Questo lavoro è stato finanziato da borse di SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. Ulteriore supporto è stato fornito da: DW: NIH RO1DK075013, DDK e la Fondazione Kleberg, il codice UCCC Nucleo Citometria a Flusso (NIH 5 P30 CA 46934-15), il codice UCCC Microarray core (NCI P30 CA 46934-14).

1. Isolamento del polmone <ol><li> Sacrificio topi adulti (8-10 settimane di età, 18-20 g; C57Bl6J) topi con una dose eccessiva di isoflurano seguito da dissanguamento con tecnica sterile. Profili varia leggermente tra i ceppi. </li><li> Rimuovere chirurgicamente il diaframma, aprire la cavità toracica, tagliando la gabbia toracica laterale su ciascun lato del mouse. Lavare il sangue dai polmoni mediante perfusione del ventricolo destro del cuore delicatamente con 3-5mls di tampone fosfato (PBS). </li><li> Sezionare i lobi polmonari rimuovendo trachea, i bronchi grandi e metterlo in una capsula di Petri riempite con soluzione salina tampone Hanks (HBSS). Seguente raccolta di tutte le pinze lobi polmonari sono utilizzati per posizionare il tessuto sul coperchio del piatto. Tessuto viene poi macinato in piccoli pezzi con bisturi monouso con abbastanza liquido per mantenerli umidi, ma non così tanto che galleggiare e muoversi. </li><li> Sezionare uno degli arti posteriori di uno dei topi e isolare il midollo osseo da utilizzare come un controllo colorazione per impostare la flow citometria cancelli. Macchia del midollo osseo (BM), come descritto in precedenza 1. </li></ol> 2. Preparazione di una sospensione cellulare singola da tessuto polmonare <ol><li> Ogni polmone è digerito utilizzando un peso ottimizzato dei tessuti in rapporto al volume di 0,2 g: 5mls di pre-riscaldato 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; cat # LS004202) disciolto in HBSS sterile. La miscela è immerso in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 30 min 2,3. </li><li> Triturare campione bene fino a digerire il tessuto polmonare scorre facilmente attraverso una pipetta da 10 ml (circa 10 ripetizioni). Incubare per altri 15 minuti a 37 ° C per completare il tessuto digerisce e assicura una sospensione più uniforme singola cellula. </li><li> Diluire la sospensione cellulare del polmone con HBSS e triturare con una pipetta da 5 ml per disperdere frammenti di tessuto residuo. </li><li> Filtrare la sospensione con un colino 70μM cellula per rimuovere frammenti di tessuto non digerito. Campione può essere diviso in multipltubi e conici, a questo punto per evitare di sovraccaricare uno colino cellula e diminuire il tempo. </li><li> Pellet la sospensione cellulare per 10 min a 1500 giri e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet cellulare delicatamente con temperatura ambiente RBC lisi buffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere un volume equivalente di HBSS di inattivare il tampone di lisi e filtrare la sospensione cellulare usando un colino 40μM cellula per rimuovere i detriti e aggregati cellulari. </li><li> Pipettare 10μl di ciascun campione da colorare e contare il numero di cellule sia per il polmone e campioni di BM con un emocitometro. Nota: registrare il volume totale delle cellule. </li><li> Pellet la sospensione cellulare di cellule polmonari mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min. </li><li> Risospendere sia polmoni e le cellule BM a 1x10 6 cellule / ml in preriscaldata (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modificato Eagle medio, alto livello di glucosio (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092) contenente il 2% Bovi fetalene siero (FBS) e HEPES 10mM. </li><li> Preparare una soluzione 1mg/ml stock di Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) in acqua e filtro sterilizzare 1,4. Il colorante Hoechst può essere memorizzato come aliquote a -80 ° C. </li><li> Aggiungi Hoescht 33342 colorante ad una concentrazione finale di 5μg/ml (a 200x diluizione di uno stock 1mg/ml) alla sospensione singola cella. </li><li> Mescolare delicatamente le cellule inversione e incubare in bagnomaria a 37 ° C per esattamente 90 minuti. </li></ol> 3. Colorazione e Preparazione della sospensione di Polmone di Cellula per l&#39;analisi Citometria a Flusso <ol><li> Dopo 90 minuti tutti i punti con le cellule polmonari Hoechst macchiato deve essere eseguito a 4 ° C o su ghiaccio per evitare efflusso colorante. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 1500 rpm per 10 min a 4 ° C e risospendere le cellule in ghiaccio freddo colorazione tampone (PBS +2% FBS). </li><li> Risospendere le cellule ad una concentrazione non superiore a 1x10 7 cellule / tubo utilizzando 300-600μl di PBS contenente il 2%FBS e HEPES 10mM. </li><li> Aggiungi adeguatamente ridacchiò anticorpo CD45 (di solito 1:200 diluizione di CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), al polmone e campioni di BM Incubare in ghiaccio per 10-15 min Compreso un controllo senza macchia durante il.. procedura sperimentale è utile per impostare le porte di analisi. </li><li> Cellule pellet a 4 ° C per 5 min a 1500 giri. Decantare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di buffer di colorazione fredda (PBS +2% FBS). Trasferimento a tubi prechilled scatto tappo in polipropilene (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Aggiungi ioduro di propidio (PI, fotografia 200μg/ml in PBS) per i campioni per una concentrazione finale di 2μg/ml di escludere le cellule morte. PI deve essere utilizzato in combinazione con il colorante Hoechst 33342 per ottenere il profilo corretto di fluorescenza su citometria a flusso. </li><li> Conservare le provette su ghiaccio, al riparo dalla luce fino al momento dell&#39;analisi in citometria a flusso. </li></ol> 4. Citometria a flusso di analisi per definire e isolareuno Stem Cell Lung mesenchimali (MSC polmone) Popolazione con tintura Hoechst efflusso di rilevare una popolazione Side (SP) <ol><li> Questo test ha lo strumento seguenti requisiti: </li><ul><li> 488 nm e UV (350-355 nm) </li><li> 2 rivelatori sul cammino laser UV con il blu (450/65) e rosso (675/50) filtri. </li><li> Il rilevatore UV rossi devono essere ad alta sensibilità per il segnale rosso. Questo può essere un problema con selezionatrici delle cellule vecchie. </li><li> Impianto di refrigerazione per mantenere il campione a 5-10 ° C. </li></ul><li> Allineare i laser e configurare per l&#39;ordinamento delle cellule seguendo il protocollo del produttore. </li><li> Raccogliere il rosso (asse x) e blu (asse y) segnali Hoechst utilizzando una scala lineare. </li><li> Regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore per posizionare il picco G0/G1 in alto a destra del centro sul terreno per consentire un&#39;adeguata visualizzazione della popolazione lato finale. Una parte della fase S e l&#39;intero G2 del ciclo cellulare può essere fuori scala in alto a destra del grafico. L&#39;azzurro firmasegnale è relativamente brillante, mentre il segnale rosso è scarsa. Tipico MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) tensioni sono 425 per il blu e 650 per il rosso. </li><li> Le cellule morte vengono gated con l&#39;ausilio di PI. Il percorso standard PI (eccitazione 488 nm, emissione di 630nm) possono essere utilizzati. In alternativa, PI è anche entusiasta dal laser UV e la popolazione di cellule morte è fuori scala sul lato destro della popolazione laterali (SP) trama. Questo riduce la necessità di compensare il segnale di PI da qualsiasi altra fluorocromi come FITC e PE. Il metodo originale Goodell seguito le ultime procedure 5-7. </li><li> Mantenere una differenza di pressione relativamente bassa durante l&#39;analisi e la selezione per assicurarsi della tenuta della popolazione laterali. </li><li> La SP appare come un braccio di lato a parte la principale popolazione di cellule del polmone. Questa popolazione è chiamata Hoechst basso. </li><li> Il basso Hoechst / SP viene analizzata per separare le popolazioni CD45 positivi e negativi utilizzando un istogramma 2,3 (FIGURA 1). </li><li> A seguito di selezione e gating del basso Hoechst popolazione CD45 neg MSC polmone le cellule possono essere raccolte da ordinamento sia come popolazione mista in un tubo o di singole cellule per isolare cloni in una piastra a 96 pozzetti 3. </li><li> Per piastra di smistamento del flusso di deflessione ordinamento è regolato al 25% per creare un flusso specie più verticale di quello solitamente usato per l&#39;ordinamento del tubo. </li><li> Dirigere il getto ordinare l&#39;invio di un impulso di corrente di prova sulla parte superiore sinistra e poi in basso a destra e di una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Impostare il software mappa selezionatrice piastra per depositare il numero desiderato di cellule in ogni pozzetto. </li><li> Per isolare cloni singola cella uno MSC polmone singolo è ordinato nel pozzo di una piastra a 96 pozzetti in 150μl di cultura dei media (α-MEM integrato con 20% FBS). Dopo l&#39;ordinare un ulteriore 100μl di medium viene aggiunto. </li></ol> 5. Isolamento, coltura e caratterizzazione di polmone MSC e cloni <ol><li> Culture ed espansione della popolazione mista MSC polmone e cloni di cellule singole che seguono l&#39;ordinamento è identico con condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% di CO 2 e umidità&gt; 95%). Le cellule sono permesso di aderire isolamento seguenti per 16 ore. Media è sostituito ogni 48 ore (α-MEM integrato con 20% FBS). Quando le cellule iniziano a proliferare più rapidamente e raggiungere confluenza tra il 75-80% sono diversi passaggi (Figura 2). </li><li> Le cellule sono sciacquati con HBSS preriscaldata e incubate con 0,5% tripsina / EDTA (Cellgro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) a 37 ° C per meno di 2 min. Le cellule sono monitorati utilizzando una portata invertita per confermare l&#39;aspetto di una sospensione cellulare. </li><li> Polmone MSC sono poi divisi con rapporti di 1:2 o 1:3 a seconda del tasso attuale proliferazione della cultura. </li><li> La capacità di MSC polmone di differenziarsi in linee tradizionali mesenchimali di osteoblasti, adipociti e condrociti e la loro espressione sulla superficie cellulare dei accettato i marcatori mesenchimalis valutati per ogni preparazione cellulare. Analisi citogenetica bande è anche esibito per confermare l&#39;assenza di gravi anomalie cromosomiche 2,3,8-11. </li></ol> 6. Enumerazione di MSC polmone usando un test formanti colonia (CFU-F) <ol><li> Diluire cellule in terreno MesenCult completa (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) ad una concentrazione finale di 1x10 6 cellule / ml. </li><li> Eseguire diluizioni in serie per raggiungere concentrazioni finali in un piatto 100mm di 6x10 4 celle, 3x10 4 celle, 1,5 x10 4 celle e 0,75 x10 4 celle in 10 ml di media. Le analisi sono eseguite in triplicato duplicato o per ogni concentrazione cellulare e può essere scalato per superfici più piccole. </li><li> Celle di coltura per 10 giorni in condizioni standard. Il giorno 10 celle vengono sciacquati con PBS e fissati con metanolo al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rilevare il CFU-F colonie con la colorazione 0,4% w / v soluzione colorante Giemsa(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) diluito 1:20 con acqua deionizzata. Attendere che i campioni di aria secca e quantificare il numero di colonie contenenti più di 25 cellule per colonia (Figura 3). </li></ol> 7. Analisi delle proprietà immunomodulanti delle MSC polmone a cellule T proliferazione e apoptosi <ol><li> 6.25x10 4 celle polmonari MSC per pozzetto sono rivestiti in piastre da 96 pozzetti e lasciato riposare tutta la notte 2. </li><li> Cellule CD4 + da milza di recettore delle cellule T (TCR) topi transgenici, OT-II con le cellule T che riconoscono il ovalbumina 323-339 peptide, sono purificati mediante deplezione CD8 +, CD19 +, MHC-II + e CD25 + con una cella Miltenyi AutoMACS sorter (Miltenyi, Auburn, CA). Cellule presentanti l&#39;antigene (APC) sono isolati dal positivamente ordinamento MHC-II + cellule 12. </li><li> APC sono fissate in 4% paraformaldeide, lavati 3 volte in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, e caricato con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 peptide. </li><li> Simulata, la crescita arrestati APC vengono aggiunti alla MSC polmone in piastre da 96 pozzetti. </li><li> Superiore al 95% pura CD4 + 1x10 5 cellule sono etichettati con 5 micron Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE, Sigma, St.Louis MO) in PBS e incubate per 5 minuti al buio, lavato con BSA PBS-5%, e poi aggiunti al APC e cellule MSC polmone in DMEM al 5% FBS media. Le cellule sono poi incubate per 96 ore. </li><li> T-cellule sono poi colorati con anti anti-CD40 (Cy5); CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); Vbeta 5 (PE) e analizzati utilizzando un Miltenyi MacsQuant 7 citofluorimetro canale (Miltenyi, Aurburn, CA) e flojo software di analisi (Treestar, Ashland, OR). Proliferazione è misurata come la diminuzione di intensità media di fluorescenza CFSE rispetto allo sfondo, le cellule T etichettati con CFSE e non esposto ad APC (Figura 4). T-cellule sono contate in questo momento e vitalità valutato con esclusione trypan blu. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Analisi citofluorimetrica e definizione di MSC polmone. Sospensioni singola cellula del tessuto digerire polmone sono colorati con Hoechst 33342 e analizzati mediante citometria a flusso per rilevare le differenze in A. forward scatter (FSC) e lato dispersione (SSC) e B. Hoechst blu e rosso fluorescenza. La presenza di una popolazione laterale (SP) è visibile nel cancello. La Hoechst bassa SP viene poi analizzata per separare il C. Popolazione CD45 negativa di MSC polmone. Il CD45 positivo ai rapporti negativi di polmone SP sono di solito 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Isolamento e la coltura di MSC polmone. Dopo la raccolta della MSC polmone di separazione delle cellule, le cellule sono placcati in piatti di 30 millimetri con α-MEM supplemented con il 20% FBS. A. Appena le cellule appaiono ordinati piccolo, rotondo e brillante. B. Dopo circa 2-3 settimane con colonie di un fenotipo mesenchimale diventano evidenti e la proliferazione è più evidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Enumerazione di MSC da Colony Forming fibroblasto-saggio. Esteso polmone MSC sono placcati per il protocollo descritto per il saggio CFU-F. A. Dopo 10 giorni e colonie Giemsa sono evidenti. B. Le colonie sono grandi e composta da un poche centinaia di cellule. C. Le cellule visualizzare un fenotipo mesenchimale. A &amp; B, bar Scala = 0,5 cm; bar Scala C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. CFSE saggio basato su cellule T proliferazione. In assenza di MSC polmonari e la presenza di antigen cellule presentanti (APC) + / - ovalbumina (OVA) CD40 delle cellule T effettrici positivi dimostrano una diminuzione di intensità CFSE che indica la proliferazione (cerchio rosso). CFSE intensità di fluorescenza della membrana delle cellule T diminuisce stechiometricamente con tutti cioè la divisione cellulare. con ogni divisione. In presenza di MSC polmone, APC + / - OVA, CD40 delle cellule T effettrici positivo dimostrare nessuna variazione significativa in intensità CFSE che indica una mancanza di proliferazione (cerchio rosso).

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	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Jun, D. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Noi abbiamo adattato un metodo inizialmente utilizzato per identificare BM cellule ematopoietiche per isolare una specifica popolazione di MSC polmone residenti. A causa della riproducibilità di isolamento queste cellule sono state poi ben caratterizzati come MSC. La loro origine è stato definito come residente nel polmone topo adulto (al contrario di BM derivati) e un profilo fenotipico e molecolare documentata 2. La capacità di isolare ripetutamente questa popolazione caratterizzata permette lo studio ulteriore della importanza biologica e il ruolo delle MSC polmone durante l&#39;omeostasi dei tessuti e la malattia. La definizione recente di questa popolazione in vivo sia in murine e umane del tessuto polmonare facilita lo sviluppo di una strategia terapeutica rivolta al recupero delle cellule endogene per facilitare la riparazione ai polmoni durante lesioni e la malattia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Tampone fosfato (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina tamponata (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington collagenasi di tipo 2 </td><td> Worthington Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Globuli rossi tampone di lisi </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 dye </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidio ioduro </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> MesenCult Media completo </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v colorazione Giemsa soluzione </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% paraformaldeide </td><td> Microscopia Elettronica Servizi </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde è diluito al 4% con PBS </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein succinimidile estere (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation &#38; characterization of hoechstlow cd45negative mouse lung mesenchymal stem cells

Tessuto cellule staminali residenti mesenchimali (MSC) sono importanti regolatori della riparazione dei tessuti e la rigenerazione, la fibrosi, l&#39;infiammazione, l&#39;angiogenesi e la formazione di tumori. Nel loro insieme questi studi suggeriscono che MSC polmone residente svolgere un ruolo durante l&#39;omeostasi del tessuto polmonare, ferite e la riparazione in corso di malattie come la fibrosi polmonare (PF) e l&#39;ipertensione arteriosa (PAH). Qui descriviamo una tecnologia per definire una popolazione di MSC polmone residenti. La definizione di questa popolazione in vivo del tessuto polmonare con una serie di definire marcatori facilita l&#39;isolamento ripetuto di una popolazione staminali ben caratterizzato cellulare mediante citometria di flusso e lo studio di un tipo specifico di cellule e la funzione.

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Isolation &amp; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In questo articolo dimostriamo l&#39;isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

20.3K Views.  University of Colorado Denver. In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Video: Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

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Biologia

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

Isolamento di cellule staminali del mouse ghiandole salivari

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...