Finanziamento è fornito in parte dal NIH da grant R01HL130864.

Tutte le procedure degli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso l'Università di Lincoln - Nebraska sotto protocollo #1435.
1. preparazione
<ol><li>Preparazione di terreni di coltura e soluzioni<ol>
<li>Preparare tutti i terreni di coltura e tampone secondo la Tabella dei materiali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di strumenti<ol>
<li>Impostare un bagno d'acqua (> 10 L) a 42 ° C, una pompa peristaltica con velocità variabile e morsetti per lo svolgimento di boccette. Preparare le forbici curve e forcipe (Figura 1).</li>
		<li>Su o adiacente al bagno d'acqua, impostare una teglia da forno (circa 38 x 26 cm) con un pad di polistirolo (cremagliera conica 50 mL), sovrapposto con un assorbente underpad tagliate un pezzo di 20 x 20 cm (Figura 1).</li>
		<li>Posizionare un pezzo di nastro adesivo (5-8 cm) nelle vicinanze. Posto un cucirino Poliestere 20cm nelle vicinanze che è tagliato e pronto all'uso. Ottenere un catetere di plastica con un ago retrattile (7 mm x 19 mm, Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di oggetti di vetro<ol>
<li>Con fascette, posizionare e immobilizzare una L 1 pallone nel bagno d'acqua che contiene 200 mL di 1X PBS con un tappo che ha due pipette da 1 mL andando nella soluzione. Il tappo di gomma è dentellato per consentire il ricircolo del fluido in un circuito chiuso.</li>
		<li>Con un altro morsetto, posto una bottiglia di 125 mL contenente 45 mL di tampone 2 insieme con un tappo che ha due pipette da 1 mL, uno dei quali è nel liquido nella parte inferiore del pallone e l'altro che rimane sopra il liquido e soffia ossigeno nel pallone. Nota: Ogni pipetta nei tappi avrà un rapido scollegare l'adattatore collegato alla fine per il facile passaggio del tubo. Ossigeno sarà delicatamente che scorre in entrambi palloni tramite la pipetta nel tappo che non è immerso nel liquido.</li>
		<li>Mettere da parte due piatti di cristallizzazione sterile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. procedura animale
<ol><li>Riscaldare le soluzioni PBS e Buffer 2 a 42 ° C nel bagno d'acqua e circolare PBS per almeno 20 mL/min della tubazione a circuito chiuso per mantenere le linee di liquide caldo. Immergere ogni tubo in eccesso nel bagno d'acqua a rimanere più vicino possibile a 42 ° C. Drenare l'estremità maschio del tubo nel PBS contenente L 1 boccetta.</li>
	<li>Posizionare un batuffolo di cotone sul underpad assorbente e aggiungere circa 2 mL di 30% isoflurane (composta in polietilene glicole 200 che diminuisce il tasso di evaporazione di isoflurane) sul batuffolo di cotone con una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Sollevare il mouse per la coda, inserirlo in uno dei piatti di cristallizzazione e quindi rapidamente rovesciare il piatto sopra la palla di cotone, così che il mouse ha un piccolo spazio in cui inalare l'anestesia. Osservare la frequenza respiratoria del mouse e verificare che il mouse viene efficacemente nell'ambito dell'anestesia. Nota: La frequenza respiratoria dovrebbe essere più lento e più profondo, la coda flaccido e le zampe non rispondono alla prova di pizzico sotto anestesia; Vedi linee guida IACUC per ulteriori dettagli.</li>
	<li>Mentre il mouse è in corso nell'ambito dell'anestesia (questo richiede 1-2 min), preparare la canna di una siringa da 10 mL tirando fuori lo stantuffo e inserendo un batuffolo di cotone piccolo. Aggiungere 1-2 mL di 30% isoflurane con una pipetta di trasferimento per il batuffolo di cotone all'interno della canna e posizionare la canna fissa giù su un tavolo durante l'attesa per il mouse a diventare inconscio.</li>
	<li>Rapidamente togliere il piatto di cristallizzazione, capovolgere il mouse sul dorso e posizionare il corpo della siringa sul suo naso. Doppio controllo il tasso di respirazione, pizzico di punta e coda flaccida. Tutte le risposte per il pizzico di punta e coda flaccida indica che il mouse non è completamente sotto anestesia. Tenere la siringa sopra il muso per mantenere uno stato di incoscienza.</li>
	<li>Puntine di luogo attraverso le zampe del mouse, con le membra tesato in posizione supina. Bagnare l'addome e la gabbia toracica con 70% isopropanolo o etanolo.</li>
	<li>Con il forcipe dritto in una mano, sollevare la pelle vicino alla base dell'addome. Con le forbici in mano, tagliare la pelle tenda e il peritoneo. L'incisione deve essere orizzontale o attraverso la base della pelle tenda. Assicuratevi di tagliare attraverso tutti gli strati della pelle e del peritoneo per poter accedere all'intestino. Tagliare lateralmente intorno all'addome fino alla gabbia toracica su entrambi i lati senza intaccare qualsiasi organo.</li>
	<li>Tagliato il lembo di pelle dal taglio attraverso la gabbia toracica inferiore. Spostare l'intestino a destra con la parte posteriore delle pinze per esporre la vena portale. Nota: Sanguinamento dall'animale dovrebbe essere minimo; l'animale deve essere ancora respirando e sotto anestesia profonda.</li>
	<li>Posizionare il forcipe curvo chiuso sotto la vena portale tra il fegato e la vena pancreaticoduodenale superiore (freccianella figura 3 ).</li>
	<li>Aprire la pinza mentre sotto la vena portale. Afferrare il filo e passarlo attentamente affinché sia centrato sotto la vena portale. Legare un nodo semplice intorno alla vena portale senza cinching esso giù.</li>
	<li>Posizionare il forcipe curvo sotto la vena portale e tirarlo delicatamente verso la coda del mouse per raddrizzare la vena (Figura 4A).</li>
	<li>Con il catetere in altra mano, posizionare la smussatura dell'ago a faccia in su e in parallelo con la parte inferiore della vena portale vicino il forcipe (Figura 4B).</li>
	<li>Delicatamente la puntura della vena con l'ago (Figura 4C). Garantire che la smussatura dell'ago è nel lume della vena. Ritirare l'ago a molla e continuare a spingere il catetere di polimero attraverso la vena fino a quando la smussatura è vicino alla zona di ramificati venosa. Questo è all'interno del fegato. Se il catetere è posizionato correttamente, è possibile che un riflusso di sangue sarà visibile. (Figura 4D).</li>
	<li>Stringere il nodo alla marinara e tirare verso il basso sul catetere per contribuire a stabilizzare esso. Immediatamente girare verso il basso il tasso di pompa da 20 mL/min a 4 mL/min e tagliare un altro vaso sanguigno principale per il drenaggio. Tagliare il centrifugalis dell'aorta per ottenere risultati ottimali.</li>
	<li>Inserire l'estremità maschio del tubo per l'estremità femmina del catetere (Figura 5A). Assicurarsi che non siano senza bolle d'aria nella linea. Fare attenzione che il catetere non è neppure spinto nel fegato o out of the vein. Posizionamento del thread non è essenziale, anche se aiuta a prevenire il riflusso out of the vein e aiuta a mantenere il catetere nella posizione corretta (Figura 5B, C).</li>
	<li>Utilizzare nastro adesivo per immobilizzare il tubo sulla traversa. Utilizzare il forcipe dritto per spremere il vaso sanguigno degli effluenti per gonfiare il fegato un paio di volte a garantire tutto il sangue fuoriuscire(Figura 5). Nota: Il nastro di laboratorio Standard potrebbe non funzionare; Tuttavia, nastro adesivo rimarrà bloccato per underpad, anche in condizioni di bagnato.</li>
</ol>3. fegato perfusione
<ol><li>Mentre il fegato è di lavaggio con PBS, misurare circa 24 mg di collagenasi di tipo IV e posizionarlo nel matraccio contenente 45 mL di tampone 2 nel bagno d'acqua. Essere sicuri di turbinio il liquido nel pallone, affinché la collagenasi sia completamente dissolto e posizionare il pallone indietro nel morsetto in modo che la parte liquida contenente del pallone è completamente immersa nell'acqua.</li>
	<li>Osservare il cambiamento di colore del fegato come esso viene svuotata con PBS. Cambiare il tubo di deflusso dalla beuta 1l al pallone da 125 mL. Non lasciare bolle d'aria di fluire nel fegato.</li>
	<li>Una volta che il buffer di perfusione raggiunge il fegato, brevemente spremere stretto il vaso sanguigno degli effluenti per costruire un po' di pressione all'interno del vaso e consentire questo liquido riempire tutti i lobi del fegato. Essere sicuri di non tagliare troppo a lungo, di drenaggio come che potrebbe scoppiare il sottile tessuto connettivo che circonda il fegato (capsula di Glisson) e distruggere la perfusione o il flusso di liquido all'interno del letto capillare del fegato.</li>
	<li>Consentire 2 Buffer con collagenasi per irrorare attraverso il fegato, fino a quando tutti i 45 mL fluito attraverso il tessuto. Nota: In caso di successo, capsula di Glisson deve essere separato dal parenchima o tessuto del fegato e il fegato stesso dovrebbe apparire amorfo.</li>
	<li>Aggiungere circa 10 mL di tampone 1 altro piatto il cristallizzazione e posizionarlo accanto al mouse.</li>
	<li>Rimuovere il catetere e spegnere la pompa.</li>
	<li>Con il dritte pinze e le forbici, tagliare il fegato dal mouse. Se la digestione della collagenosi era molto efficiente, può essere necessario avere un cucchiaio pulito, sterile pronto a scoop il fegato dal mouse e posizionarlo in Buffer 1.</li>
</ol>4. dell'epatocita purificazione
Nota: La manipolazione delle cellule vengono eseguiti in una cappa sterile coltura tissutale per limitare la contaminazione se le celle sono di essere colta in tutti i passaggi successivi.
<ol><li>Utilizzando una tecnica sterile, afferrare il fegato con il forcipe e agitare delicatamente le cellule dal fegato. Lacerare o tirare indietro la capsula di Glisson: buffer diventerà opaco come le cellule sono scossi dal fegato.</li>
	<li>Versare la soluzione di cella in un 50 mL conica con un 100 µm filtro posto sopra la parte superiore.</li>
	<li>Aggiungere più Buffer 1 ai resti del fegato e continuare a scuotere fuori le cellule. Continuare fino a quando il fegato appare privo di cellule o quando le parti non digerite del fegato non danno piu ' cellule.</li>
	<li>Versare il liquido cellulare in un altro 50 mL conico contenente un filtro di 40 µm.</li>
	<li>Centrifugare la conica in un rotore oscillante a 100 x g per 3 min. Nota: Non utilizzare il freno massimo come questo può sloggiare il pellet cellulare. Usare il freno all'80%, che è sufficiente per tutti i passaggi rimanenti di centrifugazione a 4 ° C</li>
	<li>Versare il sovranatante (che contiene gli NPC ed epatociti morti) in un pulito conico e posizionarlo sul ghiaccio. Garantire che ciò avvenga in un unico movimento per osservare l'aderenza della pallina.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 40 mL di tampone 1. Ripetere i passaggi da 4.5 e 4.6. Risospendere il pellet in 40 mL di tampone di 3. Ripetere i passaggi da 4.5 e 4.6 due volte.</li>
	<li>Risospendere gli epatociti purificati in caldo DMEM + 10% FBS + 2 x penicillina-streptomicina (Pen/Strep).</li>
	<li>Se le cellule sono coltivate su piastre di collagene rivestito, permettere loro di aderire per 1 h e sostituire i media almeno una volta come questo impedirà eventuali contaminanti batterici nascente.<ol>
<li>Rendere le piastre di collagene rivestito di incubarle con collagene 0.05% in acido acetico 0.001% per almeno 1 h a 37 ° C e successivamente lavate con PBS 1X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se la vitalità dell'epatocita è bassa e c'è un desiderio di ottenere epatociti vitali alta purificati quindi utilizzare il seguente protocollo adattato da Kreamer et al10.<ol>
<li>Mix 9 volumi di soluzione PVP (Percoll, una soluzione di p/p di 23% di acqua e particelle di silice colloidale di 15-30 nm rivestite in polivinilpirrolidone per centrifugazione di densità) e 1 volume di 10 x HBSS per rendere una soluzione isoosmotica PVP (SIP).</li>
		<li>Aggiungere mL 24 di SIP a una sterile 50 mL conica che può essere memorizzato in queste condizioni fino a 2 mesi a 4 ° C.</li>
		<li>Regolare la concentrazione dell'epatocita a 5-10 × 106 cellule/mL con terreno di coltura come quello indicato al punto 4.8.</li>
		<li>Aggiungere 25 mL di sospensione cellulare per ogni mL 24 SIP contenente conico e mescolare capovolgendo. La densità di questa soluzione è 1,06 g/mL.</li>
		<li>Centrifugare la conica a 50 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Aspirare il SIP e flocculante e risospendere le cellule in HBSS.</li>
		<li>Lavare le cellule mediante centrifugazione a 50 x g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.10.6 ancora una volta e quindi risospendere le cellule in coltura.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SEC purificazione
<ol><li>Agglomerare le cellule nei surnatanti dal passaggio 4.6 facendo girare i tubi a 163 x g per 10 min. scartare i surnatanti dai tubi e risospendere tutti delle palline delle cellule in 5 mL di RPMI senza siero e li riunire in una provetta.</li>
	<li>Una volta che tutti i pellet sono stati riuniti, aggiungere RPMI al volume finale di 35 mL.</li>
	<li>Centrifugare il pool conica a 25 x g per 3 min. Aspirare accuratamente la top 25 mL di RPMI con una pipetta da 25 mL e posto questo NPC che contenevano in un pulito 50 mL conica sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 25 mL di RPMI fresco torna alla provetta e risospendere il pellet.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 5.3 per un secondo lavaggio e piscina il supernatante. Scartare i rimanenti 10 mL di media e pellet (il pellet consiste principalmente di epatociti morti). Centrifugare il supernatante in pool a 163 x g per 10 min.</li>
	<li>Durante la centrifugazione, preparare i gradienti di soluzione PVP in un 50 mL conica.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di soluzione di PVP del 50% per i 50 mL conico seguita da 20 mL di Percoll overlaid con un pipettatore impostato la più lenta velocità di espulsione il 25%. Assicurarsi di osservare una linea di rifrazione al mark 15 mL che delimita i due strati, come questo è dove il SECs e KCs aggregherà dopo la centrifugazione.</li>
	<li>Risospendere le cellule precedentemente pellettate in punto 5.5 in 10 mL di RPMI freddo e le rivestirai sul gradiente di soluzione PVP. Assicuratevi di mantenere una netta demarcazione tra i due strati. Centrifugare la sfumatura a 805 x g per 20 min con un freno fissato al 50%.</li>
	<li>Aspirare dall'alto verso il basso direzione fino alla tacca di 20 mL sul tubo ed eliminare questo materiale. Con una pipetta di trasferimento di 5 mL, raccogliere il SECs e KCs che si trovano nell'interfaccia di 25/50%. Scartare qualsiasi marrone grumi di cellule come queste sono morti epatociti.</li>
	<li>Mettere le cellule in un 50 mL conica e aggiungere RPMI fino al contrassegno di 50 mL per diluire la soluzione di PVP. Centrifugare a 200 x g per 10 min, con freno di 80%.</li>
	<li>Aspirare e scartare il surnatante e risospendere il pellet durante il lavaggio fuori del cono della conica in 12 mL di RPMI caldo.</li>
	<li>Separare il SECs da KCs inserendo il surnatante in una capsula di Petri di polistirolo e incubare in un incubatore umidificato coltura tissutale per 8 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare i media con una pipetta da 25 mL e sciacquare la piastra con gli stessi mezzi, con il pipettatore impostato alla velocità minima per raccogliere i restanti SECs mentre la KCs aderire alla piastra.</li>
	<li>Centrifugare il SECs a 200 x g per 10 min e risospendere in RPMI + 5% FBS + Pen/Strep. Quindi titolo le cellule e posto in piastre di coltura rivestite con collagene.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo mette in evidenza gli strumenti che sono disponibili e che offrirà all'utente un alto tasso di successo in questa procedura. Un'aspersione di successo è fondamentale per qualsiasi applicazione a valle quando si lavora con le cellule primarie.
Ci sono alcuni punti critici della procedura che determinano il successo. In primo luogo, il posizionamento della punta del catetere all'interno della vena portale deve essere corretto. Se posizionata troppo lontano all'interno del fegato, solo i lobi secondari saranno perfusi. Il suggerimento dovrebbe essere appena sotto i rami di destro e di sinistro della vena portale. Il vantaggio di utilizzare un catetere di polimero composito sopra un ago è che la sbavatura dell'ago è più probabile strappare la vena durante la perfusione di un catetere. In secondo luogo, quantità e la qualità della collagenosi determinare l'efficienza di digestione del fegato. In questa procedura, è stato utilizzato pre-qualificati collagenasi tipo 4 e si è risospeso a 0,5 mg/mL in tampone 2 se l'attività della collagenosi deve essere analizzato è maggiore di 900 UI.
Alla fine della perfusione della collagenosi, il fegato deve mantenere un'abbronzatura un po' scura a colore marrone. Se è un colore marrone chiaro, la maggior parte degli epatociti sono morta. Il fegato dovrebbe essere cade a pezzi quando tagliato dal mouse. Nelle migliori condizioni, il fegato può essere scavato fuori della cavità di corpo del mouse con un piccolo cucchiaio. Fegati in questa condizione sempre dare vitalità cellulare molto alta. Se ci vuole molto sforzo per scuotere le cellule a parte, se il fegato è ancora fermo durante l'estrazione, o se c'è un sacco di forza necessaria per spostare gli epatociti attraverso i filtri, gli epatociti avrà una redditività inferiore. Gli epatociti sono coperti con i microvilli, che permette loro di avere una superficie molto alta (Figura 10). Digestione incompleta conserva giunzioni della cellula-cellula tra epatociti e tosatura meccanica sarà lacerare la membrana plasmatica. Aspersione in situ con collagenasi è il metodo migliore per spezzare le cellule e mantenere alta redditività. Nella Figura 11, due dell'epatocita preparazioni sono fatte in quale cella pellet sono stati confrontati dopo alcuni lavaggi in tampone 1. Il pellet a sinistra è più leggero e contiene una vitalità cellulare del 50% circa. Il pellet a destra è più scuro e ha una vitalità del 92%. Allo stesso modo, quando il liquido è versato da 50 mL conica, il pellet più scuro è fermo all'interno del tubo, in contrasto con il pellet più leggero, che farà scorrere nel tubo come il liquido è versato fuori. La vitalità cellulare inferiore o le aspersioni inefficiente possono verificarsi quando il fegato ha livelli elevati di sclerosi.
Poiché gli epatociti dal vivo hanno una densità maggiore rispetto gli epatociti morti, le procedure di centrifugazione si tradurrà in una preparazione che è altamente pura in epatociti vitali15. Se c'è una quantità significativa di epatociti morti (che spesso si verifica quando le condizioni non ottimali), dal vivo cellule possono essere ulteriormente arricchite e separate dalle cellule morte utilizzando sfumature PVP. Inoltre, poiché gli epatociti dal vivo a pellet più veloce di epatociti morti, aspirazione del top 3rd del pellet aumenterà anche il rapporto di diretta per le cellule morte nel pellet. Queste procedure sono veloci e semplici metodi per separare vivono dagli epatociti morti e detriti quando necessario di cella10,16. Questo è particolarmente utile se il campione è prezioso, e solo poche milioni cellule sono necessari per l'esperimento.
In conclusione, questo è un metodo facile ed efficiente per la raccolta di epatociti e SECs dal fegato. A prezzi correnti, il costo di esecuzione di questa procedura compreso tutti i reagenti e prodotti monouso è inferiore ai 75 USD a preparazione. Se più mouse sono desiderati, si consiglia di procedere con la purificazione dell'epatocita e mantenere la frazione NPC su ghiaccio fino a quando tutti i topi sono stati elaborati. I PNG sono in genere stabili sul ghiaccio per almeno 5 ore, ma tempi più lunghi non sono stati testati in questo laboratorio.

Collagenasi aspersione del fegato per ottenere epatociti è stata effettuata dal primi anni 1950 ed è stato continuamente migliorato1,2,3,4. Una bella recensione di molte delle metodologie, tecniche e dei reagenti utilizzati nella purificazione delle cellule di fegato è stata compilata in Meyer et al.5. Ottenere un rendimento soddisfacente dei hepatocytes altamente praticabile e SECs è tecnicamente impegnativo. Le forze meccaniche che separano le celle tra cui la qualità della collagenosi sono alcune delle variabili che sono difficili da controllare. Dovuto la sensibilità dell'epatocita a forze meccaniche, la loro sopravvivenza è marcatamente ridotto in condizioni sub-ottimali, che richiede la necessità di un protocollo che descrive le condizioni ottimali per l'isolamento. SECs non sembrano essere sensibili ai meccanici di taglio. Aspersione in situ con digestione della collagenosi è di gran lunga il metodo migliore per interrompere giunzioni della cellula-cellula per ottenere preparazioni di singole cellule di fegato e altri organi come l'intestino e milza6. Questo protocollo viene illustrato un metodo semplice per l'introduzione di buffer di aspersione nella vena portale utilizzando un catetere di plastica retraibile, piuttosto che un'incisione che potrebbe causare la vena porta al collasso, come descritto in Smedsrød et al.7.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di illustrare i passaggi più critici richiesti per il successo della procedura profusione del fegato. Tali passaggi includono la disposizione del catetere, flusso di liquidi di perfusione e manipolazione del tessuto dopo la digestione. Le portate sono regolati sopra il tasso naturale di flusso sanguigno, ma abbastanza basso per mantenere intatta la capsula di Glisson. Una volta che il fegato è digerito correttamente e le cellule sono separate in soluzione, purificazione cellulare è relativamente semplice se viene eseguito tramite centrifugazione differenziale, adesione di piastra, o di purificazione di biglie magnetiche. Epatociti dal vivo hanno una maggiore densità e facilmente sono purificati dalle cellule parenchimale (NPC) e morti epatociti con centrifugazione a bassa velocità. Per la maggior parte delle applicazioni, adesione di piastra per la separazione di Kupffer cellule (KCs) e SECs è un metodo comune8, anche se ci sono rapporti che non produce la migliore purezza di SECs9. KCs hanno la tendenza ad aderire a superfici rigide solide in fretta e capsule di Petri (standard polistirolo) sono il materiale più comunemente utilizzato per questa procedura. Purificazione di SEC o KC con l'uso di biglie magnetiche anticorpo coniugato è senza dubbio il metodo migliore per purificazione significativo di queste cellule, anche se la procedura consente di aggiungere un altro 3-4 h su questo protocollo e la resa è in diminuzione9. Questa relazione illustra in dettaglio il processo per un'ottimale perfusione del fegato che produce in genere un elevato numero di cellule vitali.

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1 L Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter.</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>R3603</td><td>Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector.&amp;nbsp; This may also be used for the oxygen tubing.</td></tr><tr><td>T-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06294-82</td><td></td></tr><tr><td>Quick dissconnects</td><td>Fisher Scientific</td><td>6150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pinch Clamps</td><td>Fisher Scientific</td><td>6165-0002</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07559-00</td><td>Periplastic pump with variable speed</td></tr><tr><td>Pump head, model 7014-20</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07014-20</td><td></td></tr><tr><td>glass graduated 1.0 mL pipettes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678</td><td></td></tr><tr><td>curved non-serrated scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14069-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-23</td><td>Only barrel of syringe will be needed</td></tr><tr><td>sterlized spoon</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton ball(s)</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyester sewing thread</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masking tape</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>thumb tacks</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>styrofoam pad&amp;nbsp;</td><td>50 mL conical rack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cookie/baking sheet</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbant underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-64</td><td></td></tr><tr><td>19 L water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSCOL19</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage</td><td>Becton Dickinson</td><td>381412</td><td>Plastic cathetar with retractable needle</td></tr><tr><td>Crystallizing dishes 100x50</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89000-290</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene petri dishes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipettes (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipettes (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>170357</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer 100 &amp;mu;M</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>100 &amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>EasyStrainer 40 &amp;mu;M</td><td>Greiner bio-one</td><td>542040</td><td>40&amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>Sterile transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated swinging bucket centrifuge</td><td>Sorvall Legend XTR</td><td>75-217-406</td><td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td></tr><tr><td>Galaxy 170R tissue culture incubator&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO170R-120-0000</td><td>Humidified tissue culture incubator</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Grams (g/L)&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Millimolar (mM)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Buffer 1, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8.3</td><td>142</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.5</td><td>6.7</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>2.4</td><td>10</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td>Buffer 2, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>3.9</td><td>66.74</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.5</td><td>6.71</td></tr><tr><td></td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>0.7</td><td>6.31</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>24</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td></td><td>Phenol Red</td><td>0.01</td><td>0.03</td></tr><tr><td>Buffer 3, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8</td><td>137</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.35</td><td>4.7</td></tr><tr><td></td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>0.08</td><td>0.66</td></tr><tr><td></td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>0.18</td><td>1.62</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>2.4</td><td>10</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8</td><td>137</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.2</td><td>2.7</td></tr><tr><td></td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>1.15</td><td>4.3</td></tr><tr><td></td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>0.2</td><td>1.4</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Percoll (PVP solution)</td><td>GE Healthcare</td><td>288555</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab144581</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hepatocyte Growth Medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Long-term Hepatocyte Growth Medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G3157-2mg</td><td>14 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td>0.5 U/mL</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1g</td><td>7.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>BD Biosciences</td><td>354001-100ug</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LSEC medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion

Questo protocollo viene illustrato un metodo per ottenere ad alto rendimento e redditività per mouse epatociti e cellule endoteliali sinusoidali (SECs) adatte per la coltura o per l'ottenimento di lisati cellulari. In questo protocollo, la vena viene utilizzata come il sito per cateterizzazione, piuttosto che la vena cava, come questo limita la contaminazione di altri tipi cellulari possibili nella preparazione finale del fegato. Nessuna strumentazione speciale è richiesta durante la procedura. Un bagno d'acqua è usato come una fonte di calore per mantenere la temperatura di tutti i buffer e soluzioni. Una pompa peristaltica standard è usata per guidare il fluido, e una centrifuga refrigerata tavolo è necessaria per le procedure di centrifugazione. L'unica limitazione di questa tecnica è il posizionamento del catetere all'interno della vena portale, che è una sfida su alcuni dei topi nell'intervallo di dimensioni di 18-25 g. Un vantaggio di questa tecnica è che solo una vena è utilizzata per l'aspersione e l'accesso alla vena è rapido, che riduce al minimo l'ischemia e la riperfusione del fegato che riduce l'attuabilità delle cellule epatiche. Un altro vantaggio di questo protocollo è che è facile da distinguere dal vivo dagli epatociti morti vista a causa della differenza nella densità cellulare durante le fasi di centrifugazione. Le cellule da questo protocollo possono essere utilizzate nella coltura cellulare per qualsiasi applicazione a valle come pure trattate per qualsiasi valutazione biochimica.

Un metodo dimostrativo, raffinato per aspersione epatica e purificazione/arricchimento dei hepatocytes e SECs è presentato qui che fornisce suggerimenti dettagliati per cellulare ottimale purificazione/arricchimento simile ad altri report stampato, compilato in questo riferimento Scrivi una recensione su 5. I punti critici che determinano il successo per purificazione cellulare si verificano nel percorso e dettagli tecnici della procedura di aspersione di collagenasi e sono descritte in questo protocollo. Il set-up per l'apparato è abbastanza semplice e conveniente con normale attrezzatura da laboratorio, a differenza di altri sistemi che sono stati pubblicati11 (Figura 1). In questo set-up, il vassoio tenendo premuto il mouse è posizionato su bagno d'acqua con alcuni del tubo in eccesso nel bagno d'acqua per mantenere la temperatura dei liquidi che irrora all'interno del fegato. L'apparecchio come illustrato di seguito può essere utilizzato per topi e ratti, con una geometria leggermente diversa per aspersione del fegato di ratto12 (Figura 2).
In questa procedura, il fegato è irrorato tramite vena portale invece la vena cava (che è un altro itinerario di aspersione popolare) grazie alla sua facilità di accesso all'interno dell'addome e che la vena alimenta direttamente il fegato. Lo spettatore deve essere consapevole che la vena portale ha parecchi piccoli rami che possono cortocircuitare il perfusato e il catetere deve essere posizionato in passato questi rami per successo ottimale13 (Figura 3). Una volta individuata la vena portale, forcipe curvo vengono utilizzato per disegnare una sutura chirurgica o filo di poliestere sotto la vena portale tra il fegato e la vena pancreatico-duodenale superiore. Le pinze sono utilizzate anche per raddrizzare la vena che è sotto pressione positiva (Figura 4A). L'ago all'interno del catetere deve essere collocata parallelamente e accanto la vena (Figura 4B) e lo smusso deve essere delicatamente inserito nel lumen della vena (Figura 4C). Posizionamento corretto sarà indicato dal sangue che appaiono lungo il catetere. Una volta che l'ago sia retratto il catetere deve essere stabilizzato con un filo legato su di essa e la pressione sanguigna costringerà sangue fino attraverso il catetere. È consigliabile che il catetere essere collegato al tubo della pompa prima di sangue si riversa (Figura 4D). Una volta collegato il tubo della pompa, immediatamente tagliare un vaso sanguigno principale come la vena cava o dell'aorta centrifugalis per drenaggio del sangue/liquido (Figura 5A). È solitamente necessario tagliare il lato della parete addominale del mouse per drenaggio sufficiente, come un accumulo di sangue nell'addome rende difficile visualizzare il processo di aspersione e sangue può continui nella purificazione delle cellule (Figura 5 B). una volta che il PBS comincia a irrorare il fegato, il fegato sarà scottate con l'assenza di sangue (Figura 5C). Se solo alcuni dei lobi blanch, la causa più probabile è che il catetere è stato inserito troppo lontano all'interno del fegato e avrà bisogno di essere tirata indietro lentamente. Una volta che il posizionamento del catetere è confermato, è possibile utilizzare nastro adesivo resistente all'acqua per proteggere il tubo in luogo. Laboratorio generale nastro non è solitamente sufficiente. Per confermare il corretto posizionamento del catetere, spremere il taglio vaso sanguigno per cessare di drenaggio e osservare l'aumento della pressione all'interno del fegato. Questo sarà di aiuto nel lavaggio del sangue dal fegato(Figura 5). Questo dovrebbe essere fatto anche quando la soluzione di collagenasi inizialmente va nel fegato per garantire che tutti i lobi sono esposti a collagenosi. Dopo la collagenosi soluzione SCADA, una digestione della collagenosi buona è indicativa di separazione della capsula di Glisson dal parenchima.
La procedura generale per purificazione cellulare è descritta nella Figura 6 e Figura 7 in cui gli epatociti sono raccolti all'inizio della procedura durante la bassa velocità giri e sono molto puro dopo 4 lavaggi nei buffer contenente BSA (Figura 8 ). Secondi sono co-purificati con KCs su una pendenza PVP (Figura 9A) e poi separati da adesione selettiva su un polistirene rivestite con collagene di Petri. La purezza di SECs utilizzando questo metodo è puro di 83-90% e dipende in gran parte l'efficacia complessiva della digestione della collagenosi (Figura 9B). Misurazioni quantitative utilizzando luce microscopia (come gli epatociti ed in sec hanno caratteristiche distintive da altre cellule) dimostrano che in una preparazione rappresentativa, gli epatociti sono quasi il 100% di puro e SECs sono appena oltre 89% puro (tabella 1). In alternativa, un maggiore arricchimento di SECs può essere ottenuto tramite la separazione magnetica colonna dopo la sfumatura PVP, sebbene che esula dall'ambito del presente protocollo. Ulteriori informazioni su separazione magnetica di SECs e KCs possono essere trovati in Meyer et al. 9 e Liu et al. 14 va ricordato che vitalità degli epatociti diminuisce rapidamente in un fegato insufficientemente digerito, ma questo non è necessario true per la NPC. fegati insufficientemente digeriti anche producono detriti più cellulari, che non sono del tutto eliminata la procedura di centrifugazione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentazione schematica della suite aspersione. Le beute sono tenute in posizione da morsetti (non mostrati); i tubi contenente fluido viene scambiato dalla beuta 1l al pallone da 125 mL durante la procedura sono rappresentato dalla linea tratteggiata rossa. Nota, che alimentano l'ossigeno non bolla direttamente nelle soluzioni in beute. I tappi dovrebbero anche essere conquistati per consentire il flusso di un fluido a circuito chiuso con il tubo inserito all'interno della tacca. Questo è fondamentale durante il riscaldamento del tubo e per l'espulsione di tutta l'aria all'interno del tubo. Lo spurgo dell'aria è composto di connettore a T che è collegato alla tubazione di Tygon e pizzico morsetti per rapida aprire e chiusura del sistema. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig2.jpg"> Figura 2 : La suite di aspersione durante l'aspersione del fegato del mouse. Il vassoio con il mouse è posizionato all'angolo del bagno d'acqua. L'ossigeno viene disconnesso dalla soluzione della collagenosi come che era già ossigenato durante il warm-up. Posizione degli elementi sono A) ossigeno linee, L B) 1 pallone contenente PBS, pallone da C) 125 mL contenente tampone 2 con collagenasi, D) pompa, controlli E) pompa, gorgogliatore F), G) fluido linea in esecuzione dalla beuta, attraverso la pompa e il mouse. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig3.jpg"> Figura 3 : Immagine del sistema vascolare dell'addome mouse. Inserimento del catetere dovrebbe essere appena sotto le giunzioni di vena gastriche e pancreatiche venuta fuori vena portale (puntino verde) e la punta deve essere posizionata vicino l'epatiche di destra e sinistra vene portali (pallino giallo) che forma una forchetta nei lobi principali del fegato. Una volta acquisito il corretto posizionamento, il catetere deve essere stabilizzato con thread utilizzando un semplice nodo alla marinara. K = rene, L = fegato, SI = piccolo intestino. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig4.jpg"> Figura 4 : Posizionamento del catetere nella vena portale. (A) le pinze sono utilizzate per assicurare ingorgo di sangue della vena portale e di raddrizzare la vena per il posizionamento del catetere. (B) il catetere è schierato in parallelo con la vena portale con lo smusso. (C), la smussatura dell'ago all'interno del catetere è inserito nella vena, non attraverso la vena. (D), l'ago del catetere è retratto e sangue saranno riflusso attraverso il catetere come indicato dalla punta della pinza. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig5.jpg"> Figura 5 : Adeguata perfusione epatica. (A) dopo il posizionamento del catetere, l'estremità femmina Luer del catetere si connette l'estremità Luer maschio (tagliato da una siringa da 1 mL) della tubazione della pompa. (B) dopo il taglio, uno dei principali vasi sanguigni discendenti, sangue e PBS vengono drenati dall'addome mediante tranciatura sul lato del mouse con le forbici. (C) il fegato dovrebbe scottare mentre il sangue è risciacquato e (D) si gonfiano quando sotto pressione di spremitura chiusa il taglio vaso sanguigno con il forcipe. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig6.jpg"> Figura 6 : Struttura schematica di NPC isolamento e purificazione degli epatociti. La maggior parte delle fasi di centrifugazione mirano a rimuovere gli epatociti vivi e morti dalle cellule non parenchimali. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig7.jpg"> Figura 7 : Struttura schematica di SEC arricchimento e purificazione. Gli NPC sono separati dal gradiente PVP seguito dalla separazione SEC da breve adesione a una lastra di polistirene standard. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig8.jpg"> Figura 8 : Purificato epatociti. Epatociti erano placcati sulle piastre di coltura del tessuto collagene rivestito con DMEM + 8% FBS + Pen/Strep e incubati per 6 h seguita da collezione di immagini da un microscopio a 400 X. Bar è uguale a 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig9.jpg"> Figura 9 : Purificazione SEC. (A) SECs e KCs sono stati raccolti dall'interfaccia PVP 25/50% (frecce gialle) e lavato con medium senza siero. (B) The SECs erano adesione selettiva su standard di Petri che separa la KCs, lavato e placcato su piastre di coltura di tessuto collagene-rivestito in RPMI + 5% FBS. Immagini sono state scattate da un microscopio invertito EVOS a 400 X. Bar è uguale a 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig10.jpg"> Figura 10 : La microscopia dell'anatomia del fegato del mouse. Un fegato di topo è stato irrorato con PBS seguita da fissativo (100 mM sodio cacodilato, 12 mL 25% di glutaraldeide, paraformaldeide 16% 15,6 mL, cloruro di calcio 2.65 mM, 180,2 mM saccarosio, mescolati in 100 mL di soluzione) ad un tasso di 1 mL/min per un minimo di 4 tessuti sono stati tagliati e preparati per la microscopia elettronica a scansione. Immagini sono state raccolte su un Field Emission SEM a 10, 000 X. Frecce gialle indicano i microvilli tra gli epatociti. Bar è uguale a 5 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig11.jpg"> Figura 11 : Visualizzazione dei morti contro epatociti live. Dopo 2 lavaggi con tampone 1, pellettati epatociti possono essere valutati per live/dead rapporto dall'occhio. Un pellet più leggero (a sinistra) indica che almeno la metà degli epatociti sono morti. Il pellet più scuro sulla destra è pellettato più saldamente alla parte inferiore del tubo ed è più del 90% dal vivo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tabella 1: Purificazione di cella</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo di cella</td>
			<td>% cellule bersaglio</td>
			<td>% altre cellule</td>
		</tr>
<tr>
<td>Epatociti</td>
			<td>99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cellule endoteliali Sinsusoidal</td>
			<td>89.1</td>
			<td>10,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Valutazione della purezza delle cellule da microscopia chiara.

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Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere alta attuabilità e ad alto rendimento di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dal fegato. Ciò avviene mediante che irrora il fegato con una soluzione di collagenasi tipo IV tramite la vena portale, seguita da centrifugazione differenziale per ottenere gli epatociti e le cellule endoteliali sinusoidali.

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

purification-hepatocytes-sinusoidal-endothelial-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

50.1K Views.  University of Nebraska. L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere alta attuabilità e ad alto rendimento di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dal fegato. Ciò avviene mediante che irrora il fegato con una soluzione di collagenasi tipo IV tramite la vena portale, seguita da centrifugazione differenziale per ottenere gli epatociti e le cellule endoteliali sinusoidali.

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Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Isolamento dei Tessuti Vescicoli Extracellulari dal Fegato

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

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Biochimica

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

In Endocitosi Fegato vivo seguita da purificazione delle cellule del fegato da parte di perfusione epatica

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Biologia

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 as ribonucleoproteins (RNPs) and mRNA. Primary mouse hepatocytes were isolated using a three-step retrograde perfusion method resulting in high yields of up to 50 &#215; 106 cells per liver and cell viability of &#62;85%. This protocol provides detailed instructions for plating, staining, and culturing hepatocytes. The results indicate that electroporation provides a high transfection efficiency of 89%, as measured by the percentage of green fluorescent protein (GFP)-positive cells and modest cell viability of &#62;35% in mouse hepatocytes.
To demonstrate the utility of this approach, CRISPR-Cas9 targeting the hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene was electroporated into primary mouse hepatocytes as proof-of-principle gene editing to disrupt a therapeutic gene related to an inherited metabolic disease (IMD) of the liver. A higher on-target edit of 78% was observed for RNPs compared to 47% editing efficiency with mRNA. The functionality of hepatocytes was evaluated in vitro using an albumin assay that indicated that delivering CRISPR-Cas9 as RNPs and mRNA results in comparable cell viability in primary mouse hepatocytes. A promising application for this protocol is the generation of mouse models for human genetic diseases affecting the liver.

This protocol describes techniques for isolating primary mouse hepatocytes from the liver and electroporating CRISPR-Cas9 as ribonucleoproteins and mRNA to disrupt a therapeutic target gene associated with an inherited metabolic disease of the liver. The methods described result in high viability and high levels of gene modification after electroporation.

Somministrazione mediata da elettroporazione di ribonucleoproteine Cas9 e mRNA in epatociti primari di topo appena isolati

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Bioingegneria

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Isolamento di epatociti rigeneranti dopo epatectomia parziale nei topi

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Medicina

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

Isolamento e 3D Collagen Sandwich Cultura del topo primario Epatociti per studiare il ruolo del citoscheletro nella formazione canalicolare bile in vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due to the rapid loss of morphology, viability, and functionality in culture. A recent approach to long-term culture is the generation of three-dimensional (3D) organoids, an in vitro tool that can recapitulate tissues in a dish based on the marvelous ability of the liver to regenerate itself. Published protocols have been designed to obtain long-term functional 3D organoids from primary adult hepatocytes (Hep-Orgs). The 3D organoid cutting-edge tool requires the ability to isolate cells from adult tissue, and this initial step is crucial for a high-quality final result. The two-step collagenase perfusion, introduced in the 1970s, is still a valid procedure to obtain single hepatocytes. The present article aims to describe all the crucial steps of the surgical procedure, thereby optimizing the primary hepatocytes isolation procedure in the rat model. Moreover, particular attention is paid to the PREPARE guidelines to increase the likelihood of successful procedures and ensure high-quality results. A detailed protocol allows researchers to speed up and optimize the downstream work to establish 3D organoids from primary adult rat hepatocytes. Compared to 2D hepatocytes, Hep-Orgs were still viable and in active proliferation at Day 15, demonstrating a long-term potential.

This protocol presents an optimized two-step collagenase liver perfusion technique in a rat model and shows the use of isolated hepatocytes for in vitro long-term culture of 3D organoids.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Isolamento e coltura di cellule di Kupffer di topo

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...