Gli epatociti primari di topo sono importanti negli studi sul fegato. Soprattutto per il metabolismo del glucosio e i test antidroga epatici. Per quanto riguarda il tempo, il processo di isolamento può richiedere molto tempo e l'energia costosa.
Questo protocollo può fornire un modo efficiente per isolare gli epatociti primari del topo. È tempo e lavoro amichevole. Richiede pochissimi passaggi con tutte le regioni disponibili in commercio.
Inizia usando la pompa peristaltica per iniziare a pompare acqua doppia distillata riscaldata ad una velocità di 4 ml al minuto, per cinque minuti. Quindi cambiare il tubo di pompaggio dall'acqua al mezzo di perfusione riscaldato. Monitoraggio della bolla d'aria tra l'acqua e il mezzo di perfusione.
Aiuterà a tracciare il flusso del mezzo di perfusione attraverso il sistema. Quindi disinfettare l'addome di un topo femmina C57 nero 6J anestetizzato di otto settimane con il 70% di etanolo. E usando una forbice, tagliare l'addome per esporre il fegato, la vena porta e la vena cava inferiore.
Quindi arrestare la pompa peristaltica. Dopo aver assicurato che il tubo di pompaggio contenga mezzo di perfusione e non acqua. Inserire un catetere calibro 24 nella vena cava inferiore.
Riaccendere la pompa e aprire la vena porta. Mentre il mezzo di perfusione viene pompato, premere la vena porta ogni minuto per consentire al liquido di raggiungere ogni angolo del fegato. Continuare a pompare per circa tre o cinque minuti o fino a quando il liquido svuotato è limpido.
Quindi cambiare il tubo di pompaggio dal mezzo di perfusione al mezzo di distribuzione della collagenasi. E premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato. Continuare a pompare fino a quando tutti i 25 ml del mezzo di distribuzione della collagenasi sono esauriti.
Quindi isolare l'intero fegato senza la cistifellea. E lo ha messo in 30 ml di mezzo di lavaggio in una capsula di Petri su ghiaccio. Usando la pinza strappare il fegato in pezzi per rilasciare epatociti primari nella soluzione.
In questa fase, il mezzo di lavaggio si trasforma in una soluzione torbida contenente epatociti primari rilasciati e piccoli pezzi di fegato. Filtrare questa soluzione torbida attraverso un filtro cellulare da 70 micron, in 20 ml di HBSS 1X per chiamata in un tubo da 50 ml su ghiaccio. E mescolare la soluzione invertendo il tubo 20 volte.
Quindi centrifugare la soluzione. Quindi, nel cappuccio della coltura del tessuto, aspirare il surnatante. E lavare il pellet con 30 ml di mezzo di lavaggio a freddo.
Pellet le celle ancora una volta con centrifugazione. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente il pellet in 25 ml di terreno di coltura. Contare le cellule e placcarle sulle piastre di coltura desiderate.
Secondo il disegno sperimentale. Dopo la placcatura, gli epatociti primari isolati sono stati saldamente attaccati di un'ora e completamente espansi dopo 12 ore. Negli epatociti isolati, i livelli di mRNA dei marcatori epatocitari, come transtiretina, CD95, ASGR1 e ASGR2, sono aumentati significativamente rispetto all'intero fegato.
Al contrario, la presenza di cellule immunitarie, cellule stellate e cellule endoteliali era inferiore. Come evidenziato da una forte diminuzione dei livelli di CD45, collagene di tipo 1 alfa 1 e mRNA della cellula endoteliale 2 chinasi 2. Suggerendo che questo protocollo può ridurre notevolmente l'interferenza da altre cellule epatiche.
Dopo la placcatura i livelli di ASGR1 e ASGR2 sono diminuiti con il tempo, ma rimangono paragonabili a tutto il fegato fino al punto temporale di 12 ore. Soprattutto per ASGR1. Il livello di espressione di CD81 legato alla membrana è stato costante fino a 48 ore.
In confronto, l'espressione del recettore toll-like 4 è generalmente aumentata ed è diventata superiore ai livelli in vivo dopo 48 ore. I saggi di sensibilità all'insulina hanno dimostrato che l'insulina ha promosso significativamente la fosforilazione di entrambi gli AKT alla serina 473. E la scatola forkhead 01 alla serina 256, negli epatociti.
Indicare la sensibilità degli epatociti primari all'insulina. I livelli di proteina fosfoenolpiruvato carbossichinasi sono aumentati significativamente dopo il trattamento con glucagone. Suggerendo che la via di produzione del glucosio è stata attivata.
Questa attivazione è stata ulteriormente confermata dall'aumento della produzione di glucosio. E con altri stimolatori della produzione di glucosio come Forskolin + IBMX. Questo protocollo può far risparmiare tempo ed energia per gli studi che utilizzano epatociti primari di topo.
Seguendo questo protocollo, possono essere condotti esperimenti correlati come l'ipotetico metabolismo del glucosio e i saggi dei biomarcatori farmaceutici.
