Vorremmo ringraziare il Dr. Paul Weigel presso l&#39;Univ. dell&#39;Oklahoma per l&#39;utilizzo di anticorpi monoclonali 30 per il rilevamento del recettore HARE/Stabilin-2 e Janet Weigel per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è finanziata da fondi di ricerca dell&#39;Università di Nebraska.

1. Escissione del fegato (adottato dal PO Seglen 12 e R. Blomhoff 13 con modifiche 14,15) <ol><li> Aggiungere 10 ml 30% isoflurano in polietilene glicole di una capsula di Petri in una camera chiusa 5,5 L. E &#39;ottimale per attendere 10-15 minuti dopo l&#39;aggiunta di isoflurano a creare un&#39;atmosfera stabilizzato all&#39;interno della camera. </li><li> Mettere un topo in camera stagna e farlo diventare anestetizzati. Pieno effetto dell&#39;anestesia sono evidenti quando l&#39;animale diventa molle, non risponde, e mostre respirazione profonda. </li><li> Mettere 2 ml di isoflurano in polietilene glicole in alcuni batuffoli di cotone sul fondo di un tubo siringa da 30 ml. </li><li> Posizionare il ratto sulla sua schiena su un pannolino-vassoio coperto e posto il tubo siringa sopra il muso. </li><li> Immediatamente confermare anestesia profonda bagnando l&#39;addome con il 70% di etanolo. Non lasciate l&#39;animale muore per overdose isoflurano. </li><li> Con forbici e pinze fasciatura, esporre l&#39;intero abdcavità ominal. </li><li> Individuare la vena porta e, utilizzando pinze, disegnare due fili di seta o di filo di poliestere chirurgico (legatura) sotto la vena porta immediatamente sopra il ramo mesenterica. </li><li> Ritirare le pinze e un nodo sciolto overhand. </li><li> Utilizzando pinze sotto la vena porta e delicatamente tirando indietro per raddrizzare la vena, cannulate la vena con un catetere AutoGuard Insyte (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) catetere o simili. Il catetere dovrebbe andare al di là di qualche mm l&#39;anello formato dal filo. </li><li> Ritrarre e rimuovere l&#39;ago con il rilascio a molla trigger il catetere. Il sangue dovrebbe iniziare a filtrare fino al corretto posizionamento del catetere indicando legatura. </li><li> Serrare il nodo semplice e sicuro con un altro nodo semplice. </li><li> Sever sia la vena cava inferiore o aorta discendente (abdominalis aorta) per consentire di drenare il sangue dal sistema circolatorio. </li><li> Iniziare lavaggio del fegato con ossigenatoTBS a 37 ° C per rimuovere il sangue (sbiancamento) ad un flusso di 20 mL / min. Il fegato deve girare da un viola rossastro ad un colore terriccio. </li><li> Mentre il fegato è vampate, accise il fegato tagliando via il tratto gastrointestinale e del tessuto connettivo. E &#39;importante non lacerare il fegato o forare la capsula di Glisson. </li><li> Mettere il fegato in una rete di plastica sopra un imbuto che permette di buffer da raccogliere e ricircolare. Buffer a questo punto non dovrebbe essere rimessa in circolazione, ma il flusso nel becher rifiuti. Vampate di calore non dovrebbe durare più di 10 min. (Fig. 2A). Preparare la soluzione endocitosi richiesto al punto 2.1 passo. </li></ol> 2. Internalizzazione di 125 I-SA-b-Hep (o altro idoneo legante etichettati) <ol><li> A 50 ml RPMI dei media in un bicchiere piccolo, aggiungere a una concentrazione finale BSA 0,05% e 0,01 mCi 125 I-SA-b-epatite o altre ligando adeguatamente etichettati per endocitosi. </li><li> Attaccare questa coppa al un attrezzos per consentire l&#39;ossigenazione. </li><li> Spegnere la pompa, passare il tubo di aspirazione, e poi accendere la pompa a 20 ml / min. </li><li> Come RPMI etichettato avvicina al fegato, spegnere la pompa e che il liquido in eccesso nel imbuto e tubo di scarico. </li><li> Posizionare il tubo di scarico nel becher mezzi di comunicazione per permettere il ricircolo dei media etichettati e quindi riavviare la pompa. </li><li> Lasciare fluidi di ricircolare attraverso il fegato per non più di 1 ora. </li><li> Durante questa fase di internazionalizzazione, sia che la temperatura nel fegato è stabile coprendolo e preparare la collagenasi per la digestione. </li></ol> 3. La digestione del fegato mediante digestione collagenasi <ol><li> Appena sciolto e filtrato (0,45 micron) collagenasi (100 mg / kg di peso ratto) dovrebbe essere aggiunto al buffer 2 in un volume totale non superiore a 60 ml a 37 ° C. Il volume dipende dalla lunghezza / volume interno del tubo e deve essere adeguato di conseguenza. </li><li> Fermare la pompa e lo scambio deltubo di aspirazione dalla coppa media per il TBS. </li><li> Lavare il fegato per 2 min a 50 ml / min che permette di allentamento delle giunzioni cellulari desmosomiali che sono il calcio dipendente. </li><li> Mentre il fegato è vampate di calore, scambio il becher media con il bicchiere contenente collagenasi sopra l&#39;apparecchio. </li><li> Immediatamente dopo il lavaggio, inizia la digestione con collagenasi in un ciclo circolatorio ad un flusso di 20 mL / min per un massimo di 15 min. Dal momento che i lotti collagenasi variano in base al numero di lotto, le variazioni nella quantità e nel tempo di digestione devono essere ottimizzati per ogni nuovo lotto di collagenasi. Collagenasi è anche il calcio dipendente. Spegnere la pompa e passare il buffer e le linee di gas da A a B. Flask Flask Trasferire la linea di scarichi dal contenitore dei rifiuti a Flask B (Fig. 2B). </li><li> Fermare la pompa, rimuovere il catetere e trasferire il fegato di un piatto contenente 20-30 mL di tampone 1. </li><li> Staccare la Glisson di capsula del fegato e scuotere il cellulares nel liquido. </li><li> Come il liquido diventa opaco con materiale cellulare, trasferire le cellule attraverso una maglia 100 micron seguita da filtrazione attraverso una maglia 30 micron e poi in un cono da 50 ml su ghiaccio. </li><li> Aggiungere più Tampone 1 al fegato e continuare scuotendo le cellule dalla matrice fegato, trasferendo il liquido per i filtri a rete e coniche. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,9 fino a quando non più cellule possono essere sloggiato con agitazione ragionevole del fegato. </li></ol> 4. Epatociti e SEC purificazione <ol><li> Centrifugare i 50 mL conicals contenenti cellule a 150 xg per 3 min. per far sedimentare il epatociti. </li><li> Trasferire la frazione liquida che contiene le cellule non-parenchimali a fresco 50 ml conicals sul ghiaccio. </li><li> Lavare i epatociti essere risospendere il pellet in Tampone 3 e ripetendo i punti 4.1 e 4.2 altre tre volte. </li><li> Alla fine della lava, i pellet sono epatociti ≥ 97%. Per ottenere i secondi, centrifuga tutti i tubi containing pool surnatante (contenente HSC, secondi, e KC e alcuni piccoli epatociti) a 200 xg per 10 min. a 4 ° C. </li><li> Aspirare il buffer e risospendere tutti i pellet in 5 ml RPMI / BSA a 4 ° C. </li><li> Piscina unite le cellule in 2 tubi e aggiungere RPMI / BSA fino ad un volume di 35 ml. </li><li> Centrifugare conicals a 100 xg per 3 min. </li><li> Raccogliere i primi 25 ml di liquido e trasferirlo in una pulita da 50 ml. </li><li> Risospendere il pellet nel restante 10 media mL e aggiungere 25 ml di ritorno freddo RPMI / BSA e centrifugare a 100 xg per 3 min. </li><li> Ripetere i punti 3.8 e 3.9 una volta di più, scartare il pellet e 10 media inferiore ml. </li><li> Centrifugare il supernatents a pellet secondi, KC, e CSE a 200 xg per 10 min. a 4 ° C. </li><li> Preparare tre provette da 50 ml contenente 20 ml di Percoll al 25% in PBS su ghiaccio. Alla base con 15 ml di Percoll al 50% in ciascun tubo. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in un volume totale di 30 ml RPMI / BSA. </li><li> Attentamente sovrapposizione each pendenza con 10 ml di cellule e centrifugare a 900 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Secondi e KC hanno molto vicino densità di galleggiamento e sono a livello di interfaccia 25/50%. HSCs sono in genere al 25% / media interfaccia per la loro galleggiabilità maggiore, come le cellule lipidiche memorizzazione. Qualsiasi epatociti e cellule del sangue rimanenti hanno la buoyancies inferiori e sono pellet. Aspirare dall&#39;alto verso il basso vicino l&#39;interfaccia% 25/50 e smaltire questo materiale. </li><li> Raccogliere le cellule nel interfaccia 25/50% e trasferirli in un cono fresco con fredda RPMI. Il volume finale deve essere ~ 40 ml per diluire il Percoll. </li><li> Centrifugare la conica a 350 xg per 10 min a 4 ° C per agglomerare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule in ~ 10 ml preriscaldata RPMI contenente 100 U / mL Penicillin/100 g / mL streptomicina celle e collocare in un piatto di vetro, lavata con acido Petri o cristallizzare piatto. </li><li> Incubare le cellule per 15 minuti. a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore. </li><li> Roccia o agitare la piastra un po &#39;e poi raccogliere i SECS nel surnatante. Il KC aderire al vetro molto più rapidamente di secondi. In alternativa, SECS possono essere separati da KC da immunopurification utilizzando anticorpi anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE coniugato con sfere magnetiche. </li><li> Numeri vitalità delle cellule e possono essere valutati per esclusione trypan blu con un emocitometro o con l&#39;utilizzo di un contatore automatico delle celle. </li><li> Cultura del sec su piatti di plastica fibronectina rivestite a 37 ° C, 5% di CO 2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL di VEGF, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina o con epatociti mezzi condizionati. </li><li> Epatociti, KC, e SECS possono essere valutare per l&#39;internalizzazione dei materiali etichettati con l&#39;uso di un contatore gamma e normalizzante per un totale di proteina cellulare o al microscopio (se fluorescente) utilizzando questi metodi di coltura. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Purificazione degli epatociti è ≥ 97% e la purificazione SEC è typicalleato ≥ 95% con questo metodo. Asportazione della cavità addominale, incannulazione della vena porta, e pallore del fegato tutto dovrebbe avvenire entro un minuto per ottenere i migliori risultati. HARE/Stabilin-2 è un recettore specifico sulla SECS fegato e non è espresso in altri tipi di cellule del fegato. In questo esempio, lisati di cellule sia di epatociti e SECS erano separati da 5% SDS-PAGE e sondato con un anticorpo monoclonale contro entrambe le isoforme di Stabilin-2 (Fig. 3). Eparina non frazionata iniettate nel flusso sanguigno viene eliminato dal fegato 16. La clearance è principalmente eseguita da SECS fegato in contrasto con epatociti e KC 17. Il recettore Stabilin-2/HARE è il recettore principale che lega spazio e interiorizza eparina in sec 18. In questo nostro esempio, abbiamo etichettato eparina con un tag biotina sul gruppo carbossilato di GlcNAc / NS. La biotina è stata coniugata con streptavidina iodati per la rilevazione di interiorizzate prot eparinaeoglycan. L&#39;iniezione del eparina etichettati seguito da dissanguamento 30 minuti post-iniezione ci permette di monitorare quali organi interiorizzare questa forma di eparina. In questo breve intervallo di tempo, il fegato è l&#39;organo primario distanza (Fig. 4). Per meglio comprendere quale tipo di cellula è responsabile per la liquidazione, abbiamo aggiunto 125 I-SA-b-Hep ai media RPMI integrato con 0,05% BSA e permesso di circolare attraverso il fegato per 20 minuti. A seguito di digestione collagenasi e purificazione cellulare, la stragrande maggioranza di eparina marcato è interiorizzato da SECS in contrasto con epatociti (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Architettura di base di fegato. SECS formano le pareti dei sinusoidi e sono normalmente finestrate (piccoli gruppi di cerchi). Cellule stellate (CSE) si trovano nello spazio di Disse in contrasto con Kupffer cells (KC) che sono normalmente presenti nel microcircolo dei sinusoidi. Epatociti occupano l&#39;altro lato dello spazio di Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Schematica degli apparati di perfusione. A) Set-up di apparecchi durante il lavaggio / lavaggio delle sinusoidi del fegato. TBS è in un pallone da 1 L. B) A 125 ml beuta contenente ~ 60 mL di tampone 2 con collagenasi viene utilizzata per la digestione del fegato in un circuito chiuso. La linea emissario è cambiato anche dal contenitore dei rifiuti a B beuta attraverso un taglio tacca nel tappo di gomma. La linea di ossigeno non è sommerso nel buffer contenente collagenasi (B fiasco) per evitare la formazione di schiuma. I tappi di ogni pallone sono dentellati per consentire un efficiente trasferimento della linea di scarichi e per evitare una maggiore pressione dal gas ossigeno. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. </sTrong preparati&gt; epatociti non sono contaminati da secondi. La stessa quantità di lisati cellulari purificati da lotti di epatociti (corsia 1) e SECS (corsia 2) sono state separate da 5% SDS-PAGE e cancellati alla nitrocellulosa. Anticorpo monoclonale # 30, che è specifico contro entrambe le isoforme (315 kDa e 190 kDa) di HARE/Stabilin-2 è stato utilizzato per sondare la lisati. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Distribuzione di eparina etichettati di organi. I ratti sono stati iniettati attraverso la vena della coda laterale con 125 I-SA-b-epatite attendere 30 minuti e poi dissanguato. Il sangue è stato raccolto in modo da non dare a tutti gli organi artificialmente letture alte. Conteggi al minuto (CPM) di ciascun organo sono stati normalizzati contro il peso degli organi in grammi. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Quantità di eparina etichettato in epatociti e secondi. RPMI supporti contenenti 125 I-SA-b-Hep è stato permesso di circolare attraverso un fegato intatto per 20 minuti seguita da digestione collagenasi e purificazione cellulare. La stessa quantità di lisati cellulari delle proteine ​​degli epatociti e SEC sono stati quantificati con il saggio Bradford e contati da un contatore gamma. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Cellule di Kupffer sono separate da SECS per adesione su vetro. Le cellule sono state collocato in una lavata con acido piatto di vetro cristallizzare e ha permesso di aderire per 15 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2. Il supernatent non contengono aderito cellule era agitato lentamente e messo in una provetta da centrifuga. Lisati da entrambe le celle aderito su vetro (corsia 1) e da quelli non rispettando le cellule (corsia 2) sono state separate da 8% SDS-PAGE, cancellati, e sondato con un anticorpo contro il CD163, che è specifico per le cellule di Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figura 7"/> SECS Figura 7. Placcato su fibronectina plastificato 6-bene i piatti durante la notte sono state incubate in RPMI integrato con 0,1% BSA. Immagini a contrasto di fase sono state prese a (A) e 100x (B) ingrandimento 200x.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Anestesia del ratto con il metodo goccia in cui isoflurano vapore induce incoscienza è il metodo preferito per i nostri studi. Un vaporizzatore può anche essere usato al posto di una siringa con cotone per mantenere l&#39;animale al di fuori della camera, ma le procedure chirurgiche sono così veloce, non è necessario. Polietilene glicole viene aggiunto al isoflurano per diminuire la pressione del vapore e la velocità di evaporazione. Troppo vapore isoflurano può indurre la morte troppo in fretta. Se l&#39;animale muore prima che il fegato è cannulato e scottati con TBS, coaguli di sangue possono mettere in comune a livello epatico e prevenire lavaggio efficiente delle sinusoidi e la digestione con collagenasi. L&#39;aggiunta di eparina può essere utile come anticoagulante, ma non è utilizzata in questi studi dato che usiamo eparina etichettati come la nostra sonda. Soluzione salina tamponata di Gey (GBSS) è spesso sostituito da altri laboratori per la purificazione del sec. Mentre è utile per la purificazione SEC, l&#39;epatiteatocytes non tollerano GBSS così come buffer 1-3 e Viabilità non sono così alti. Quando si misura endocitosi, è buona per misurare i livelli di fondo in organo e in purificata epatociti. Questo metodo è uno dei due per la depurazione efficiente SECS dopo la perfusione del fegato con collagenasi. L&#39;altro metodo separa le cellule non-parenchimali per centrifugazione elutriation 19 anzichè il gradiente Percoll. I vantaggi per l&#39;utilizzo di elutriation su gradienti di Percoll sono Viabilità cellule leggermente più alta e numeri. Lo svantaggio è che centrifugazione elutriation richiede un rotore specializzato, centrifuga dedicata, e la pompa peristaltica insieme che costa decine di migliaia di dollari. Questo metodo richiede solo l&#39;uso di una centrifuga refrigerata da tavolo e la pompa peristaltica, che è standard in molti laboratori. Separazione di secondi e KC di adesione selettiva è un metodo standard20-22. Se è vero che SECS aderirà al vetro e plastica, il punto chiave è quello di utilizzare lavata con acido vetro pulito, con non più di 15 minuti di incubazione a 37 ° C al 5% di CO 2. KC sarà sempre più veloce di aderire secondi e si consiglia di lavare delicatamente il KC con i media per estrarre qualsiasi SECS rimanenti che si sono vagamente collegati. Pronasi e altre proteasi sono omessi dai passi della digestione collagenasi in questo protocollo per aumentare Viabilità delle cellule. Proteasi digerire recettori extracellulari e può inibire l&#39;adesione cellulare nelle fasi di purificazione finale. Il metodo presentato qui ha una grande varietà di applicazioni. Anche se si mostra il risultato finale in cui l&#39;eparina viene inizialmente assunto per la liquidazione, la perfusione del fegato per ottenere epatociti primari, KC, SECS, e CSE può essere utile per una serie di studi che coinvolgono vie metaboliche, immunoregolazione, attività scavenger, e altri Studi fisiologicies. La parte più difficile di questa procedura è incannulazione buona, la digestione del fegato, e la gestione del fegato senza avere la polizza catetere dalla vena porta.

<ul><li> Tampone 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% di BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer 2 (buffer di perfusione): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4,8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 HEPES mM, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Tampone 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 HEPES mM, 1,5% di BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15 g / L BSA in RPMI </li><li> TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM sale Base Trizma. </li><li> Collagenasi: Collagenasi A (# 11088785103) da Roche, collagenasi di tipo I (# LS004691) da biochimici Worthington o Collagenasi I (# C0130) o IA (# C9891) di Sigma-Aldrich. </li></ul> Tutti i sali sono di Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Modello / catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Acqua del bagno 20L </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> L&#39;acqua è circa 45 ° C per compensare il raffreddamento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> all&#39;interno del tubo. </td></tr><tr><td> Pompa peristaltica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serie </td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Sorvall </td><td> Legenda XTR </td><td></td></tr><tr><td> Catetere </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Essiccatore camera </td><td> Pescatore </td><td> 08595E </td><td> Utilizzare una piastra interna </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micron mesh </td><td> Spettro laboratori </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 micron mesh </td><td> Spettro laboratori </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilene glicole </td><td> Spettro di laboratorios </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Il fegato è il centro metabolico del corpo dei mammiferi e funge da filtro per il sangue. L&#39;architettura di base del fegato è illustrata in figura 1 in cui è composto oltre l&#39;85% della massa epatica di epatociti e il restante 15% della massa cellulare è composto da cellule di Kupffer (KCS), cellule stellate (HSC), e sinusoidale cellule endoteliali (SEC). SECS formano le pareti dei vasi sanguigni all&#39;interno del fegato e contengono morfologia specializzate chiamate Fenestrae all&#39;interno del citoplasma. Fenestrazione del citoplasma è la comparsa di buchi (~ 100 micron) all&#39;interno delle cellule in modo che l&#39;atto SECS come un setaccio in cui la maggior parte chilomicroni, i resti chilomicroni e macromolecole, ma non le cellule, passano attraverso la epatociti e HSC 1 (fig. 1). A causa della mancanza di una membrana basale, il divario tra i secondi e epatociti forma dello spazio di Disse. HSC occupare questo spazio e giocare un ruolo importante nella regolazione e la risposta di injury, stoccaggio di acido retinoico e immunoregolazione dei 2 fegato. SECS sono tra le cellule più endocytically attiva del corpo con un vasto insieme di recettori scavenger sulla loro superficie a 3 celle. Questi includono SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. In generale, le piccole particelle colloidali meno di 230 nm e macromolecole in fase di buffer sono ripreso da SECS, mentre le particelle più grandi e detriti cellulari è endocitosi (fagocitati) di KC 4. Così, la clearance maggior parte del materiale extracellulare come la glicosaminoglicani dal sangue è in gran parte dipende dalla salute e delle funzioni di endocitico SECS 5,6. Per esempio, un aumento dei livelli ematici di acido ialuronico è indicativo di malattia del fegato che vanno da lievi a forme più gravi 7. Con l&#39;eccezione di un rapporto di 8, non ci sono immortalati SEC linee cellulari esistenti. Anche questa linea di cellule immortalizzate è de-differenziareated in quanto non esprime recettori scavenger che sono presenti sul SECS primari (i nostri dati, non riportati). Tutti gli studi cellula biologica deve essere eseguita su cellule primarie appena ottenuto dall&#39;animale. Purtroppo, SECS dedifferentiate in condizioni di coltura standard e deve essere utilizzato entro 1 o 2 giorni su isolamento dall&#39;animale. Differenziazione delle SECS è segnata dall&#39;espressione di Stabilin-2 o recettori LEPRE 9, CD31, e la presenza di fenestrazione citoplasmatici 1. Differenziazione delle SECS può essere esteso con l&#39;aggiunta di VEGF nei terreni di coltura o da cellule in coltura degli epatociti mezzo condizionato 10,11. In questo rapporto, dimostreremo l&#39;attività endocitico di SECS nell&#39;organo intatto utilizzando radio-marcato eparina per acido ialuronico per la SEC specifici Stabilin-2 recettore. Ci sarà poi purificare epatociti e SECS dal fegato perfuso di misurare endocitosi.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K Views.  University of Nebraska, Lincoln. Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolamento di cellule CD133 + staminali del fegato per l&#39;espansione clonale

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto<em&gt; In situ</em&gt; Fegato perfusione

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositivo per il recupero di campioni crioconservati cadere accidentalmente nelle cisterne criogeniche

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Un metodo standardizzato per l&#39;analisi delle cellule epatiche sinusoidali endoteliali e loro fenestrazioni da microscopia elettronica a scansione

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

Sistema microfisiologico epatico umano per la valutazione della tossicità epatica indotta da farmaci in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.