delle particelle indicano l&#39;eterogeneità del campione, e può essere utile, per ravvicinare stechiometria complesso proteico o attività biochimica. La forma generale diagonale e l&#39;orientamento costante della proparticelle di proteina osservata nel Panel C è un artefatto di imaging, come sarebbe da aspettarsi che le proteine ​​essere orientato sul supporto mica in modo casuale. Possibili cause del manufatto osservato è una punta di anormalità fisica o AFM imaging troppo rapida di una velocità di scansione. Mentre convoluzione punta (illustrato in Figura 1B) impedisce in assoluto calcoli misurazione della lunghezza del assi X e Y, la misurazione dell&#39;altezza (asse Z) e x y relativo e le misurazioni possono essere comunque utili per stimare le proprietà biofisiche delle biomolecole immagine. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1: Rappresentazione schematica della toccando microscopia a forza atomica in modalità (AFM). A, il microscopio. Alla fine del cantilever è una punta acuminata che oscilla su e giù come la scansione sulla superficie di un substrato di mica a cui biomolecolari adsorbire complessi. Come lo scanner si muove nelle direzioni x e y, un raggio laser viene riflesso dal retro del cantilever su un rivelatore sensibile alla posizione fotodiodo di mappare la verticale (z) la distanza della punta si muove al passaggio sopra i complessi biomolecolari seduto sul mica. Distorsione B. dell&#39;immagine nelle direzioni x ed y causati da convoluzione punta. Il raggio nominale di una punta convenzionale di nitruro di silicio è più grande delle particelle di essere ripreso, e il bordo dei contatti punta il campione mentre viaggia in superficie. Convoluzione risultati punta nelle particelle immaginato che appaiono più grandi della direzioni X e Y, ma non la direzione z.. Questo effetto può essere minimizzato con l&#39;uso di punte con un raggio minore punta nominale. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2: Illustrazione di proteine ​​immunoadsorbed e preparazione del campione di DNA. A, rilascio di GR immunoadsorbed • complesso proteico hsp70 dal anticorpi monoclonali (mAb)-proteina A-Sepharose (PAS) pellet. Incubando la immunopellet con un peptide contenente l&#39;epitopo mAb faciliterà il rilascio del GR complesso proteico • hsp70 dal pellet, che consente il complesso da ritirare presso il surnatante e visualizzati da AFM. B, Preparazione del DNA per l&#39;imaging AFM richiede l&#39;uso di un buffer di adsorbimento di cationi bivalenti. Il catione bivalente aumenta l&#39;affinità del DNA per il substrato di mica. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3: sistemazione finale della testa AFM, liquido titolare sonda cella, campione, portacampioni, e menisco del buffer. A, deve prestare attenzione al momento del deposito del campione e del buffer aggiuntivo sul substrato di mica per evitare il contatto fisico tra la punta della pipetta e la testa AFM, chiamata liquido, e il substrato di mica. B, ingrandimento di A. Il menisco tampone spazia dal disco di preparato al titolare liquido sonda cella. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4: microscopio a forza atomica di substrato di mica (A), 2xGal4-2xGRE-luciferease plasmide DNA 8 (B, D), e GR • complessi proteici hsp70 (C, E) in soluzione tamponata. Mica serve come immagine di controllo da confrontare con le visualizzazioni di DNA e proteine. GR complessi proteici • hsp70 sono stati preparati da immunoadsorbimento di GR vaccinati con hsp70 e poi rilasciato dalla anticorpi tallone pellet utilizzando un anticorpo monoclonale concorrenti (illustrato in Figura 2A). Il DNA è stato preparato da convenzionale miniprep plasmide. Pannelli A, B e C sono di un ingrandimento equivalente (bar scala = 200 nm), così come i pannelli D ed E (barre di scala = 40 nm).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

AFM fornisce una tecnica microscopica unico in grado di immagini singole biomolecole rivestito in soluzioni tampone acquose e quasi fisiologico in tempo reale. Questo permette la visualizzazione delle singole proteine ​​e molecole di DNA, così come complessi multiproteici e proteina-DNA complessi. Macromolecolari particelle di imaging con AFM può essere utile per valutare l&#39;omogeneità del campione e per identificare la disposizione fisica dei componenti costituenti delle particelle osservate. Questo approccio di osservare particelle macromolecolari individuo può essere un utile complemento alle tradizionali tecniche biochimiche, come ad esempio test immunoprecipitazione, elettroforesi su gel di poliacrilamide, ed esclusione cromatografia dimensioni delle colonne, che forniscono dati significativi sommativa che rappresenta il 10 3 -10 11 complessi biomolecolari individuali di interesse attuale in un campione. La ricerca sulla stechiometria multiproteici complesse, interazioni biomolecolari, e le esigenze cofattore possono essere indagati con AFM. Il metodo presentato qui possono essere adattate a specifiche questioni di interesse biofisico. Ad esempio, utilizzando un liquido titolare sonda cella in grado di scambiare tampone, è possibile cofattore requisiti test per la formazione delle proteine ​​complesse. DNA-proteine ​​gruppi possono essere formati e dissociato in near-real-time e anche mentre sta creando l&#39;immagine. DNA può essere generato con sequenze specifiche di interesse (ad esempio una risposta di elementi presuntivi o di proteine ​​sequenza romanzo vincolante), mescolato con la proteina ipotizzato vincolante, e ripreso a fornire una prova diretta di interazioni intermolecolari. Toccando la modalità di imaging AFM è sostanzialmente meno complicato se i campioni a secco sono utilizzati piuttosto che campioni in soluzioni acquose, e stand DNA lineare e chiuso cerchio plasmidi di DNA sono stati entrambi ripreso in questo modo 3,9. Il metodo qui presentato utilizza campioni in soluzioni tampone al fine di fornire un ambiente di imaging più fisiologico. Altri metodi degni di nota di proteine ​​di imaging dovrebbero essere considerati, tra cui microscopia a campo vicino infrarosso 10. L&#39;uso complementare di immunoadsorbimento in consorte con AFM offre l&#39;opportunità di preparare una miriade di complessi proteici, utilizzando consolidate tecniche biochimiche, e la loro successiva visualizzazione dopo la liberazione dal immunoadsorbing anticorpi tallone pellet. Per esempio, GR immunoadsorbed è stato testato per la sua associazione con la proteina chaperone molecolare hsp70 1 così come la proteina dineina motore 2 utilizzando questo approccio per valutare dimensioni complesse e stechiometrie. Dimensione delle particelle e le caratteristiche biofisiche (rigidità ad esempio) sono stati utili per accertare l&#39;identità delle biomolecole osservati in campioni di AFM fotografato 11,12. E &#39;anche possibile confermare l&#39;identità biomolecola con l&#39;aggiunta di una biomolecola interagenti (ad esempio, un ligando o anticorpi monoclonali), che si legano al suo obiettivo e provocare un aumento delle dimensioni delle particelle se la biomolecola bersaglio è presente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> Fluido dimensione cella </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> Nitruro di leva Sharp (BN) in nitruro di silicio sonda AFM </td><td> Bruker </td><td> BN-10 </td></tr><tr><td> Microlever forte nitruro di leva (MSNL) nitruro di silicio sonda AFM </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> Nanoscope AFM strumento software </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> Metallo AFM campione dischi </td><td> Ted Pella </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> Grado V1 Dischi Mica, 12 mm </td><td> Ted Pella </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

Microscopia a forza atomica (AFM) permette la visualizzazione delle singole proteine, molecole di DNA, proteina-proteina complessi, proteine ​​e DNA-complessi. Sulla fine del cantilever del microscopio è una nano-scala della sonda, che attraversa aree dell&#39;immagine che vanno da nanometri a micrometri, misurando l&#39;elevazione delle macromolecole appoggiata sulla superficie del substrato in un qualsiasi punto. Forze elettrostatiche causa proteine, lipidi e acidi nucleici per fissare liberamente al substrato in orientamenti casuali e permesso di imaging. I dati generati assomigliare ad una mappa topografica, in cui le macromolecole come risolvere tridimensionale particelle di dimensioni discrete (Figura 1) 1,2. Toccando modalità AFM prevede l&#39;oscillazione ripetuta del cantilever, che permette l&#39;imaging di biomateriali relativamente morbido come il DNA e le proteine. Uno dei vantaggi notevoli di AFM rispetto ad altre tecniche di microscopia su scala nanometrica è la sua adattabilità rispetto di visualizzare singole proteine ​​e complessi macromolecolari nei buffer acquosi, comprese le condizioni tamponata quasi fisiologico, in tempo reale, e senza macchie o rivestimento del campione da acquisire. Il metodo presentato qui descrive l&#39;immagine del DNA e un fattore di trascrizione immunoadsorbed (cioè il recettore dei glucocorticoidi, GR) in soluzione tamponata (Figura 2). Immunoadsorbed proteine ​​e complessi proteici possono essere separati dalla immunoadsorbing anticorpo-tallone pellet dalla concorrenza con l&#39;epitopo anticorpale e poi ripreso (Figura 2A). Questo permette la manipolazione biochimica del biomolecole di interesse prima di imaging. Una volta purificate, il DNA e le proteine ​​possono essere mescolati e il complesso interagire risultante può essere immaginato come bene. Legame del DNA per mica richiede un catione bivalente 3, come Ni 2 + o Mg 2 +, che può essere aggiunto al buffer campione ancora mantenere l&#39;attività della proteina. Utilizzando un approccio simile, AFM è stato utilizzato per visualizzare i singoli enzimi, tra cui la RNA polimerasi 4 e un enzima riparatore del 5, destinato a singoli filamenti di DNA. Questi esperimenti forniscono una visione significativa nella proteina-proteina e DNA-proteina interazioni biofisiche che si svolgono a livello molecolare. Particelle macromolecolari Imaging individuale con AFM può essere utile per determinare omogeneità delle particelle e per identificare la disposizione fisica dei componenti costituenti delle particelle immagine. Mentre l&#39;attuale metodo è stato sviluppato per la visualizzazione di GR-chaperone complessi proteici e 1,2 DNA filoni a cui la GR può legare, può essere attuata in modo ampio al DNA di imaging e campioni di proteine ​​da una varietà di fonti.

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l&#39;imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

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22.3K Views.  Seattle University. Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l'imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

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Bioingegneria

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualizzazione di Cortex Organizzazione e Dynamics in microrganismi, utilizzando Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novel microscopia a forza atomica Based biopanning per isolamento di Morfologia reagenti specifici contro TDP-43 varianti di Sclerosi Laterale Amiotrofica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomic Force Microscopy Imaging e Spettroscopia Forza supportati doppi strati lipidici

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Applicazione della microscopia a forza atomica per rilevare l'osteoartrite precoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...