Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal finanziamento scozzese Consiglio (Grant Numero HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medical Research Scozia ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), il Cancro Research UK Cancer Centro di Medicina Sperimentale ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), e Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Preparazione del tessuto <ol class="lalpha"><li> Microtomia <ol class="lroman"><li> Sezione paraffina fissato in formalina incorporato sezioni tumorali a 4 micron di spessore utilizzando un microtomo rotativo. </li><li> Posizionare le sezioni sulla carica positiva preparati microscopici. </li><li> Incubare i vetrini in un forno a 37 ° C durante la notte. </li></ol></li><li> Conservazione <ol><li> Sezioni Conservare in un -18 ° C a -25 ° C congelatore, al fine di prevenire la perdita di antigenicità. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescenza di sezioni di tessuto <ol class="lalpha"><li> Deceratura e reidratazione <ol class="lroman"><li> Sparaffinatura diapositive in xilene due volte per 5 min. </li><li> Reidratare diapositive nel 99%, 99%, 80%, 50% di etanolo e acqua corrente per 2 minuti di ciascuno in ordine. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol class="lroman"><li> Eseguire la smascheramento dell&#39;antigene di calore, utilizzando citrato di sodio 0,15 mM pH 6.0, buffer in una pentola a pressione per 5 minuti in microwave. </li><li> Raffreddare i vetrini per 20 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBST 0,05% per 5 minuti sulla sedia a dondolo. </li></ol></li><li> Blocco procedura <ol class="lroman"><li> Trattare le sezioni in perossido di idrogeno al 3% per 10 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in PBST 0,05% per 5 minuti sulla sedia a dondolo. </li><li> Aggiungere le sezioni a cremagliera immunocolorazione Sequenza. </li><li> Trattare le sezioni in blocco siero proteine ​​gratuito per 10 min. </li></ol></li><li> Anticorpi incubazione primaria <ol class="lroman"><li> Anticorpi incubare primario diluito diluizione ottimale nel diluente dell&#39;anticorpo Dako per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Epiteliali maschera (Citocheratina) di incubazione <ol class="lroman"><li> Incubare topo anti-pan citocheratina, diluito 1:50 nel diluente dell&#39;anticorpo Dako notte a 4 ° C. </li></ol></li><li> Maschera di visualizzazione epiteliali <ol class="lroman"><li> Preparare una diluizione 1:25 di capra anti-topo Alexa555 santicorpi econdary nel pre-diluito Immaginate capra-coniglio HRP soluzione di anticorpi. Incubare i vetrini al buio per 1,5 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Obiettivo di visualizzazione <ol class="lroman"><li> Trasferire le diapositive dalla Sequenza alla camera di umidità. </li><li> Combina segnale diluente target di amplificazione (HistoRx vasca E) e il Cy5 Tyramide (F tubo HistoRx) a 1:50 concentrazione. Vortice di mescolare accuratamente. Incubare i vetrini al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare a 0,05% PBST tre volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Disidratare vetrini in etanolo 80% per 1 min. </li><li> Lasciare asciugare al buio. </li></ol></li><li> Controcolorazione e montavetrini <ol class="lroman"><li> Applicare medio DAPI montaggio sul coprioggetto e posizionare il coprioggetto sopra le sezioni di tessuto. </li><li> Diapositive asciugare per una notte al buio. </li><li> Dopo le diapositive sono asciugati, sicuro con smalto di enche la conservazione a lungo termine e conservare in frigorifero 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Acquisizione delle immagini mediante scansione intera sezione <ol class="lalpha"><li> Caricare fino a cinque diapositive nel cassetto della diapositiva Aperio ScanScope scanner FL. </li><li> Per ogni diapositiva, selezionare l&#39;area generale di immagine utilizzando l&#39;interfaccia della console ScanScope. Selezionare la regione fino a comprendere tutto il tessuto della diapositiva, a prescindere dalla colorazione modello o altri aspetti osservabili del campione. </li><li> Utilizzando la console di ScanScope, per ogni canale (DAPI, Cy3 e Cy5) determinano una esposizione ottimale come segue: <ol class="lroman"><li> Seleziona una regione di tessuto per interrogare - questo settore dovrebbe, idealmente, essere nella regione del tumore del tessuto per fornire la migliore rappresentazione. </li><li> Utilizzando la funzione ScanScope esposizione automatica Console, valutare il tempo di esposizione suggerito per ogni canale, con messa a fuoco dell&#39;immagine. </li><li> Ripetere più fino a 3-5 regioni di ciascun campione di confirm stabilità del valore. </li></ol></li><li> Seleziona una regione addizionale (come mostrato da un diamante blu sulla immagine della console ScanScope) lontano dal tessuto, ma ancora all&#39;interno della regione coprioggetto della diapositiva, per definire un&#39;area pianeggiante immagini di sfondo in cui la correzione di campo saranno acquisite per ogni filtro. </li><li> Recensione queste immagini prima dell&#39;acquisizione delle immagini. Se le immagini sembrano avere elevato background o artefatti altra immagine, la regione immagine deve essere spostata e nuove immagini acquisite. </li><li> Le immagini acquisite diapositive digitali vengono caricati automaticamente nel database Spectrum Aperio. </li></ol> 4. AQUA analisi delle immagini automatico <ol class="lalpha"><li> Visualizzare le immagini digitali scivolare tutto nel database Spectrum e annotare le aree tumorali di interesse nel contesto di tutto il tessuto e pattern di colorazione (s). </li><li> Selezionare la diapositiva da analizzare utilizzando AQUAnalysis dalla lista diapositive digitali nella banca dati Spectrum facendo doppio clic sul pollicechiodo immagine (in alternativa, selezionare la casella di controllo accanto l&#39;immagine e poi selezionare &#39;Visualizza immagini&#39; dal menu in cima alla lista). Si aprirà automaticamente il software ImageScope e immagini a colori fusi del campione di tessuto. </li><li> Utilizzare questo software per navigare l&#39;immagine utilizzando gli strumenti forniti. </li><li> Utilizzando la accompagna H &amp; E (sia la diapositiva fisico o un&#39;immagine commentata), annotare la regione di interesse sull&#39;immagine fluorescente. Più regioni di interesse, singoli cerchiato aree, possono essere selezionati su un singolo campione. Vi è anche uno strumento di &#39;negativo&#39; che viene utilizzato per escludere le aree all&#39;interno di una regione selezionata (cioè il tessuto danneggiato, le aree di scarsa istologia, non tumorali aree, detriti, ecc.) </li><li> Salva lo strato annotazione (s) sull&#39;immagine. </li><li> Tornare al menu principale spettro e selezionare la casella di controllo accanto all&#39;immagine che è stato appena annotato. Selezionare &#39;Analizzare&#39; dalla barra dei menu nella parte superiore della lista. </li><li> Nella finestra di analisi che verrà su, Select &quot;HistoRx AQUA Analisi&quot; dal menu a tendina. </li><li> Se ci sono più livelli di annotazioni, utilizzare le caselle di controllo per selezionare il livello appropriato (s) per l&#39;analisi. </li><li> Premere il pulsante &#39;Analizza&#39; quando è pronto per iniziare. </li><li> A questo punto, una finestra di console minimizzata apparirà nella barra delle applicazioni di Windows. Questo mostrerà l&#39;avanzamento del trasferimento delle immagini dal database Spectrum al PC locale (l&#39;operazione &#39;tirare&#39;). </li><li> Una volta che i dati vengono trasferiti, AQUAnalysis lancerà. L&#39;utente può quindi utilizzare tutte le funzioni interne del software per visualizzare, esplorare e analizzare le immagini. </li><li> La regione annotato delle immagini dal database spettro è suddiviso in piastrelle di immagine 512x512 pixel - ognuno dei quali saranno segnati singolarmente. </li><li> Per questo studio, un algoritmo non supervisionato punteggio AQUA, sulla base di clustering dei dati, è stato utilizzato 8. In questo algoritmo, i punteggi AQUA sono generate come segue: <ol class="lroman"><li> Il pan-citocheratina immagine SIgnal è thresholded sopra di fondo e quei pixel sono usati per definire una &#39;maschera&#39; del tumore, che viene poi utilizzato per i calcoli successivi. L&#39;alta espressione pan-citocheratina pixel definiscono anche le regioni citoplasmatiche / non-nucleare delle cellule tumorali. </li><li> Pixel con segnale alto nel canale DAPI che si trovano all&#39;interno della maschera di tumore sono identificati come nucleare in natura. </li><li> L&#39;algoritmo di clustering, inoltre, esamina i pixel che sono a bassa intensità sia per colorazione DAPI o espressione di citocheratina e tenta di attribuire a loro parzialmente o compartimenti nucleari o citoplasmatici, o lo sfondo. </li><li> Una volta che tutti i pixel sono assegnati ad uno dei comparti tumore o di fondo, l&#39;intensità del segnale proveniente dalla proteina bersaglio (ER o HER2) viene quindi calcolata all&#39;interno di ciascuno dei comparti e normalizzato alle dimensioni dei vani, producendo così i punteggi AQUA. </li><li> Immagini che non hanno una rappresentanza sufficiente tumore non sono stati segnati (come definito da chi ha less del 5% dei pixel che rappresentano tumore). Queste regioni, inoltre, produrre il valore di un &#39;risultato finale&#39; chiamato &#39;Fail&#39; e può quindi essere rimosso nelle successive analisi statistiche. </li><li> Inoltre, se a seguito di riesame, un operatore identificato i campi che non erano adatti per il punteggio a causa di campione o artefatti di imaging (es. tessuto ripiegato, detriti), questi campi sono stati redatti da segnare e ha prodotto un &#39;Final Result&#39; chiamato &#39;Fail&#39;. </li></ol></li><li> I risultati di punteggio AQUA sono le tabelle dei punteggi associati a ogni piastrella 512x512 pixel nella regione di interesse all&#39;interno di un intero campione sezione di tessuto. Questi file, in formato. CSV, può quindi essere utilizzata per la successiva analisi statistica. </li></ol> 5. Analisi Statistica: Tutte le analisi statistiche vengono effettuate in SPSS (IBM) <ol><li> Ove possibile, per le operazioni di grandi dimensioni, generare file di codice della sintassi SPSS (. Sps) per eseguire manipolazioni di dati e fasi di analisi. Sintassi del codice di esempio viene fornito come file supplementari. </li><li&gt; Leggi i file di dati in SPSS. Rimuovere le variabili non utilizzate nei dati grezzi (ad esempio parametri dello strumento specifico, i punteggi AQUA da non utilizzati compartimenti). </li><li> In cui le regioni hanno un &#39;Risultato Finale&#39; di &#39;Fail&#39; (vedi sopra), segno di questi valori come SYSMIS, che li toglie dalle analisi numeriche. </li><li> Aggregare tutti i dati per tutte le diapositive per ogni marcatore (ER o HER2) in un singolo set di dati master in formato SPSS. Utilizzare questo file master per tutti i calcoli successivi. </li><li> L&#39;utilizzo di un file di sintassi SPSS (uno per ogni marcatore: ER o HER2 (vedi file di sintassi supplementare) i dati sono stati ulteriormente validati e Simpson Indici di diversità calcolato come segue: <ol class="lroman"><li> Generare un file analitico maestro, al fine di impedire la modifica dei dati di base impostata precedentemente generato. </li><li> Validare i dati anagrafici insieme contro i dati grezzi e le immagini generate. </li><li> Produrre statistiche di riepilogo per i punteggi AQUA per ogni campione (numero di campi, media punteggio, punteggio mediano, minimum punteggio, punteggio massimo, e la deviazione standard dei punteggi per il campione). </li><li> Controllare un campione casuale di risultati con l&#39;originale prime file di output dei dati e contro i dati di immagine grezzi segnato. </li></ol></li><li> Per generare le immagini mappa di calore (indicato nelle figure 2 e 3): <ol class="lroman"><li> &#39;Bin&#39; i dati di punteggio AQUA (utilizzando la funzione &#39;Categorizzazione visiva&#39; in SPSS) in otto livelli di individuali. Per ER, i punteggi nucleare sono stati utilizzati, per HER2, i punteggi citoplasmatici sono stati utilizzati. </li><li> Derive cassonetti in modo che ogni bin rappresenta una percentuale uguale di casi disponibili presso l&#39;intero set di dati. </li><li> Usare &#39;Split File&#39; la funzione di SPSS in modo che tutto l&#39;output successivo sarebbe a livello di un &#39;campione per vetrino /&#39;. </li><li> Plot ogni regione (corrispondente a una piastrella 512x512) per la sua x, y coordinate e colore con un valore corrispondente al raccoglitore in cui è stato allocato (vedi figure 2 e 3). </li></ol></li><li> Per generare punteggi eterogeneità, il codice è stato scritto per generare un Simpsonindice di diversità usando i punteggi AQUA. <ol class="lroman"><li> L&#39;indice di Simpson della diversità, come qui utilizzato, è definito come: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Dove N è il numero totale dei punteggi / campi utilizzati per un determinato campione e n è il numero di punteggi / campi in un dato gruppo di punteggi standardizzati (prodotto come descritto di seguito). </li></ol></li><li> Utilizzare il file master di analisi descritto sopra per la sorgente dati. Negli esempi mostrati, tutti i calcoli ER utilizzato il punteggio nucleare, AQUA e HER2 calcoli utilizzati il ​​punteggio citoplasmatica AQUA. Eseguire i calcoli che seguono per ogni campione / diapositive. </li><li> Poiché i dati di fluorescenza è soggetta a instabilità della varianza, in modo tale che grandezza errore si propaga con intensità, applicare logaritmica (base 2) normalizzazione di tutti i punteggi AQUA. </li><li> Ulteriori trasformare il normalizzato (log trasformato) dati in z-(standard) punteggi. <ol class="lroman"><li> Lo Z-score trasformazione è calcolato uns segue: Z = (punteggio AQUA - media di tutti i punteggi per un campione) / deviazione standard dei punteggi per il campione. Questo si traduce la distribuzione dei punteggi in una distribuzione di deviazioni attorno al valore centrale della deviazione zero. </li></ol></li><li> Bin queste Z-score i valori in sei gruppi (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Calcolare il numero dei valori assegnati in ogni bin e somma per ogni bin. Utilizzare questo valore, insieme al numero totale di campi, di calcolare un valore per ciascuna delle sei cassonetti utilizzati per l&#39;indice. </li><li> Somma di questi valori e sottrarre da uno a produrre l&#39;indice di diversità. </li><li> L&#39;indice di diversità fornisce un indicatore della diffusione dei punteggi intorno alla media di un campione particolare. Così, gli indici più elevati indicano una diffusione più ampia dei punteggi, o maggiore eterogeneità di espressione. Al contrario, gli indici più bassi, indicano una minore variazione nella misurazione di espressione e di espressione omogenea nel campione. Questo è illustrato nella FigurES 2 e 3. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Terapia mirata con farmaci tossicità relativamente bassa, come il tamoxifene e trastuzumab, non sono standard di cura per i pazienti con tumore ovarico. Ci sono buone evidenze che il platino, taxani chemioterapia di prima linea è superiore ad altri regimi di chemioterapia per il cancro ovarico 9-13, e mentre il 70-80% dei pazienti risponde inizialmente, la maggior parte delle ricadute e muoiono della loro malattia. Misura di biomarcatori che potrebbero predire la risposta alle terapie alternative sarebbero utili nella scelta di una terapia individualizzata per ogni paziente, e poiché la pressione chemioterapia selezione esercita su un tumore, sopravvivono cellule tumorali può possedere caratteristiche diverse e rappresentano una sottopopolazione del tumore prima della terapia; quantificare questo cambiamento potrebbe quindi essere utile. Abbiamo applicato il nostro metodo di associazione eterogeneità di espressione di ER e HER2 in campioni di cancro ovarico, prima e dopo la chemioterapia, in Order per misurare le variazioni quantitative di espressione, e valutare la relazione tra biomarker espressione prima e dopo la terapia. Sia ER e HER2 dimostrare marcata eterogeneità all&#39;interno del tumore individuale e, in alcuni tumori, le variazioni dell&#39;indice di Simpson dopo la terapia di eterogeneità relativamente alto di eterogeneità bassa, rappresentata dalla diminuzione Simpson punteggi indice (vedi figure 2 e 3). Ciò supporta la nozione che la selezione clonale si verifica in risposta alla chemioterapia citotossica, ancora più importante, questo può essere sfruttata utilizzando terapia mirata contro la popolazione residua, al fine di meglio personalizzare la terapia per i pazienti oncologici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figura 1. Microfotografie ematossilina e eosina macchiato di diverse aree del cancro alle ovaie stesse mostrando morfologia variabile. (A) x40 microfotografia mostra due aree adiacenti di tumore con diversi morfologia. Viste ad alta potenza (x200) rivelano cellule con citoplasma di compensazione e un modello solido di crescita nella parte superiore del tumore (B), mentre la parte inferiore del tessuto (C) è più omogeneo citoplasma eosinofilo e un modello di crescita papillare. Questo tumore, tuttavia, essere classificato come sottotipo sieroso papillifero istologico ai fini di una gestione ulteriore. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figura 2. Heatmaps L&#39;eterogeneità di espressione proteica in citocheratina ER-positivi tessuto ovarico cancro, prima (pannello superiore) e dopo (pannello inferiore) la terapia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figura 3. Heatmaps L&#39;eterogeneità di espressione della proteina HER2-positivo in citocheratina tessuto ovarico cancro, prima (pannello superiore) e dopo (pannello inferiore) la terapia.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ e CS sono dipendenti di HistoRx, Inc.

Il metodo descritto qui di quantificazione permette di eterogeneità molecolare in standard fissati in formalina, incluse in paraffina, sezioni istologiche di materiale tumorale. Il metodo permette un valore da assegnare al grado di eterogeneità in una sezione di tessuto, in modo che questa possa poi essere preso in considerazione come una variabile nello sviluppo di biomarker e analisi. Mentre in generale è preferibile che i biomarcatori del tessuto sono omogenei rispetto a espressione, in modo che il saggio è meno soggetto a errori di campionamento o pregiudizi, potrebbe in alcune circostanze essere utile per quantificare l&#39;eterogeneità come parametro. Per esempio, come mostrato nell&#39;esempio illustrativo per ER e HER2, biomarcatori comuni mostrano una notevole eterogeneità di espressione ed è attualmente noto se questo rappresenta un fattore prognostico indipendente predittivo o riguardo al risultato clinico o la risposta alla terapia, rispettivamente. Allo stesso modo, come illustrato, la terapia si potrebbe modificare dinamicamente lapopolazioni costituente delle cellule, e quindi la misura di arricchimento obiettivo potrebbe essere utile nel guidare le decisioni terapeutiche. Tuttavia, la tecnica è limitata dagli stessi fattori che limitano la tradizionale analisi istopatologica o biomarker (come la immunoistochimica). Il risultato dipende dal tipo, dimensione e qualità del tessuto in fase di analisi, e quindi una sezione di tessuto unico non può essere rappresentativo l&#39;intero tumore. Infatti, l&#39;indice di Simpson può essere indebitamente influenzati dalla dimensione del tessuto (numero di fotogrammi catturati e punteggi AQUA misurato). L&#39;immunogenicità del epitopi misurato può essere soggetto a incontrollabili pre-analitica artifactually fattori che alterano la loro espressione attraverso la sezione di tessuto (come il tempo di ischemia fredda, o la lunghezza di fissazione, e artefatto bordo). Ciò è particolarmente un problema per fosfo-epitopi, che sono notoriamente labili 14, 15. Pertanto la tecnica potrebbe essere più adattoagli esemplari resezione piuttosto che piccole biopsie, ed eseguito su più sezioni piuttosto che uno solo. In ultima analisi, tecniche di imaging 3D può offrire l&#39;opportunità di quantificare meglio questo parametro. La tecnica come presentato può anche essere limitata da fattori biologici, come la variabilità nella espressione della citocheratina epitopo mascheramento. Questo potrebbe essere di particolare preoccupazione in quei tumori, tra cui il cancro al seno e alle ovaie, che subiscono epiteliali a mesenchimali transizione (EMT) o sono arricchiti per i non-epiteliali componenti o le cellule staminali 16, come è stato recentemente dimostrato che si verificano in chemioterapia trattamento del cancro ovarico in vitro 17, e nei pazienti con carcinoma mammario in risposta alla terapia 18. Questa limitazione può essere superata utilizzando anticorpi mascheramento alternativi (o un cocktail di anticorpi), come citocheratina più vimentina, che è upregulated in EMT 16. Inoltre, poiché gli altri componenti del tessuto (il microfonoroenvironment), come fibroblasti o cellule endoteliali vascolari sono sempre più presi di mira da terapie biologiche, la tecnica può anche essere ampliato per segnare questi componenti, utilizzando maschere specifiche per i comparti di interesse, come PECAM / CD31 a macchia di cellule endoteliali vascolari . Anche se l&#39;adattamento dell&#39;indice della Simpson è stata utilizzata come misura di eterogeneità nel protocollo attuale grazie alla sua semplicità, altre misure di eterogeneità potrebbero essere utilizzati, come ad esempio semplici misure di tendenza centrale (media, varianza, mediana, ecc.) Inoltre, la Simpson calcoli dell&#39;indice potrebbe essere modificato per adattarsi meglio una particolare popolazione di prova. L&#39;uso di Z-score trasformazioni permette il punteggio di essere più applicabile per i marcatori multipli in quanto l&#39;eterogeneità si basa sulla deviazione intorno alla media di un insieme di dati. Tuttavia, la gamma complessiva di punteggio può essere limitato in questo tipo di trasformazione. Alcuni progetti potrebbero essere più adattisemplicemente bin i punteggi AQUA reale per tutti i campioni di un insieme particolare marcatore. La scelta del numero di cassonetti e di tagli è anche una limitazione nella gamma di valori che può provocare e può essere ottimizzato per l&#39;alternativa disegni sperimentali. Abbiamo usato ER e HER2 in questo studio come biomarcatori candidato, dal momento che sono già utilizzati in clinica, aiutare a rispondere a quesiti clinici rilevanti rispetto alla efficacia delle terapie mirate, e sono noti per esibire notevole eterogeneità e il cambiamento nella scuola primaria e distanti malattia 19. Tuttavia, l&#39;indicatore ottimale di eterogeneità Resta da stabilire. Altre possibilità possono includere i marcatori di clonalità citogenetica, come quelli già utilizzati negli studi PESCE interfase 20. L&#39;approccio richiede la convalida ulteriormente in grandi coorti ben annotato cliniche o studi clinici al fine di stabilire ulteriormente la rilevanza di questo parametro nella biologia del cancro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Usato come corredato da fornitore </td></tr><tr><td> Spettro </td><td> Aperio </td><td> Spettro </td><td> Valori di configurazione e catalogo variano su come le istituzioni locali a creare il proprio database e struttura IT. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, in collaborazione con AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Il pacchetto AQUAjustment AQUAnalysis permette di utilizzare le immagini memorizzate in Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 su 400 di diluizione </td></tr><tr><td> topo anti-pan citocheratina </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 su 50 di diluizione </td></tr><tr><td> Anticorpi diluente </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Immaginate capra-coniglio HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Proteine ​​blocco </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Capra anti-topo Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI montaggio medio </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza immunocolorazione Centro </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Usato qui per banco immunofluorescenza </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Eterogeneità morfologica all&#39;interno di un singolo tumore è ben riconosciuta da istopatologi nella pratica chirurgica. Anche se questo spesso assume la forma di aree di differenziazione riconosciuti distinte in sottotipi istologici, o differente grado patologico, spesso ci sono differenze più sottili nel fenotipo che sfidano classificazione accurata (Figura 1). In definitiva, poiché la morfologia è dettata dal fenotipo molecolare alla base, aree con differenze visibili sono suscettibili di essere accompagnata da differenze nell&#39;espressione delle proteine ​​che orchestrano le funzioni cellulari e di comportamento, e quindi, l&#39;aspetto. Il significato del visibile e invisibile (molecolare) eterogeneità per la prognosi non è nota, ma studi recenti dimostrano che, almeno a livello genetico, l&#39;eterogeneità esistente nel 1,2 tumore primario, e alcuni di questi sub-cloni dar luogo a metastasi ( e quindi letale) della malattia. Inoltre, alcune proteine ​​sonomisurata come biomarcatori perché sono gli obiettivi della terapia (ad esempio ER e HER2 per tamoxifene e trastuzumab (Herceptin), rispettivamente). Se queste proteine ​​mostrano espressione variabile all&#39;interno di un tumore poi risposte terapeutiche può essere anche variabile. Gli schemi ampiamente utilizzato punteggio istopatologici per immunoistochimica o ignorano, o numericamente omogeneizzare la quantificazione di espressione della proteina. Allo stesso modo, nelle tecniche distruttive, dove vengono omogeneizzati i campioni tumorali (come ad esempio profili di espressione genica), informazioni quantitative possono essere chiarito, ma le informazioni spaziali è perduto. Eterogeneità genetica approcci mappatura nel cancro del pancreas hanno fatto affidamento sia sulla generazione di una sospensione singola cella 3 o il 4 macrodissection. Un recente studio ha utilizzato punti quantici per mappare l&#39;eterogeneità morfologica e molecolare nel tessuto cancro alla prostata 5, fornendo prova di principio che la mappatura morfologica e molecolare è fattibile, ma cadendo short di quantificare l&#39;eterogeneità. Dal immunoistochimica è, nella migliore delle ipotesi, solo semi-quantitative e soggetti a bias intra-ed inter-osservatore, più sensibili e metodologie quantitative sono necessarie per mappare con precisione e quantificare l&#39;eterogeneità dei tessuti in situ. Abbiamo sviluppato e applicato una metodologia sperimentale e statistico per quantificare sistematicamente l&#39;eterogeneità di espressione della proteina in sezioni di tessuto di tumori tutto, sulla base dell&#39;analisi automatica quantitativa (AQUA) del sistema 6. Sezioni di tessuto sono etichettati con anticorpi specifici diretti contro citocheratine e gli obiettivi di interesse, accoppiato al fluoroforo marcati con anticorpi secondari. Le diapositive vengono esposte con un tutto-slide scanner fluorescenza. Le immagini sono suddivise in centinaia di migliaia di piastrelle, ed ogni tessera viene quindi assegnato un punteggio AQUA, che è una misura della concentrazione di proteine ​​all&#39;interno del epiteliale (tumore), componente del tessuto. Heatmaps sono generati per rappresentare l&#39;espressione delle proteine ​​dei tessuti e eterogeneità assegnato un punteggio, utilizzando una misura statistica di eterogeneità originariamente utilizzato in ecologia, in base indice di biodiversità del Simpson 7. Ad oggi non ci sono stati tentativi di mappare sistematicamente e quantificare questa variabilità in tandem con l&#39;espressione della proteina, in preparati istologici. Qui illustriamo il primo utilizzo del metodo applicato per ER e HER2 espressione biomarcatori nel carcinoma ovarico. Usando questo metodo apre la strada per analizzare l&#39;eterogeneità come variabile indipendente negli studi di espressione dei biomarcatori negli studi traslazionali, al fine di stabilire il significato di eterogeneità nella prognosi e la previsione di risposte alla terapia.

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Qui si descrive un metodo per quantificare l&#39;eterogeneità molecolare in sezioni istologiche di materiale tumorale mediante immunofluorescenza quantitativa, analisi di immagine, e una misura statistica di eterogeneità. Il metodo è destinato ad essere utilizzato nello sviluppo di biomarker clinici e analisi.

Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.5K Views.  University of Edinburgh. Qui si descrive un metodo per quantificare l'eterogeneità molecolare in sezioni istologiche di materiale tumorale mediante immunofluorescenza quantitativa, analisi di immagine, e una misura statistica di eterogeneità. Il metodo è destinato ad essere utilizzato nello sviluppo di biomarker clinici e analisi.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Ricerca

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identificazione dei<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Inserimenti trasposone nei tumori solidi utilizzando Linker-mediata PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

L&#39;uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all&#39;interno dei singoli tumori a cellule renali

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Imaging ottico dei tumori cerebrali e artrite Uso fluorescente SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement whereas coordinate mapping of hyolaryngeal mechanics using Modified Barium Swallow (MBS) uses one set of coordinates to calculate multiple variables of interest. For demonstration purposes, ten kinematic measurements were generated from one set of coordinates to determine differences in swallowing two different bolus types. Calculations of hyoid excursion against the vertebrae and mandible are correlated to determine the importance of axes of reference.
To demonstrate coordinate mapping methodology, 40 MBS studies were randomly selected from a dataset of healthy normal subjects with no known swallowing impairment. A 5 ml thin-liquid bolus and a 5 ml pudding swallows were measured from each subject. Nine coordinates, mapping the cranial base, mandible, vertebrae and elements of the hyolaryngeal complex, were recorded at the frames of minimum and maximum hyolaryngeal excursion. Coordinates were mathematically converted into ten variables of hyolaryngeal mechanics.
Inter-rater reliability was evaluated by Intraclass correlation coefficients (ICC). Two-tailed t-tests were used to evaluate differences in kinematics by bolus viscosity. Hyoid excursion measurements against different axes of reference were correlated. Inter-rater reliability among six raters for the 18 coordinates ranged from ICC = 0.90 - 0.97. A slate of ten kinematic measurements was compared by subject between the six raters. One outlier was rejected, and the mean of the remaining reliability scores was ICC = 0.91, 0.84 - 0.96, 95% CI. Two-tailed t-tests with Bonferroni corrections comparing ten kinematic variables (5 ml thin-liquid vs. 5 ml pudding swallows) showed statistically significant differences in hyoid excursion, superior laryngeal movement, and pharyngeal shortening (p &#60; 0.005). Pearson correlations of hyoid excursion measurements from two different axes of reference were: r = 0.62, r2 = 0.38, (thin-liquid); r = 0.52, r2 = 0.27, (pudding).
Obtaining landmark coordinates is a reliable method to generate multiple kinematic variables from video fluoroscopic images useful in dysphagia research.

Coordinate mapping is a method of documenting salient features of hyolaryngeal biomechanics in the pharyngeal phase of swallowing. This methodology uses image analysis software to record coordinates of anatomical landmarks. These coordinates are imported into an excel macro and translated into kinematic variables of interest useful in dysphagia research.

Coordinare mappatura dei Hyolaryngeal Meccanica di deglutizione

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Mass quantitativa spettrometrica Profiling di proteomi cancro-cellulari derivate da liquido e tumori solidi

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

Mappatura quantitativa della ventilazione specifica nel polmone umano utilizzando l'imaging a risonanza magnetica protonica e l'ossigeno come agente di contrasto

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine ​​nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa

Mappatura eterogeneità di espressione delle proteine nei tumori mediante immunofluorescenza quantitativa