Questa ricerca è stata finanziata dalla borsa no. 0723341 (per KGL) dalla National Science Foundation. Siamo anche grati per il contributo fornito dal programma triennale Research Fellowship Schapiro e il Dipartimento di Psicologia presso la Randolph-Macon College. Infine, apprezziamo Craig Kinsley contributi collaborativi in ​​questa ricerca e aiutare Amanda Rzucidlo nella preparazione della R-MC laboratorio per questo articolo video.

1. Identificazione di modello animale <ol><li> Il mouse Deer California (Peromyscus californicus) è un modello ideale per esplorare le risposte paterna. Come vedete, questo mouse sposi cuccioli proprio come fanno le mamme - che anche Crouch su di loro in modo che sembra che i cuccioli sono infermieristico. Il comportamento dei topi California è paragonato a una specie dello stesso genere, il mouse cervo (Peromyscus maniculatus) che espone poco interesse per i cani, spesso cercando di fuggire o addirittura attaccarli. (Vedi Figura 1 per le immagini di queste specie che interagiscono con i cuccioli.) </li><li> Una volta che il modello di specie è stata identificata poi i vari gruppi devono essere stabilite. In questo studio, i padri biologici, vergini senza esperienza genitoriale, e le vergini con limitate all&#39;esposizione dei piccoli (cuccioli esposti o padri in affidamento) di entrambe le specie vengono utilizzate in modo che le caratteristiche paterno sia predisposto e acquisiti possono essere valutati. In questo studio particolare abbiamo esposto anche tutti i gruppi per un topo giocattolo cucciolo per garantire che le interazioni sociali sono specifici di un cucciolo e non una risposta rappresentante per nulla messo in gabbia (vedi figura 2). </li><li> Prima di analizzare i fattori neurobiologici, è importante per confermare che la specie selezionate mostrano evidenti differenze nel comportamento di interesse. In questo studio, i maschi sono posti in una gabbia con un cucciolo per cinque minuti e un etogramma comportamento paterno (vedi Tabella 1, ad esempio di etogramma) viene utilizzato per comportamenti punteggio come latenza di avvicinare il cucciolo e la quantità di tempo trascorso in contatto con il cucciolo. Se le risposte aggressive sono osservati, il cucciolo viene rimosso immediatamente. Queste sessioni sono spesso videoregistrate in modo da un&#39;attenta analisi del comportamento può essere successivamente condotto. </li></ol> 2. Preparazione di tessuto cerebrale <ol><li> A seguito di una perfusione standard di ogni mouse (protocollo allegato), i cervelli sono stati rimossi in modo che possano essere sezionati nel settore specifico di interesse (cervello show). </li><li> Un mouse standard cervello atlante (mostra atlante) è utilizzato per individuare il nucleo paraventricolare dell&#39;ipotalamo, una zona nota per essere ricca di cellule che producono il neuropeptide di interesse in questo studio - vasopressina (AVP). </li><li> Il cervello è poi bloccato e montato su un mandrino congelamento in modo che il tessuto si blocca prima di essere sezionati con il microtomo. Il cervello è sezionato in una modalità di assetto fino a punti di riferimento specifici sono stati identificati, poi lo spessore specifiche del cervello, 30 micron, in questo caso, è fissato per le sezioni di cervello utilizzata per l&#39;analisi. </li><li> Le sezioni di cervello sono accuratamente messi in piatti ben riempito con tampone fosfato salino (PBS), (allegato protocollo per la PBS, si prega di notare che questa è solo un esempio di un protocollo di immunocitochimica standard). </li></ol> 3. Immunocitochimica <ol><li> In tutto le varie fasi di questo processo (vedi protocollo allegato), è importante avere precise competenze pipettaggio per garantire misure accurate di prodotti chimici e di altri ingredienti importanti per questa tecnica (studente di pipettamento show). </li><li> Il primo passo in questo processo è il lavaggio del cervello che comporta la sostituzione del PBS nei piatti ben tre a cinque volte, tra ogni lavare i piatti e sono posti su una sedia a dondolo per 10 minuti (mostra studente sostituzione PBS e l&#39;immissione piastre su rockers) . </li><li> Le sezioni di cervello sono quindi esposti alla soluzione di anticorpo primario e conservato a 4 ° C per una notte sulla sedia a dondolo (processo show). </li><li> Dopo un altro lavaggio, le fette di cervello è esposto a un anticorpo secondario per un&#39;ora sulla sedia a dondolo a temperatura ambiente, poi lavati di nuovo. </li><li> Avanti i cervelli sono esposti ad un Avitin-Biotina soluzione Complesso di prepararsi per la visualizzazione del neurochimici cellule positive. </li><li> Per la fase di visualizzazione finale, il cervello è esposto a DAB. Si tratta di un prodotto pericoloso e deve sempre essere maneggiati con cautela. Come si vede qui, le fette di cervello cominciano a scurirsi davanti ai vostri occhi (mostra di processo). </li><li> Dopo l&#39;esposizione DAB, il cervello passano attraverso l&#39;ultima serie di lavaggi e poi accuratamente immessi sul vetrini subbed e lasciato asciugare durante la notte (mostra il posizionamento di una fetta del cervello su un vetrino, si veda l&#39;allegato per subbed protocollo di diapositive). </li><li> I vetrini vengono poi cancellati attraverso una serie di lavaggi con acqua distillata e alcol, infine, di essere immersi in Citrosolv prima di essere coprioggetto e conservati in un Contenitore per mantenere sicuro (mostra vari aspetti di questo processo, si veda l&#39;allegato per il processo di compensazione). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Dopo le diapositive sono asciugati, possono essere valutati con il software neuroquantification specializzati. Ecco il software Bioquant viene utilizzato per quantificare il vasopressina cellule positive e fibre nel nucleo paraventricolare del cervello del mouse (mostra il software sullo schermo ... e microscopio). </li><li> L&#39;area di interesse viene identificato utilizzando le opzioni di misurazionedel software per stabilire il campo visivo per neuroquantification. E &#39;importante che una dimensione coerente campo visivo è quantificato per ogni animale (studente mostrare fare questo). </li><li> Qui la colorazione scura vasopressina-immunoreattive corpi cellulari e le fibre sono evidenti. Perché è difficile contare o tracciare questo tessuto, una caratteristica speciale di questo software utilizza la soglia di luce per determinare la quantità totale di tessuto colorato positivamente entro l&#39;area specifica di interesse. Questa soglia ci dice come gran parte della zona specificata contenuta vasopressina-positivi tessuto (mostra il valore dei dati sullo schermo del computer). </li></ol> 5. Analisi comportamentale <ol><li> Se più di un osservatore sarà segnato il videocassette, è importante stabilire inter-rater per garantire che gli osservatori abbiano una performance il comportamento in modo coerente. Per la sessione di punteggio e un foglio di punteggio comportamento dovrebbero essere preparati per consentire un facile gol di comportamento durante le sessioni di osservazione (vedi Tabella 2 per esempio di segnare foglio elettronico). </li><li> Per i comportamenti che non sono veloci risposte episodiche, un&#39;analisi microsequenziamento può rivelare sottigliezze circa la progressione delle risposte specifiche. Per esempio, governare il comportamento è costituito da una catena di reazioni molto veloci. Anche se una possibilità è quella di registrare semplicemente la presenza e la durata della cura, un altro è quello di documentare la catena di eventi che accompagnano questa risposta. Utilizzando questo software microsequenziamento, gli osservatori punteggio la presenza di un comportamento particolare ogni secondo, come richiesto dal software (software di spettacolo e video). </li><li> Dopo la raccolta dei dati, i parametri di interesse sono determinati i punteggi e appropriato comportamentali vengono analizzati. Esempi possono essere durata totale del tempo trascorso a contatto con il cucciolo, o il numero di interruzioni nella sequenza grooming (mostra computer con foglio elettronico con i dati inseriti per ogni animale). </li><li> Una volta che il comportamento è segnato, è importante per confermare che le due specie esposte le strategie di risposta diversi per il comportamento di interesse per lo studio. In questo caso il topo cervo California dovrebbe mostrare un comportamento più paterno rispetto ai topi cervo comune. Inoltre, varie misure comportamentali possono essere correlati con le misure di cervello per ottenere una visione più consapevole delle influenze rilevanti. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Per validare il modello, i dati dovrebbero indicare chiaramente che le due specie eseguita in modo diverso in relazione al comportamento di interesse. Qui si vede che il P. maschi californicus speso più tempo e cura accovacciato sui cuccioli, due caratteristiche di risposte paterno (vedi Figura 4). </li><li> Al fine di determinare se la variabile neurobiologial di interesse è importante nelle risposte paterna, la quantità di vasopressina (AVP)-positivo tessuto è stato quantificato per diverse aree del cervello importanti, come si può vedere, il paterno P. animali californicus aveva più tessuto immuno-positivo in molte di queste aree cerebrali. (Vedi Figura 5). </li><li> In uno studio collegato usando l&#39;analisi microsequencing, è stato ipotizzato che i topi paterno California mostrerebbe meno ansia rispetto ai loro omologhi vergine, di conseguenza, se esposti ad un odore predatore, i padri esposti meno interruzioni nella sequenza di governare gli animali vergine (vedi Figura 6). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" /> Figura 1: (A) Maschio topi California espositrici risposte paterno nei confronti conspecifici cucciolo alieno. (B) topo cervo maschio che presentano un approccio prudente (tratto partecipare) e la risposta evitare in presenza di un alieno conspecifici cucciolo. Nota: In queste valutazioni interazione sociale, se un maschio esibisce risposte aggressivo nei confronti del cucciolo, gli sperimentatori immediatamente colpito la parte superiore della gabbia per distrarre il maschio. In questo momento la sessione è terminata e il cucciolo viene rimosso, controllato per eventuali ferite e restituito alla madre. Nel nostro laboratorio, questo raramente si osserva con P. maschi californicus ma è occasionalmente osservata con P. maniculatus; stretta osservazione e di intervento immediato, tuttavia, impedire il verificarsi di danni agli animali. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" /> Figura 2: Un mouse California, interagendo con il mouse giocattolo, la maggior parte ha cercato di masticare questi stimoli. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" /> Figura 3: progettazione sperimentale di studio, c&#39;erano circa 6 animali in ciascun gruppo per ogni specie. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" /> Figura 4: Grafico del processo di immunocitochimica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" /> Ficoure 5 risposte paterna nella California e topi cervi;. risposte più paterno (sposo, accovacciarsi, più veloce di avvicinamento) sono stati osservati nei topi California. Altro tratto frequenta (risposta allo stress) sono stati osservati nei topi cervo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" /> Figura 6. Immunoreattività vasopressina in varie aree cerebrali di entrambe le specie. I topi della California ha avuto più colorazione nelle cellule PVN e fibre. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" /> Figura 7: paterno California topi esposti meno interruzioni nelle loro sequenze di governare in presenza di un odore predatore rispetto ai gruppi cuccioli esposti e vergine.

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	<li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol.">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li><li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa.">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing.">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li><li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa:+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks,+mutagenesis+screens,+and+mouse+backcrosses.">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li><li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm.">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li><li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL/6+mice.">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization.">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li><li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates.">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li><li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing.">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li><li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity.">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li><li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserving,+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation.">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo articolo vengono illustrati tre componenti essenziali ritenuti critici per la riuscita di indagini neuroscienze comportamentali: (1) un modello animale di rappresentanza e di validità; (2) un protocollo di immunocitochimica accurato e sensibile, e (3) la maggior parte delle analisi (osservazionale e statistiche ) di entrambi i dati comportamentali e il cervello. Errori in una singola categoria sarà sicuramente compromesso i risultati dello studio intero. Quindi, dopo un&#39;attenta selezione del modello animale appropriato, notevoli sforzi devono essere diretti verso pilota di test delle procedure comportamentali e istologici per assicurare che il comportamento sarà affidabile osservate nello studio, seguito dal successo di elaborazione del cervello. Come accennato in precedenza, l&#39;uso di specie comparativa per identificare i meccanismi neurobiologici di una risposta particolare è un valido approccio metodologico, perché questa tecnica non richiede manipolazione genetica o dolorose manipolazioni chirurgiche. Così, questo approccio metodologico utilizza meno minacciato, gli animali intatti. L&#39;uso delle variazioni naturali degli animali, tuttavia, è rafforzata dalla incorporazione di ambienti di tipo naturale, anche se gli animali siano accolti in laboratorio. Inoltre, se gli studi di laboratorio può essere esteso al campo per convalidare ulteriormente l&#39;autenticità delle differenze di specie nel comportamento di interesse, questo passo successivo è raccomandato. Anche se l&#39;approccio comparativo offre molti vantaggi, una limitazione è la natura correlativa dei dati, di conseguenza, le tecniche aggiuntive, come le manipolazioni farmacologiche deve essere utilizzato per convalidare ulteriormente il ruolo dei sistemi mirati di neurobiologici nel comportamento di interesse. Una volta che gli sperimentatori fiduciosi sulle procedure comportamentali, istologici e statistica, si deve prestare attenzione in modo che le condizioni di vita degli animali rimangono costanti per tutti i gruppi tranne, naturalmente, per la manipolazione sperimentale. Cambiamenti nelle variabili quali orari la luce, i livelli di rumore, bidelli, i livelli di umidità e odori in laboratorio potrebbe avere effetti significativi sulle risposte neurobiologiche degli animali &#39;. In questo articolo l&#39;anticorpo primario è stato utilizzato per la rilevazione della vasopressina, ma altri anticorpi primari possono essere utilizzati per una pletora di sostanze neurochimiche differenti di interesse. Se lo sperimentatore sta lavorando con un nuovo anticorpo, è importante condurre studi di titolazione per determinare la diluizione ottimale del nuovo anticorpo. Molte volte degli anticorpi viene usato troppo (come suggerito dal fornitore), con conseguente tessuto che è troppo scura per differenziare il segnale, ulteriormente, l&#39;uso eccessivo di anticorpi è molto costoso. Infine, se più di una singola analisi statistica può essere utilizzato per fornire visualizzazioni alternative e le interpretazioni dei dati, dovrebbero essere utilizzati. In questo studio particolare, i modelli lineari generali, di correlazione e analisi di scaling multidimensionale sono stati utilizzati per fornire il punto di vista più informativo dei dati.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Compound microscopio binoculare </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANT Vita Software Science </td><td> BioQuant Immagine Analysis Corporation </td><td> Versione 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex Console Easy Drive-Load L / S (pompa di perfusione) </td><td> Cole-Parmer strumento aziendale </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Beh Cultura Cluster cellulare (colture di tessuti trattati; apirogena polistirolo; sterile) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini per microscopio 25x75x1mm </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> 22x50mm No.1 fodera </td><td> Globe Scientific, Inc. </td><td> 1414-10 </td><td></td></tr><tr><td> Non sterili 3 ml Laureato Grande pipette Lampadina </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Alconox detersivo in polvere </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Fosfato monobasico di sodio </td><td> Spettro </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Spettro </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Pescatore </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> Cromo Solfato di potassio </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo, Bottiglie Den.Poly Alta, 200 prove, 24 x 1 litro </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Vettore </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti analita reagente specifico vasopressina </td><td> Immunostar, Inc. </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinilato anti-IgG di coniglio (H + L) purificate per affinità </td><td> Vettore </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite standard Vectastain ABC Kit </td><td> Vettore </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> DAB perossidasi Kit substrato </td><td> Vettore </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Originale gelatina insapore (4-count buste) 1-oz box </td><td> Knox </td><td></td><td> L&#39;acquisto al negozio di alimentari locale </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno al 3% </td><td> CareOne </td><td></td><td> Acquistare in farmacia locale </td></tr><tr><td> Candeggina </td><td> Clorox </td><td></td><td> L&#39;acquisto al negozio di alimentari locale </td></tr></tbody></table>

using a comparative species approach to investigate the neurobiology of paternal responses

Un obiettivo di neuroscienze comportamentali di fondo è quello di identificare i fattori neurobiologici che regolano comportamenti specifici. Utilizzando modelli animali per raggiungere questo obiettivo, molte strategie metodologiche richiedono tecniche invasive per manipolare l&#39;intensità del comportamento di interesse (ad esempio, i metodi di lesione, manipolazioni farmacologiche, tecniche di microdialisi, geneticamente modelli animali). L&#39;utilizzo di un approccio comparativo specie permette ai ricercatori di sfruttare naturalmente differenze nelle strategie di risposta esistenti in specie strettamente correlate. Nel nostro laboratorio, usiamo due specie del genere Peromyscus che si differenziano nelle risposte paterna. Il maschio del mouse cervo California (Peromyscus californicus) presenta le stesse risposte dei genitori come la femmina, mentre suo cugino, il topo cervo (Peromyscus maniculatus) presenta praticamente alcuna risposta nutrimento / parentali in presenza di cuccioli. Di interesse specifico in questo articolo è un&#39;esplorazione dei fattori neurobiologici associati con le risposte affiliativo sociale esibita dal paterno del mouse cervi California. Perché l&#39;approccio comportamentale neuroscienze è multiforme, i seguenti componenti chiave dello studio saranno brevemente affrontati: l&#39;identificazione di specie appropriate per questo tipo di ricerca, raccolta dati per l&#39;analisi comportamentale; preparazione e sezionamento del cervello; passaggi fondamentali necessari per immunocitochimica per la quantificazione della vasopressina-immunoreattività, l&#39;uso di neuroimaging software per quantificare il tessuto cerebrale, l&#39;uso di un analisi video microsequenziamento per segnare il comportamento e, infine, le analisi statistiche appropriate per fornire le interpretazioni più informato dei risultati della ricerca.

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Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

L&#39;approccio specie comparata permette neuroscienziati comportamentali di esplorare diversi fattori neurobiologici associati a specifici comportamenti visti come caratteristiche di un modello animale specifico. Approfittando del naturale differenze di comportamento tra specie strettamente correlate, questa tecnica non richiede tecniche invasive per manipolare l&#39;espressione del comportamento.

Utilizzando un approccio comparativo Specie per Indagare sulla Neurobiologia delle risposte paterno

A goal of behavioral neuroscience is to identify underlying neurobiological factors that regulate specific behaviors.  Using animal models to accomplish ...

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12.5K Views.  Randolph-Macon College. L'approccio specie comparata permette neuroscienziati comportamentali di esplorare diversi fattori neurobiologici associati a specifici comportamenti visti come caratteristiche di un modello animale specifico. Approfittando del naturale differenze di comportamento tra specie strettamente correlate, questa tecnica non richiede tecniche invasive per manipolare l'espressione del comportamento.

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Array registrazioni Multielectrode dell&#39;epitelio Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Ricerca

Neuroscienze

Recording Behavioral Responses to Reflection in Crayfish

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems. One important issue concerns the relative roles of each sensory modality in guiding behavior. The role of visual inputs has been examined by isolating visual stimuli from mechanical and chemosensory stimuli. In some studies (Bruski &amp; Dunham, 1987: Delgado-Morales et al., 2004) visual inputs have been removed with blindfolds or low light intensity, and effects of remaining sensory modalities have been elucidated. An alternative approach is to study the effects of visual inputs in the absence of any appropriate mechanical and chemosensory cues. This approach aims to identify the exclusive role of visual inputs. 
We have used two methods to provide visual stimuli to crayfish without providing chemical and mechanical cues. In one method, crayfish are videotaped in an aquarium where half of the walls are covered in mirrors to provide a reflective environment, and the other half are covered in a non-reflective (matte finish) plastic. This gives the crayfish a choice between reflective and non-reflective environments. The reflective environment provides visual cues in the form of reflected images of the crayfish as it moves throughout half of the tank; these visual cues are missing from the non-reflective half of the tank. An alternative method is to videotape the behavior of crayfish in an aquarium separated by a smaller chamber at each end, with a crayfish in one small chamber providing visual cues and an inert object in the opposite small chamber providing visual input from a non-moving, non-crayfish source. 
Our published results indicate that responses of crayfish to the reflective environment depend on socialization and dominance rank. Socialized crayfish spent more time in the reflective environment and exhibited certain behaviors more frequently there than in the non-reflective environment; isolated crayfish showed no such differences. Crayfish that were housed in same-sex pairs developed a social rank of either dominant or subordinate. Responses to reflection differed between dominant and subordinate crayfish (May &amp; Mercier, 2006; May &amp; Mercier, 2007). Dominant crayfish spent more time on the reflective side, entered reflective corners more frequently and spent more time in reflective corners compared to the non-reflective side. Subordinate crayfish walked in reverse more often on the reflective side than on the non-reflective side. Preliminary data suggest similar effects from visual cues provided by a crayfish in a small adjoining chamber (May et al., 2008).

We have developed two methods for studying effects of visual cues on behavior in the absence of tactile and chemical cues. One method involves videotaping responses of crayfish to reflective walls in an aquarium; the other examines effects of visual inputs provided by a live crayfish behind a transparent partition.

Registrazione di risposte comportamentali alla riflessione in gamberi di fiume

Social behavior depends on sensory input from the visual, mechanical and olfactory systems.  One important issue concerns the relative roles of each ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Measuring the Subjective Value of Risky and Ambiguous Options using Experimental Economics and Functional MRI Methods

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition termed "risky". In other cases when probabilities cannot be estimated, this is a condition described as "ambiguous". While most people are averse to both risk and ambiguity1,2, the degree of those aversions vary substantially across individuals, such that the subjective value of the same risky or ambiguous option can be very different for different individuals. We combine functional MRI (fMRI) with an experimental economics-based method3 to assess the neural representation of the subjective values of risky and ambiguous options4. This technique can be now used to study these neural representations in different populations, such as different age groups and different patient populations.
In our experiment, subjects make consequential choices between two alternatives while their neural activation is tracked using fMRI. On each trial subjects choose between lotteries that vary in their monetary amount and in either the probability of winning that amount or the ambiguity level associated with winning. Our parametric design allows us to use each individual's choice behavior to estimate their attitudes towards risk and ambiguity, and thus to estimate the subjective values that each option held for them. Another important feature of the design is that the outcome of the chosen lottery is not revealed during the experiment, so that no learning can take place, and thus the ambiguous options remain ambiguous and risk attitudes are stable. Instead, at the end of the scanning session one or few trials are randomly selected and played for real money. Since subjects do not know beforehand which trials will be selected, they must treat each and every trial as if it and it alone was the one trial on which they will be paid. This design ensures that we can estimate the true subjective value of each option to each subject. We then look for areas in the brain whose activation is correlated with the subjective value of risky options and for areas whose activation is correlated with the subjective value of ambiguous options.

Using functional MRI and behavioral methods to determine the neural representation of the subjective value of risky and ambiguous options in the human brain.

Misurare il valore soggettivo di opzioni rischiose e ambigui utilizzando Economia Sperimentale e funzionali metodi MRI

Most of the choices we make have uncertain consequences. In some cases the probabilities for different possible outcomes are precisely known, a condition ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the "Loser" Effect in Drosophila melanogaster

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This complex behavior is influenced by genetic, hormonal and environmental factors. As in many organisms, previous fighting experience influences the fighting strategy of flies and the outcome of later contests: losing a fight increases the probability of losing later contests, revealing &#34;loser&#34; effects that likely involve learning and memory 2-4. The learning and memory that accompanies expression of complex social behaviors like aggression, is sensitive to pre-test handling of animals 5,6. Many experimental procedures are used in different laboratories to study aggression 7-9, however, no routinely used protocol that excludes handling of flies is currently available. Here, we report a new behavioral apparatus that eliminates handling of flies, using instead their innate negative geotactic responses to move animals into or out of fighting chambers. In this protocol, small circular fight arenas containing a food cup are divided into two equal halves by a removable plastic slider prior to introduction of flies. Flies enter chambers from their home isolation vials via sliding chamber doors and geotaxis. Upon removal of plastic sliders, flies are free to interact. After specified time periods, flies are separated again by sliders for subsequent experimentation. All of this is done easily without handling of individual flies. This apparatus offers a novel approach to study aggression and the associated learning and memory, including the formation of &#34;loser&#34; effects in fly fights. In addition, this new general-purpose behavioral apparatus can be employed to study other social behaviors of flies and should, in general, be of interest for investigating experience-related changes in fundamental behavioral processes.

A New Approach that Eliminates Handling for Studying Aggression and the &quot;Loser&quot; Effect in Drosophila melanogaster

During fruit fly fights, the behavioral patterns observed, fight dynamics, and associated learning and memory are influenced by experimental conditions. The protocol presented here describes a novel procedure that entirely eliminates handling of flies during experiments. This improves fight dynamics and allows formation of strong &#34;loser&#34; effects.

Un nuovo approccio che elimina la gestione per lo studio Aggressione e l&#39;effetto &quot;Loser&quot; in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aggressive behavior in Drosophila melanogaster is composed of the sequential expression of stereotypical behavioral patterns (for analysis see 1). This ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Controllo ottico di una proteina neuronale Utilizzando un acido Innaturale Amino geneticamente codificata in neuroni

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.

Stripe Assay per studiare l&#39;attività attrattiva o repulsiva di un substrato proteico Utilizzando dissociata neuroni dell&#39;ippocampo

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from flowering plants. Only a few studies have described the gustatory responses of bees toward toxins in food, and these experiments have mainly used the proboscis extension response on restrained honey bees. Here, a new behavioral assay is presented for measuring the feeding responses of freely-moving, individual worker bumble bees to nutrients and toxins. This assay measures the amount of solution ingested by each bumble bee and identifies how tastants in food influence the microstructure of the feeding behavior.
The solutions are presented in a microcapillary tube to individual bumble bees that have been previously starved for 2-4 hr. The behavior is captured on digital video. The fine structure of the feeding behavior is analyzed by continuously scoring the position of the proboscis (mouthparts) from video recordings using event logging software. The position of the proboscis is defined by three different behavioral categories: (1) proboscis is extended and in contact with the solution, (2) proboscis is extended but not in contact with the solution and (3) proboscis is stowed under the head. Furthermore the speed of the proboscis retracting away from the solution is also estimated.
In the present assay the volume of solution consumed, the number of feeding bouts, the duration of the feeding bouts and the speed of the proboscis retraction after the first contact is used to evaluate the phagostimulatory or the deterrent activity of the compounds tested.
This new taste assay will allow researchers to measure how compounds found in nectar influence the feeding behavior of bees and will also be useful to pollination biologists, toxicologists and neuroethologists studying the bumble bee&#39;s taste system.

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees Bombus terrestris

A novel behavioral assay is described for investigating the short term gustatory responses of the mouthparts of freely-moving bumble bees (Bombus terrestris) toward nutrients and toxins in solution.

A Novel comportamentale test per Indagare Risposte gustativa individuale, liberamente rigiro bombi (<em&gt; Bombus terrestris</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...