Vorremmo ringraziare il Dr. Paul Weigel presso l&#39;Univ. dell&#39;Oklahoma per l&#39;utilizzo di anticorpi monoclonali 30 per il rilevamento del recettore HARE/Stabilin-2 e Janet Weigel per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è finanziata da fondi di ricerca dell&#39;Università di Nebraska.

1. Escissione del fegato (adottato dal PO Seglen 12 e R. Blomhoff 13 con modifiche 14,15) <ol><li> Aggiungere 10 ml 30% isoflurano in polietilene glicole di una capsula di Petri in una camera chiusa 5,5 L. E &#39;ottimale per attendere 10-15 minuti dopo l&#39;aggiunta di isoflurano a creare un&#39;atmosfera stabilizzato all&#39;interno della camera. </li><li> Mettere un topo in camera stagna e farlo diventare anestetizzati. Pieno effetto dell&#39;anestesia sono evidenti quando l&#39;animale diventa molle, non risponde, e mostre respirazione profonda. </li><li> Mettere 2 ml di isoflurano in polietilene glicole in alcuni batuffoli di cotone sul fondo di un tubo siringa da 30 ml. </li><li> Posizionare il ratto sulla sua schiena su un pannolino-vassoio coperto e posto il tubo siringa sopra il muso. </li><li> Immediatamente confermare anestesia profonda bagnando l&#39;addome con il 70% di etanolo. Non lasciate l&#39;animale muore per overdose isoflurano. </li><li> Con forbici e pinze fasciatura, esporre l&#39;intero abdcavità ominal. </li><li> Individuare la vena porta e, utilizzando pinze, disegnare due fili di seta o di filo di poliestere chirurgico (legatura) sotto la vena porta immediatamente sopra il ramo mesenterica. </li><li> Ritirare le pinze e un nodo sciolto overhand. </li><li> Utilizzando pinze sotto la vena porta e delicatamente tirando indietro per raddrizzare la vena, cannulate la vena con un catetere AutoGuard Insyte (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) catetere o simili. Il catetere dovrebbe andare al di là di qualche mm l&#39;anello formato dal filo. </li><li> Ritrarre e rimuovere l&#39;ago con il rilascio a molla trigger il catetere. Il sangue dovrebbe iniziare a filtrare fino al corretto posizionamento del catetere indicando legatura. </li><li> Serrare il nodo semplice e sicuro con un altro nodo semplice. </li><li> Sever sia la vena cava inferiore o aorta discendente (abdominalis aorta) per consentire di drenare il sangue dal sistema circolatorio. </li><li> Iniziare lavaggio del fegato con ossigenatoTBS a 37 ° C per rimuovere il sangue (sbiancamento) ad un flusso di 20 mL / min. Il fegato deve girare da un viola rossastro ad un colore terriccio. </li><li> Mentre il fegato è vampate, accise il fegato tagliando via il tratto gastrointestinale e del tessuto connettivo. E &#39;importante non lacerare il fegato o forare la capsula di Glisson. </li><li> Mettere il fegato in una rete di plastica sopra un imbuto che permette di buffer da raccogliere e ricircolare. Buffer a questo punto non dovrebbe essere rimessa in circolazione, ma il flusso nel becher rifiuti. Vampate di calore non dovrebbe durare più di 10 min. (Fig. 2A). Preparare la soluzione endocitosi richiesto al punto 2.1 passo. </li></ol> 2. Internalizzazione di 125 I-SA-b-Hep (o altro idoneo legante etichettati) <ol><li> A 50 ml RPMI dei media in un bicchiere piccolo, aggiungere a una concentrazione finale BSA 0,05% e 0,01 mCi 125 I-SA-b-epatite o altre ligando adeguatamente etichettati per endocitosi. </li><li> Attaccare questa coppa al un attrezzos per consentire l&#39;ossigenazione. </li><li> Spegnere la pompa, passare il tubo di aspirazione, e poi accendere la pompa a 20 ml / min. </li><li> Come RPMI etichettato avvicina al fegato, spegnere la pompa e che il liquido in eccesso nel imbuto e tubo di scarico. </li><li> Posizionare il tubo di scarico nel becher mezzi di comunicazione per permettere il ricircolo dei media etichettati e quindi riavviare la pompa. </li><li> Lasciare fluidi di ricircolare attraverso il fegato per non più di 1 ora. </li><li> Durante questa fase di internazionalizzazione, sia che la temperatura nel fegato è stabile coprendolo e preparare la collagenasi per la digestione. </li></ol> 3. La digestione del fegato mediante digestione collagenasi <ol><li> Appena sciolto e filtrato (0,45 micron) collagenasi (100 mg / kg di peso ratto) dovrebbe essere aggiunto al buffer 2 in un volume totale non superiore a 60 ml a 37 ° C. Il volume dipende dalla lunghezza / volume interno del tubo e deve essere adeguato di conseguenza. </li><li> Fermare la pompa e lo scambio deltubo di aspirazione dalla coppa media per il TBS. </li><li> Lavare il fegato per 2 min a 50 ml / min che permette di allentamento delle giunzioni cellulari desmosomiali che sono il calcio dipendente. </li><li> Mentre il fegato è vampate di calore, scambio il becher media con il bicchiere contenente collagenasi sopra l&#39;apparecchio. </li><li> Immediatamente dopo il lavaggio, inizia la digestione con collagenasi in un ciclo circolatorio ad un flusso di 20 mL / min per un massimo di 15 min. Dal momento che i lotti collagenasi variano in base al numero di lotto, le variazioni nella quantità e nel tempo di digestione devono essere ottimizzati per ogni nuovo lotto di collagenasi. Collagenasi è anche il calcio dipendente. Spegnere la pompa e passare il buffer e le linee di gas da A a B. Flask Flask Trasferire la linea di scarichi dal contenitore dei rifiuti a Flask B (Fig. 2B). </li><li> Fermare la pompa, rimuovere il catetere e trasferire il fegato di un piatto contenente 20-30 mL di tampone 1. </li><li> Staccare la Glisson di capsula del fegato e scuotere il cellulares nel liquido. </li><li> Come il liquido diventa opaco con materiale cellulare, trasferire le cellule attraverso una maglia 100 micron seguita da filtrazione attraverso una maglia 30 micron e poi in un cono da 50 ml su ghiaccio. </li><li> Aggiungere più Tampone 1 al fegato e continuare scuotendo le cellule dalla matrice fegato, trasferendo il liquido per i filtri a rete e coniche. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,9 fino a quando non più cellule possono essere sloggiato con agitazione ragionevole del fegato. </li></ol> 4. Epatociti e SEC purificazione <ol><li> Centrifugare i 50 mL conicals contenenti cellule a 150 xg per 3 min. per far sedimentare il epatociti. </li><li> Trasferire la frazione liquida che contiene le cellule non-parenchimali a fresco 50 ml conicals sul ghiaccio. </li><li> Lavare i epatociti essere risospendere il pellet in Tampone 3 e ripetendo i punti 4.1 e 4.2 altre tre volte. </li><li> Alla fine della lava, i pellet sono epatociti ≥ 97%. Per ottenere i secondi, centrifuga tutti i tubi containing pool surnatante (contenente HSC, secondi, e KC e alcuni piccoli epatociti) a 200 xg per 10 min. a 4 ° C. </li><li> Aspirare il buffer e risospendere tutti i pellet in 5 ml RPMI / BSA a 4 ° C. </li><li> Piscina unite le cellule in 2 tubi e aggiungere RPMI / BSA fino ad un volume di 35 ml. </li><li> Centrifugare conicals a 100 xg per 3 min. </li><li> Raccogliere i primi 25 ml di liquido e trasferirlo in una pulita da 50 ml. </li><li> Risospendere il pellet nel restante 10 media mL e aggiungere 25 ml di ritorno freddo RPMI / BSA e centrifugare a 100 xg per 3 min. </li><li> Ripetere i punti 3.8 e 3.9 una volta di più, scartare il pellet e 10 media inferiore ml. </li><li> Centrifugare il supernatents a pellet secondi, KC, e CSE a 200 xg per 10 min. a 4 ° C. </li><li> Preparare tre provette da 50 ml contenente 20 ml di Percoll al 25% in PBS su ghiaccio. Alla base con 15 ml di Percoll al 50% in ciascun tubo. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in un volume totale di 30 ml RPMI / BSA. </li><li> Attentamente sovrapposizione each pendenza con 10 ml di cellule e centrifugare a 900 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Secondi e KC hanno molto vicino densità di galleggiamento e sono a livello di interfaccia 25/50%. HSCs sono in genere al 25% / media interfaccia per la loro galleggiabilità maggiore, come le cellule lipidiche memorizzazione. Qualsiasi epatociti e cellule del sangue rimanenti hanno la buoyancies inferiori e sono pellet. Aspirare dall&#39;alto verso il basso vicino l&#39;interfaccia% 25/50 e smaltire questo materiale. </li><li> Raccogliere le cellule nel interfaccia 25/50% e trasferirli in un cono fresco con fredda RPMI. Il volume finale deve essere ~ 40 ml per diluire il Percoll. </li><li> Centrifugare la conica a 350 xg per 10 min a 4 ° C per agglomerare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule in ~ 10 ml preriscaldata RPMI contenente 100 U / mL Penicillin/100 g / mL streptomicina celle e collocare in un piatto di vetro, lavata con acido Petri o cristallizzare piatto. </li><li> Incubare le cellule per 15 minuti. a 37 ° C in un tessuto culturale incubatore. </li><li> Roccia o agitare la piastra un po &#39;e poi raccogliere i SECS nel surnatante. Il KC aderire al vetro molto più rapidamente di secondi. In alternativa, SECS possono essere separati da KC da immunopurification utilizzando anticorpi anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE coniugato con sfere magnetiche. </li><li> Numeri vitalità delle cellule e possono essere valutati per esclusione trypan blu con un emocitometro o con l&#39;utilizzo di un contatore automatico delle celle. </li><li> Cultura del sec su piatti di plastica fibronectina rivestite a 37 ° C, 5% di CO 2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL di VEGF, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina o con epatociti mezzi condizionati. </li><li> Epatociti, KC, e SECS possono essere valutare per l&#39;internalizzazione dei materiali etichettati con l&#39;uso di un contatore gamma e normalizzante per un totale di proteina cellulare o al microscopio (se fluorescente) utilizzando questi metodi di coltura. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Purificazione degli epatociti è ≥ 97% e la purificazione SEC è typicalleato ≥ 95% con questo metodo. Asportazione della cavità addominale, incannulazione della vena porta, e pallore del fegato tutto dovrebbe avvenire entro un minuto per ottenere i migliori risultati. HARE/Stabilin-2 è un recettore specifico sulla SECS fegato e non è espresso in altri tipi di cellule del fegato. In questo esempio, lisati di cellule sia di epatociti e SECS erano separati da 5% SDS-PAGE e sondato con un anticorpo monoclonale contro entrambe le isoforme di Stabilin-2 (Fig. 3). Eparina non frazionata iniettate nel flusso sanguigno viene eliminato dal fegato 16. La clearance è principalmente eseguita da SECS fegato in contrasto con epatociti e KC 17. Il recettore Stabilin-2/HARE è il recettore principale che lega spazio e interiorizza eparina in sec 18. In questo nostro esempio, abbiamo etichettato eparina con un tag biotina sul gruppo carbossilato di GlcNAc / NS. La biotina è stata coniugata con streptavidina iodati per la rilevazione di interiorizzate prot eparinaeoglycan. L&#39;iniezione del eparina etichettati seguito da dissanguamento 30 minuti post-iniezione ci permette di monitorare quali organi interiorizzare questa forma di eparina. In questo breve intervallo di tempo, il fegato è l&#39;organo primario distanza (Fig. 4). Per meglio comprendere quale tipo di cellula è responsabile per la liquidazione, abbiamo aggiunto 125 I-SA-b-Hep ai media RPMI integrato con 0,05% BSA e permesso di circolare attraverso il fegato per 20 minuti. A seguito di digestione collagenasi e purificazione cellulare, la stragrande maggioranza di eparina marcato è interiorizzato da SECS in contrasto con epatociti (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Architettura di base di fegato. SECS formano le pareti dei sinusoidi e sono normalmente finestrate (piccoli gruppi di cerchi). Cellule stellate (CSE) si trovano nello spazio di Disse in contrasto con Kupffer cells (KC) che sono normalmente presenti nel microcircolo dei sinusoidi. Epatociti occupano l&#39;altro lato dello spazio di Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Schematica degli apparati di perfusione. A) Set-up di apparecchi durante il lavaggio / lavaggio delle sinusoidi del fegato. TBS è in un pallone da 1 L. B) A 125 ml beuta contenente ~ 60 mL di tampone 2 con collagenasi viene utilizzata per la digestione del fegato in un circuito chiuso. La linea emissario è cambiato anche dal contenitore dei rifiuti a B beuta attraverso un taglio tacca nel tappo di gomma. La linea di ossigeno non è sommerso nel buffer contenente collagenasi (B fiasco) per evitare la formazione di schiuma. I tappi di ogni pallone sono dentellati per consentire un efficiente trasferimento della linea di scarichi e per evitare una maggiore pressione dal gas ossigeno. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. </sTrong preparati&gt; epatociti non sono contaminati da secondi. La stessa quantità di lisati cellulari purificati da lotti di epatociti (corsia 1) e SECS (corsia 2) sono state separate da 5% SDS-PAGE e cancellati alla nitrocellulosa. Anticorpo monoclonale # 30, che è specifico contro entrambe le isoforme (315 kDa e 190 kDa) di HARE/Stabilin-2 è stato utilizzato per sondare la lisati. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Distribuzione di eparina etichettati di organi. I ratti sono stati iniettati attraverso la vena della coda laterale con 125 I-SA-b-epatite attendere 30 minuti e poi dissanguato. Il sangue è stato raccolto in modo da non dare a tutti gli organi artificialmente letture alte. Conteggi al minuto (CPM) di ciascun organo sono stati normalizzati contro il peso degli organi in grammi. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figura 5"/> Figura 5. Quantità di eparina etichettato in epatociti e secondi. RPMI supporti contenenti 125 I-SA-b-Hep è stato permesso di circolare attraverso un fegato intatto per 20 minuti seguita da digestione collagenasi e purificazione cellulare. La stessa quantità di lisati cellulari delle proteine ​​degli epatociti e SEC sono stati quantificati con il saggio Bradford e contati da un contatore gamma. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figura 6"/> Figura 6. Cellule di Kupffer sono separate da SECS per adesione su vetro. Le cellule sono state collocato in una lavata con acido piatto di vetro cristallizzare e ha permesso di aderire per 15 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2. Il supernatent non contengono aderito cellule era agitato lentamente e messo in una provetta da centrifuga. Lisati da entrambe le celle aderito su vetro (corsia 1) e da quelli non rispettando le cellule (corsia 2) sono state separate da 8% SDS-PAGE, cancellati, e sondato con un anticorpo contro il CD163, che è specifico per le cellule di Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figura 7"/> SECS Figura 7. Placcato su fibronectina plastificato 6-bene i piatti durante la notte sono state incubate in RPMI integrato con 0,1% BSA. Immagini a contrasto di fase sono state prese a (A) e 100x (B) ingrandimento 200x.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Anestesia del ratto con il metodo goccia in cui isoflurano vapore induce incoscienza è il metodo preferito per i nostri studi. Un vaporizzatore può anche essere usato al posto di una siringa con cotone per mantenere l&#39;animale al di fuori della camera, ma le procedure chirurgiche sono così veloce, non è necessario. Polietilene glicole viene aggiunto al isoflurano per diminuire la pressione del vapore e la velocità di evaporazione. Troppo vapore isoflurano può indurre la morte troppo in fretta. Se l&#39;animale muore prima che il fegato è cannulato e scottati con TBS, coaguli di sangue possono mettere in comune a livello epatico e prevenire lavaggio efficiente delle sinusoidi e la digestione con collagenasi. L&#39;aggiunta di eparina può essere utile come anticoagulante, ma non è utilizzata in questi studi dato che usiamo eparina etichettati come la nostra sonda. Soluzione salina tamponata di Gey (GBSS) è spesso sostituito da altri laboratori per la purificazione del sec. Mentre è utile per la purificazione SEC, l&#39;epatiteatocytes non tollerano GBSS così come buffer 1-3 e Viabilità non sono così alti. Quando si misura endocitosi, è buona per misurare i livelli di fondo in organo e in purificata epatociti. Questo metodo è uno dei due per la depurazione efficiente SECS dopo la perfusione del fegato con collagenasi. L&#39;altro metodo separa le cellule non-parenchimali per centrifugazione elutriation 19 anzichè il gradiente Percoll. I vantaggi per l&#39;utilizzo di elutriation su gradienti di Percoll sono Viabilità cellule leggermente più alta e numeri. Lo svantaggio è che centrifugazione elutriation richiede un rotore specializzato, centrifuga dedicata, e la pompa peristaltica insieme che costa decine di migliaia di dollari. Questo metodo richiede solo l&#39;uso di una centrifuga refrigerata da tavolo e la pompa peristaltica, che è standard in molti laboratori. Separazione di secondi e KC di adesione selettiva è un metodo standard20-22. Se è vero che SECS aderirà al vetro e plastica, il punto chiave è quello di utilizzare lavata con acido vetro pulito, con non più di 15 minuti di incubazione a 37 ° C al 5% di CO 2. KC sarà sempre più veloce di aderire secondi e si consiglia di lavare delicatamente il KC con i media per estrarre qualsiasi SECS rimanenti che si sono vagamente collegati. Pronasi e altre proteasi sono omessi dai passi della digestione collagenasi in questo protocollo per aumentare Viabilità delle cellule. Proteasi digerire recettori extracellulari e può inibire l&#39;adesione cellulare nelle fasi di purificazione finale. Il metodo presentato qui ha una grande varietà di applicazioni. Anche se si mostra il risultato finale in cui l&#39;eparina viene inizialmente assunto per la liquidazione, la perfusione del fegato per ottenere epatociti primari, KC, SECS, e CSE può essere utile per una serie di studi che coinvolgono vie metaboliche, immunoregolazione, attività scavenger, e altri Studi fisiologicies. La parte più difficile di questa procedura è incannulazione buona, la digestione del fegato, e la gestione del fegato senza avere la polizza catetere dalla vena porta.

<ul><li> Tampone 1: 142 mM NaCl 6,7 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5% di BSA, pH 7,4 </li><li> Buffer 2 (buffer di perfusione): 67.0 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 4,8 mM CaCl 2-H2O, 101,0 HEPES mM, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Tampone 3: 137 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM CaCl 2-2H 2 O, 10 HEPES mM, 1,5% di BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15 g / L BSA in RPMI </li><li> TRIS-buffered Saline (TBS): 154 mM NaCl, 10 mM sale Base Trizma. </li><li> Collagenasi: Collagenasi A (# 11088785103) da Roche, collagenasi di tipo I (# LS004691) da biochimici Worthington o Collagenasi I (# C0130) o IA (# C9891) di Sigma-Aldrich. </li></ul> Tutti i sali sono di Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Modello / catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Acqua del bagno 20L </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> L&#39;acqua è circa 45 ° C per compensare il raffreddamento </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> all&#39;interno del tubo. </td></tr><tr><td> Pompa peristaltica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex serie </td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Sorvall </td><td> Legenda XTR </td><td></td></tr><tr><td> Catetere </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Essiccatore camera </td><td> Pescatore </td><td> 08595E </td><td> Utilizzare una piastra interna </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 micron mesh </td><td> Spettro laboratori </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 micron mesh </td><td> Spettro laboratori </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilene glicole </td><td> Spettro di laboratorios </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Il fegato è il centro metabolico del corpo dei mammiferi e funge da filtro per il sangue. L&#39;architettura di base del fegato è illustrata in figura 1 in cui è composto oltre l&#39;85% della massa epatica di epatociti e il restante 15% della massa cellulare è composto da cellule di Kupffer (KCS), cellule stellate (HSC), e sinusoidale cellule endoteliali (SEC). SECS formano le pareti dei vasi sanguigni all&#39;interno del fegato e contengono morfologia specializzate chiamate Fenestrae all&#39;interno del citoplasma. Fenestrazione del citoplasma è la comparsa di buchi (~ 100 micron) all&#39;interno delle cellule in modo che l&#39;atto SECS come un setaccio in cui la maggior parte chilomicroni, i resti chilomicroni e macromolecole, ma non le cellule, passano attraverso la epatociti e HSC 1 (fig. 1). A causa della mancanza di una membrana basale, il divario tra i secondi e epatociti forma dello spazio di Disse. HSC occupare questo spazio e giocare un ruolo importante nella regolazione e la risposta di injury, stoccaggio di acido retinoico e immunoregolazione dei 2 fegato. SECS sono tra le cellule più endocytically attiva del corpo con un vasto insieme di recettori scavenger sulla loro superficie a 3 celle. Questi includono SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. In generale, le piccole particelle colloidali meno di 230 nm e macromolecole in fase di buffer sono ripreso da SECS, mentre le particelle più grandi e detriti cellulari è endocitosi (fagocitati) di KC 4. Così, la clearance maggior parte del materiale extracellulare come la glicosaminoglicani dal sangue è in gran parte dipende dalla salute e delle funzioni di endocitico SECS 5,6. Per esempio, un aumento dei livelli ematici di acido ialuronico è indicativo di malattia del fegato che vanno da lievi a forme più gravi 7. Con l&#39;eccezione di un rapporto di 8, non ci sono immortalati SEC linee cellulari esistenti. Anche questa linea di cellule immortalizzate è de-differenziareated in quanto non esprime recettori scavenger che sono presenti sul SECS primari (i nostri dati, non riportati). Tutti gli studi cellula biologica deve essere eseguita su cellule primarie appena ottenuto dall&#39;animale. Purtroppo, SECS dedifferentiate in condizioni di coltura standard e deve essere utilizzato entro 1 o 2 giorni su isolamento dall&#39;animale. Differenziazione delle SECS è segnata dall&#39;espressione di Stabilin-2 o recettori LEPRE 9, CD31, e la presenza di fenestrazione citoplasmatici 1. Differenziazione delle SECS può essere esteso con l&#39;aggiunta di VEGF nei terreni di coltura o da cellule in coltura degli epatociti mezzo condizionato 10,11. In questo rapporto, dimostreremo l&#39;attività endocitico di SECS nell&#39;organo intatto utilizzando radio-marcato eparina per acido ialuronico per la SEC specifici Stabilin-2 recettore. Ci sarà poi purificare epatociti e SECS dal fegato perfuso di misurare endocitosi.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

19.0K Views.  University of Nebraska, Lincoln. Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.

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Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for culturing or for obtaining cell lysates. In this protocol, the portal vein is used as the site for catheterization, rather than the vena cava, as this limits contamination of other possible cell types in the final liver preparation. No special instrumentation is required throughout the procedure. A water bath is used as a source of heat to maintain the temperature of all the buffers and solutions. A standard peristaltic pump is used to drive the fluid, and a refrigerated table-top centrifuge is required for the centrifugation procedures. The only limitation of this technique is the placement of the catheter within the portal vein, which is challenging on some of the mice in the 18 - 25 g size range. An advantage of this technique is that only one vein is utilized for the perfusion and the access to the vein is quick, which minimizes ischemia and reperfusion of the liver that reduces hepatic cell viability. Another advantage to this protocol is that it is easy to distinguish live from dead hepatocytes by eyesight due to the difference in cellular density during the centrifugation steps. Cells from this protocol may be used in cell culture for any downstream application as well as processed for any biochemical assessment.

The goal of this protocol is to obtain high viability and high yield of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from liver. This is accomplished by perfusing the liver with a type IV collagenase solution via the portal vein, followed by differential centrifugation to obtain hepatocytes and sinusoidal endothelial cells.

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

Ricerca

Biochimica

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto<em&gt; In situ</em&gt; Fegato perfusione

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Biologia

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Imaging intraoculare non invasivo in vivo di sferoidi epatici trapiantati nei topi

In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until now, optical imaging of the liver in situ is possible by intravital imaging, which offers high-resolution imaging at the cellular level but cannot be performed multiple times and, therefore, longitudinally in the same animal. Noninvasive imaging methods, such as bioluminescence, allow repeated imaging sessions on the same animal but do not achieve cell resolution. To address this methodology gap, we have developed a platform for noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. In the workflow described in this study, primary mouse liver spheroids are generated in vitro and transplanted into the anterior chamber of the eye of recipient mice, where they engraft on the iris. The cornea acts as a natural body window through which we can image the engrafted spheroids by conventional confocal microscopy. The spheroids survive for months in the eye, during which the cells can be studied in contexts of health and disease, as well as being monitored in response to different stimuli over repeated imaging sessions using appropriate fluorescent probes. In this protocol, we provide a breakdown of the necessary steps to implement this imaging system and explain how to best harness its potential.

Autore in primo piano: Sfruttare le camere oculari del topo per studi non invasivi sugli sferoidi epatici

Here, we describe a platform that allows noninvasive in vivo imaging of liver spheroids engrafted in the anterior chamber of the mouse eye. The workflow spans from generating spheroids from primary liver cells to transplantation into the mouse eye and in vivo imaging at cellular resolution by confocal microscopy.

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Biomedical studies of the liver in mammals are hindered by the lack of methods for in vivo noninvasive longitudinal imaging at cellular resolution. Until ...

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto

L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo

Imaging in vivo di sferoidi epatici trapiantati nella camera anteriore dell'occhio del topo