Questo lavoro è stato finanziato dalla Wellcome Trust.

Prima di qualsiasi studio può essere condotto su approvazione etica bambini &#39;e informato consenso scritto dei genitori deve essere cercato. In questo studio l&#39;approvazione etica è stata ottenuta dalla University College Hospital Comitato Etico e consenso informato scritto dei genitori è stato ottenuto prima di ogni procedura. Questo studio è conforme agli standard stabiliti dalla Dichiarazione di Helsinki e Good Clinical Practice Guidelines. 1. La raccolta dei dati - Impostazione <ol><li> Posizionare un minimo di 16 singoli usa e getta EEG Ag / AgCl elettrodi a ventosa sulla testa del neonato dopo la pelle durante la preparazione secondo il sistema 10-20 posizionamento degli elettrodi (Figura 1A). Una copertura più completa può essere raggiunto utilizzando un tappo EEG con elettrodi incorporati. L&#39;utilizzo di un cappuccio EEG rende il processo più veloce e meno dirompente, in particolare per quanto elettrodi sono preparati con gel induttivo prima di mettere il cappello sulla testa. L&#39;applicazione di elettrodi monouso EEG richiedepiù tempo e abilità, ma in genere si traduce in una registrazione migliore. Considerare la riduzione del numero di elettrodi se l&#39;accesso al neonato è limitata, ma utilizzare sempre elettrodi della linea mediana (Cz, CPZ e FCZ). Utilizzare FCZ come elettrodo di riferimento per la registrazione. </li><li> Utilizzare pasta conduttiva EEG per ottimizzare elettrodo / pelle accoppiamento elettrico. </li><li> Inserire un rete elastica sulla elettrodi per tenerli in luogo. </li><li> Legare l&#39;elettrodo porta insieme per minimizzare le interferenze elettriche. </li><li> Posizionare un elettrodo di terra sul petto o la testa. </li><li> Posizionare gli elettrodi EMG al bicipite femorale di entrambe le gambe dopo la pelle durante la preparazione (Figura 1B). </li><li> Per registrare ECG attività luogo piombo 1 elettrodi ECG sul corpo dopo la pelle durante la preparazione (un elettrodo sul lato sinistro del torace, uno a destra e utilizzare l&#39;elettrodo stesso terreno come per il EEG). </li><li> Posizionare un trasduttore movimento sull&#39;addome per misurare la respirazione. </li><li> Posizionare una sonda pulsossimetro sul piedeper misurare la saturazione di ossigeno e frequenza cardiaca. Assicurarsi che la sonda è fissato in posizione e che un segnale continuo viene registrato senza interruzioni. La sonda ossimetro ha bisogno di essere immesso sul piede che è controlaterale al piede che si intende stimolare. </li><li> Impostare un treppiede montato videocamera per inquadrare il volto del bambino in modo che i cambiamenti nell&#39;espressione del viso possono essere registrate. </li><li> Collocare un diodo a emissione luminosa (LED) nella cornice della fotocamera. Il LED è legata al circuito di temporizzazione in modo che lampeggia quando la stimolazione è presentato per sincronizzare l&#39;EEG, EMG e registrazione video. </li></ol> 2. La raccolta dei dati - Registrazione <ol><li> Avviare la registrazione video. </li><li> Avviare ossimetria registrazione degli impulsi. </li><li> Avvio EEG / EMG registrazione. </li><li> Attendere che il bambino è risolta. </li><li> Tenere il piede come se si esegue una lancia tallone e contrassegnare manualmente caso le registrazioni EEG ed EMG. Questa epoca sarà utilizzato per identificare una sezione di sfondo del controllo EEGed EMG. </li><li> Applicare la stimolazione tocco battendo leggermente un tappo di gomma che è collegato al braccio di un martello tendine contro la superficie del tacco. Stimolare il piede che non è attaccato al pulsossimetro. Quando il bambino viene stimolato l&#39;EEG / EMG e registrazione video devono essere contrassegnati da eventi al fine di individuare il momento della registrazione, quando la stimolazione ha avuto luogo. La stimolazione tocco può essere segnata da eventi allegando una testa impedenza al martello tendine che collega elettronicamente lo stimolatore per l&#39;apparecchio di controllo. La registrazione video è segnato da eventi il ​​flash LED. Tocca ripetuto può essere applicato e lo stimolo può essere applicato a diverse regioni del corpo, cioè la spalla </li><li> Applicare un non-nocivi stimolazione controllo ruotando la lancetta di 90 gradi e metterla contro il piede in modo che quando la molla viene rilasciata lama non contatto con la pelle. Questo evento può richiedere molto tempo bloccati utilizzando un accelerometro attaccato alla superficie superiore di tsi lancia. L&#39;accelerometro rileva la vibrazione che si verifica quando la lama viene rilasciato. </li><li> Eseguire la lancia tallone clinicamente essenziali in conformità con la pratica clinica nel reparto neonatale. Attendere che l&#39;attività EEG è regolata prima di fare la lancia tallone. Tempo di chiusura della lancia tallone può essere eseguita allo stesso modo come per la stimolazione di controllo. In seguito la lancia tallone, non schiacciare il piede per almeno 30 secondi per garantire che le risposte sono registrate unicamente dovuta alla lancia. </li><li> Garantire che la quantità di sangue viene raccolto e preparare i campioni per analisi cliniche. </li><li> Salvare i dati e fermare tutte le registrazioni. </li><li> Registrare le informazioni demografiche del bambino ei dettagli sperimentali e di ingresso in un database per la memorizzazione sicura e riferimenti futuri. </li><li> Ripetere questa procedura nel campione richieste dei bambini. In questo esempio il numero di neonati = 23. </li></ol> 3. EEG analisi dei dati <ol><li> Creare epoche EEG di 1,7 secondi che corrispondono a ogni stimolo tocco, il controllo e la lancia e lo sfondo EEG. Epoche dovrebbe iniziare 0,6 secondi prima di ogni evento. Il numero di epoche corrispondenti a ciascuna modalità dovrebbe essere lo stesso. </li><li> Baseline correggere le epoche sottraendo il segnale basale e filtro passa-alto li a 0,1 Hz. </li><li> Considerate le epoche registrato CPZ Cz o per ulteriori analisi ed escludere le epoche che sono stati contaminati da artefatti di movimento. Artefatto movimento è definito come una variazione di ampiezza superiore a 50μV in meno di 50ms. </li><li> Allineare le tracce per correggere la latenza jitter tra 50 e 300 ms dopo la stimolazione e Analisi delle Componenti Principali condotta (PCA) in questo intervallo di tempo per identificare il potenziale tattile (cioè l&#39;attività EEG legate alla stimolazione tattile). Considerate le epoche di essere le variabili e il tempo punti di osservazioni. PCA si decompone le epoche EEG in forme d&#39;onda di base, denominato componenti principali (PC) e rappresentano variazione sistematica nella ampiezza del segnale attraverso punti di tempo. </li><li> Eseguire una analisi della varianza (ANOVA) sui pesi di ciascuna delle prime 2 PC per determinare quali PC rappresenta il potenziale tattile. Questo sarà il PC i cui pesi sono risultati significativamente maggiori a seguito di stimolazione tattile rispetto al fondo EEG. </li><li> Allineare le tracce per correggere jitter latenza tra 300 e 700 ms dopo la stimolazione e la condotta PCA in questo intervallo di tempo. </li><li> Eseguire ANOVA sui pesi di ciascuno dei primi 2 PC per determinare quali PC rappresenta la nocicettivo specifico potenziale. Questo sarà il PC i cui pesi sono risultati significativamente maggiori a seguito di stimolazione nociva rispetto alla stimolazione tattile e di fondo EEG. </li></ol> 4. EMG analisi dei dati <ol><li> Calcolare la root-mean-square (RMS) del segnale EMG nei primi stimolazione messaggio 1000 ms per il controllo e stimoli lancia. </li><li> Eseguire un test t dii valori RMS per determinare la nocicettivo specifico ritiro riflesso spinale. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3118/3118fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1 (A) (i) Schema e (ii) la foto del posizionamento degli elettrodi per registrazioni EEG (modificato internazionale 10/20 sistema di collocamento degli elettrodi);. (B) Schema del posizionamento degli elettrodi per le registrazioni EMG sul bicipite femorale . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3118/3118fig2.jpg" /> . Figura 2 (A) Esempi del potenziale sensoriale a Cz evocato attraverso il tatto in 3 lattanti; (B) esempi di nocicettivi specifici potenziali evocati da Cz lancia nocive in 3 bambini. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3118/3118fig3.jpg" /> Figura 3. Dipendenza dei pesi PC in modalità stimolo a Cz (media ± SEM). Il PC ottenuto tra 50-300 ms dopo l&#39;inizio rappresenta un potenziale stimolo tattile e il PC ottenuto tra 300-700 ms dopo l&#39;inizio rappresenta un stimolo nocicettivo specifico potenziale. I PC (linee in grassetto) sono sovrapposti sulle medie grandiottenuti attraverso la stimolazione di tutti i tipi (sfondo EEG, tatto, lancia nocivi) dopo le tracce individuali sono stati allineati nell&#39;intervallo di tempo indicato. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3118/3118fig4.jpg" /> Figura 4. (A) Esempio di attività EMG in un neonato dopo (i) lancia tallone nocive e (ii) tocco del tallone. (B), medio (± SE) EMG root-mean-square attività EMG nei neonati dopo il tallone nocivi e non nocivi stimoli tatto.

<ol>
	<li>Fitzgerald, M., Walker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infant+pain+management:+a+developmental+neurobiological+approach.">Infant pain management: a developmental neurobiological approach.</a> Nat. Clin. Pract. Neurol. 5 (1), 35-35 (2009).</li><li>Slater, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+sucrose+as+an+analgesic+drug+for+procedural+pain+in+newborn+infants:+a+randomised+controlled+trial.">Oral sucrose as an analgesic drug for procedural pain in newborn infants: a randomised controlled trial.</a> Lancet. 376 (9748), 1225-1225 (2010).</li><li>Slater, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evoked+potentials+generated+by+noxious+stimulation+in+the+human+infant+brain.">Evoked potentials generated by noxious stimulation in the human infant brain.</a> Eur. J. Pain. 14 (3), 321-321 (2010).</li><li>Slater, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+infants+display+increased+noxious-evoked+neuronal+activity+in+the+brain+compared+to+healthy+age-matched+term-born+infants.">Premature infants display increased noxious-evoked neuronal activity in the brain compared to healthy age-matched term-born infants.</a> Neuroimage. 52 (2), 583-583 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.

Questo video mostra come le risposte elettrofisiologiche, evocata dalla stimolazione tattile e nocive, possono essere caratterizzati nel neonato umano usando registrazioni EEG ed EMG. Studi di questo tipo vi aiuterà a comprendere lo sviluppo e la plasticità del trattamento del dolore umano, e condurre a una migliore valutazione clinica e trattamento del dolore infantile 1, 2. Il successo di questi esperimenti richiede la stretta collaborazione di un team multidisciplinare. Sono necessarie conoscenze particolari nel campo della neonatologia, neurofisiologia clinica, bioingegneria e di sviluppo delle neuroscienze. E &#39;essenziale che la cura del bambino hanno la priorità più alta quando questi esperimenti sono intraprese. L&#39;infermiera di ricerca o di un medico che esegue la lancia tallone ha la responsabilità per il benessere del bambino e deve garantire che l&#39;esperimento viene fatto in conformità con la pratica clinica. Approvazione da parte del comitato etico dell&#39;ospedale e Written consenso dei genitori sono necessari per intraprendere questi studi. La lancia di tacco è un evento clinico-obbligatorio e non può essere ripetuto a scopo di studio. E &#39;quindi essenziale che la registrazione viene raccolto in modo affidabile e robusto che non interferisce con la pratica clinica 3, 4. In particolare, è fondamentale che il metodo utilizzato per tempo, bloccare la stimolazione è affidabile e non ne ostacolino la raccolta clinico del sangue. Tutte le misure del dolore infantile sono necessariamente indiretti, in quanto tale, è importante accertarsi che l&#39;attività registrata è espressamente evocato dal l&#39;evento dannoso e non anche per altri aspetti della cura del bambino 2. Ciò può essere ottenuto attraverso un&#39;attenta progettazione tecnica e post-processing dei dati.

electrophysiological measurements and analysis of nociception in human infants

Il dolore è una spiacevole esperienza sensoriale ed emotiva. Dal momento che i neonati non possono segnalare verbalmente le loro esperienze, gli attuali metodi di valutazione del dolore si basa sulle reazioni comportamentali e fisiologici del corpo, come il pianto, i movimenti del corpo o cambiamenti nell&#39;espressione del viso. Mentre questi provvedimenti dimostrano che i neonati montare una risposta in seguito alla stimolazione nociva, sono limitati: si basano sull&#39;attivazione di sottocorticale somatiche e percorsi motore autonomo che non può essere attendibilmente collegato al centro di elaborazione sensoriale del cervello. La conoscenza di come il sistema nervoso centrale risponde agli eventi nocivi in ​​grado di fornire una visione su come le informazioni e il dolore nocicettivo viene elaborata nei neonati. La procedura di tacco pungidito utilizzato per estrarre il sangue da bambini ospedalizzati offre un&#39;opportunità unica per studiare il dolore durante l&#39;infanzia. In questo video viene descritto come l&#39;elettroencefalografia (EEG) e l&#39;elettromiografia (EMG) tempo-locked a questa procedura can essere utilizzato per indagare l&#39;attività nocicettiva nel cervello e nel midollo spinale. Questo approccio integrato alla misurazione del dolore infantile ha il potenziale per aprire la strada ad uno strumento efficace e sensibile misura clinica.

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Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

La valutazione e trattamento del dolore nei bambini è difficile perché i bambini non possono segnalare verbalmente la loro esperienza. In questo video si descrivono metodi quantitativi elettrofisiologiche e tecniche di analisi che possono essere utilizzati per misurare la risposta agli eventi nocivi dal sistema nervoso infantile.

Le misurazioni elettrofisiologiche e Analisi di nocicezione nei neonati umani

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. Since infants cannot verbally report their experiences, current methods of pain assessment are ...

electrophysiological-measurements-analysis-nociception-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  University College London. La valutazione e trattamento del dolore nei bambini è difficile perché i bambini non possono segnalare verbalmente la loro esperienza. In questo video si descrivono metodi quantitativi elettrofisiologiche e tecniche di analisi che possono essere utilizzati per misurare la risposta agli eventi nocivi dal sistema nervoso infantile.

Video: Electrophysiological Measurements and Analysis of Nociception in Human Infants

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Ricerca

Neuroscienze

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Time-lapse immagini dal vivo di relazione clonale cellule progenitrici neurali in via di sviluppo Zebrafish proencefalo

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Investigating Social Cognition in Infants and Adults Using Dense Array Electroencephalography (dEEG)

Dense array electroencephalography (dEEG), which provides a non-invasive window for measuring brain activity and a temporal resolution unsurpassed by any other current brain imaging technology1,2, is being used increasingly in the study of social cognitive functioning in infants and adults. While dEEG is enabling researchers to examine brain activity patterns with unprecedented levels of sensitivity, conventional EEG recording systems continue to face certain limitations, including 1) poor spatial resolution and source localization3,4,2) the physical discomfort for test subjects of enduring the individual application of numerous electrodes to the surface of the scalp, and 3) the complexity for researchers of learning to use multiple software packages to collect and process data. Here we present an overview of an established methodology that represents a significant improvement on conventional methodologies for studying EEG in infants and adults. Although several analytical software techniques can be used to establish indirect indices of source localization to improve the spatial resolution of dEEG, the HydroCel Geodesic Sensor Net (HCGSN) by Electrical Geodesics, Inc. (EGI), a dense sensory array that maintains equal distances among adjacent recording electrodes on all surfaces of the scalp, further enhances spatial resolution4,5,6 compared to standard dEEG systems. The sponge-based HCGSN can be applied rapidly and without scalp abrasion, making it ideal for use with adults7,8, children9,10,11, and infants12, in both research and clinical4,5,6,13,14,15 settings. This feature allows for considerable cost and time savings by decreasing the average net application time compared to other dEEG systems. Moreover, the HCGSN includes unified, seamless software applications for all phases of data, greatly simplifying the collection, processing, and analysis of dEEG data.
The HCGSN features a low-profile electrode pedestal, which, when filled with electrolyte solution, creates a sealed microenvironment and an electrode-scalp interface. In all Geodesic dEEG systems, EEG sensors detect changes in voltage originating from the participant's scalp, along with a small amount of electrical noise originating from the room environment. Electrical signals from all sensors of the Geodesic sensor net are received simultaneously by the amplifier, where they are automatically processed, packaged, and sent to the data-acquisition computer (DAC). Once received by the DAC, scalp electrical activity can be isolated from artifacts for analysis using the filtering and artifact detection tools included in the EGI software. Typically, the HCGSN can be used continuously for only up to two hours because the electrolyte solution dries out over time, gradually decreasing the quality of the scalp-electrode interface.
In the Parent-Infant Research Lab at the University of Toronto, we are using dEEG to study social cognitive processes including memory, emotion, goals, intentionality, anticipation, and executive functioning in both adult and infant participants.

Investigating Social Cognition in Infants and Adults Using Dense Array Electroencephalography dEEG

Dense array electroencephalography is being used increasingly to study social cognitive functions in infants and adults. Here we present an established methodology that represents a significant improvement on conventional methodologies for studying EEG in infants and adults.

Indagare Cognizione sociale nei neonati e adulti Utilizzando Elettroencefalografia Dense Array ( D EEG)

Dense array electroencephalography (dEEG), which provides a non-invasive window for measuring brain activity and a temporal resolution unsurpassed by any ...

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

Metodi locale e globale valutazione nocicezione termica in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In Misure Vivo elettrofisiologici sui nervi mouse sciatico

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

Nuovo metodo di analisi per Cold nocicezione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...