Questo protocollo è significativo perché l'ottimizzazione dello sviluppo e il trasferimento di protocolli di immunofluorescenza multiplex è complesso e impegnativo. Per molti laboratori la presa di un protocollo ottimizzato è inestimabile. L'immunofluorescenza multispettrale ci consente di valutare sia la posizione che l'identità di più tipi di cellule all'interno e intorno al tumore.
Questa è una potente combinazione di informazioni negli studi di oncologia immunitaria. L'uso più convincente per l'immunofluorescenza multiplex è l'oncologia immunitaria. Ma la capacità di rilevamento di più tipi di cellule immunitarie in setu può essere sfruttata in tutte le terapie auto-immunitarie e infiammatorie.
Conoscere la posizione e il fenotipo delle cellule immunologiche all'interno e intorno alle cellule soliduali è una risposta prognostica e prevedibile all'immunoterapia specifica del tumore. L'ottimizzazione e la convalida del protocollo sono passaggi chiave che non devono essere affrettati. I nuovi sviluppatori dovrebbero familiarizzare con i nuovi tipi di artefatti associati all'imaging multispettrale.
Per individuare il protocollo multi-plex di base precaricarlo sullo scalener automatico. Filtrare per all'invece di preferito'nella schermata del protocollo. Prima di apportare modifiche, salvare il protocollo originale e fare clic sulla scheda protocolli e quindi fare clic con il pulsante destro del mouse su Multiplex Opal 6 per selezionare la copia.
Modificare il nome in 7 Multiplex Protocol 1'nella nuova finestra e selezionare la scheda associata al dispositivo corretto. Abbinare il protocollo nella tabella supplementare S1'e fare clic su aggiungi reagente per aggiungere un passo di inibizione delle parossidie di dieci minuti, selezionando l'inibitore della perossidasi come reagente. Verificare che i passaggi di blocco utilizzino un buffer di blocco dell'inibitore della protein chinasi, che ogni anti-corpo primario si riferisca al reagente appropriato, che i passaggi anti-corpo secondari utilizzi un polimero perossidasi rafano e che il dapi spettrale fornito con il kit di automazione multispettrale sia utilizzato.
Assicurarsi che il protocollo contenga l'inibitore della perossidasi, seguito da sei corse di colorazione sequenziale ognuna contenente un passo di blocco proteico, un anti-corpo primario, un anti-corpo secondario, un pavimento di Tyramide e quindi il recupero dell'antigene per rimuovere gli anti-corpi. Per aggiungere i controlli drop, copiare il nome 7 Multiplex Protocol 1' e modificarlo in 7 Multiplex Protocol 1 CD68 Drop. Modificare il reagente anti-corpo CD68 in Mouse IgG e salvare il protocollo.
Quindi, creare altri sei nuovi protocolli, uno per ogni controllo di rilascio e uno per il controllo iso-tipo completo nello stesso modo. Crea un protocollo di controllo delle rilascio per ogni destinazione nello stesso modo in cui ti ho mostrato qui. Per preparare un kit di rilevamento della ricerca, riempire il contenitore aperto da 30 millilitri contrassegnato per una salina tris-buffered 1X con soluzione salina tris-buffered 1X e posizionare il contenitore nella posizione più lontana dalla maniglia nel Multiplex Research Kit 1.
Etichettare due contenitori aperti da 30 millilitri muli-blocco spettrale e secondario multispettrale e riempire il contenitore del blocco mutli-spettrale con 30 millilitri di diluente anticorpo tampone bloccante dal kit di colorazione multispettrale. Riempire il contenitore secondario multispettrale con 30 millilitri di polimero anticorpale secondario anti-topo anti-rabido dal kit di colorazione multispettrale e aggiungere 600 microlitri di diluente anticorpale a ciascuno dei dieci contenitori aperti da 7 millilitri. Quindi, aggiungere l'anticorpo primario concentrato ai tubi appropriati nei volumi indicati nella tabella e mescolare mediante pipettazione delicata.
Aggiungere 3 millilitri di acqua distillata doppia, più 12 gocce di dapi spettrale in un contenitore aperto da 7 millilitri e 3 millilitri di blocco di perossidasi in un secondo contenitore aperto da 7 millilitri. Sospendere di nuovo ogni pavimento liathalizzato con 75 microlitri di solfossido di dimetile e mescolare mediante pipettazione. Quindi, conservare le scorte del pavimento di amplificazione del segnale Tyramide a 4 gradi Celsius fino a quando non sono pronte.
Durante la preparazione delle singole diluizioni del pavimento TSA. Registrare tutti i reagenti sullo scalatore automatico, quindi posizionare ogni contenitore in un rack reagente e caricare tutti i reagenti sulla scala automatica. Lo scalatore rileverà la presenza e confermerà il volume di ogni reagente.
Una volta caricati tutti i reagenti, attivare il protocollo per l'esecuzione durante la notte. Al termine della procedura di colorazione, montare i campioni con scivolamenti di copertura e caricare i campioni nello scanner multi-spectral imaging platform per la scansione. Una volta analizzati tutti gli esempi, le immagini verranno formattate come file qptiff.
Aprire un programma software di analisi qptiff appropriato e fare clic su carica diapositiva'per aprire una scansione a cinque filtri dell'intera diapositiva di interesse. Accedere e utilizzare lo strumento timbro per selezionare cinque aree per l'imaging multispettrale. In Seleziona per:selezionare Acquisizione'in Dimensioni nei campi:selezionare 1x1 e in Risoluzione campo'selezionare 0,5 micrometri 20x.
Sulla base di questa colorazione della citocheratina selezionare diverse regioni con tessuto tumorale positivo alla citocheratina e tessuto stromale negativo citocheratina da immagini dalla scansione complessiva. Una volta selezionate tutte le immagini multispettrali, passare al software Vectra e modificare l'attività da scan'a multi-spectral imaging' per ogni diapositiva. Quindi, fare clic su scansione per eseguire la raccolta di imaging multispettrale.
Al termine dell'acquisizione di immagini multispettrali, utilizzate il software di un-mixing spettrale per aprire i file all'interno della cartella dell'immagine multispettrale. In formato immagine'seleziona multispettrale'Sotto formato di esempio'seleziona fluorescenza'E in Origine libreria spettrale'seleziona inForm'Per selezionare i piani, selezionare e caricare tutti e sei i piani e dapi dalle diapositive della libreria di esempio e fare clic su prepara tutto. Il software di un-mixing spettrale eseguirà unmixing spettrale su tutte le immagini aperte utilizzando i profili spettrali forniti.
Identificare e annotare il profilo spettrale auto-fluorescente. Assicurarsi di controllare la funzione auto-fluorescente per assicurarsi che sia completamente catturata nel canale auto-fluorescente dopo la non miscelazione e di testare diversi campionamenti fino a quando non viene rimossa in modo abile. Quindi valutare il modello di colorazione rispetto alle singole macchie cromogeniche dello stesso bersaglio in diapositive sequenziali dello stesso tessuto con un patologo.
Per valutare l'intensità di fluorescenza di ogni canale, utilizzare lo strumento conteggi per rilevamento delle immagini aperte. Quindi, tornare al protocollo di colorazione e regolare la concentrazione TSA per risolvere eventuali conteggi normalizzati che superano o non raggiungono l'intervallo accettabile. In questa analisi rappresentativa il tessuto tonsille ha dimostrato una colorazione della citocheratina chiaramente definita all'interno della superficie della tonsil, epitelio squamoso senza sfondo nel tessuto linfoide con citokeratina e colorazione PDL-1 evidente nell'epitelio reticolato delle cripte.
I centri germinali follicolari erano facilmente riconoscibili e ricchi di linfociti positivi Ki-67. I macrofagi presenti all'interno dei centri germinali sono stati identificati dalla loro espressione CD-68 con alcuni macrofagi osservati anche al di fuori del centro germinale. Linfociti macchiati CD-8 con distribuzione delle cellule T ed espressione PD-1 macchiavano fortemente piccoli linfociti raggruppati alla periferia del centro germinale, così come sparsi in tutta la regione interfollicolare.
Dopo che il modello di colorazione previsto è stato confermato nel controllo del tessuto tonsille, la stessa colorazione potrebbe quindi essere valutata in un campione di cancro ai polmoni. Dovrebbero inoltre essere valutati i controlli negativi dell'isotipo e i controlli di rilascio, non solo per il rilevamento dello sfondo e dell'autofluorescenza, ma anche per gli effetti ombrello e la smarrimento spettrale. I controlli a goccia sono importanti per valutare potenziali artefatti nella colorazione grazie al metodo di immunofluorescenza multi-plex durante l'ottimizzazione di un nuovo pannello multi-plex.
Ogni controllo di caduta deve mostrare lo stesso modello di colorazione del pannello multi-plesso completo, ad eccezione del singolo anticorpo primario che deve essere rimosso su ogni controllo specifico. L'immuno profiling con immunofluorescenza multispettrale consente la stratificazione di tumori e regioni secondo criteri immunitari che possono poi essere studiati da studi genomici, trascriscriomici e proteomici massicciamente multiplex. Ho usato l'immunofluorescenza multi-plesso per studiare i meccanismi di azione in oncologia e disturbi autoimmuni che consentono l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule immunitarie e patogene in un'unica sezione in setu.
Quando si lavora con anti-corpi contro proteine umane, tyramide e dapi, devono essere prese precauzioni generali, ma nessun reagente o materiale in questo protocollo è noto per essere particolarmente pericoloso.
