Ringraziamo Alberto Severini e Vanessa Goleski per facilitare lo sviluppo di analisi e commenti critici su questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Agenzia di sanità pubblica del Canada e degli Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ulteriore supporto è stato ottenuto presso l&#39;Università di Saskatchewan Fondo di pubblicazione.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Un diagramma schematico raffigurante la procedura generale è presentato nella figura 1. 1. Perlina di accoppiamento Questo descrive i metodi da utilizzare per l&#39;accoppiamento sonde oligonucleotidiche al polistirolo perle di Luminex (vedi tabella 2). I volumi sono leggermente adattati per la valutazione delle sonde di cattura nuovo in prova, questi volumi sono indicati tra parentesi. <ol><li> Rimuovere 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimmide HCl (EDC) in polvere da -20 ° C e caldo essiccatore a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le microsfere da sonciation in un sonicatore bagnomaria per 20 secondi, quindi vortex circa 20 secondi. </li><li> Trasferire 400 microlitri (100 microlitri) di microsfere di una provetta Eppendorf (ciò corrisponde a 5x10 6 o 1.25x10 6 microsfere). Luminex consiglia l&#39;utilizzo di tubi in microcentrifuga a basso legame con le proteine ​​(per esempio tubi Eppendorf LoBind proteine, numero di catalogo 0030 108,094) per evitare che le perle non accoppiato di attaccarsi ai tubi e interferendo con recupero tallone. Non abbiamo trovato che questo è un problema utilizzando le normali tubi da microcentrifuga in polipropilene, che si utilizzano in genere (ad esempio, numero di catalogo VWR 87003-298). </li><li> Pellet a 14000 xg per 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le microsfere in 50 microlitri (12,5 mL) di temperatura ambiente 0,1 M 2 - (N-Morpholino) etano acido (MES) pH 4.5. </li><li> Preparare una soluzione fresca di EDC a 10 mg / ml in acqua. <ol><li> Preparare meno di 1 ml di questa soluzione pesando 5-10 mg di EDC su una bilancia analitica, poi l&#39;aggiunta di acqua a 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Aggiungere 1 nmol di 5&#39;-amino oligonucleotide catturare C12-modificato (Tabella 2) a microsfere e mescolare nel vortex. 1 nmol è di 5 ml di 200 mM oligonucleotide. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di soluzione fresca EDC per le microsfere e mescolare nel vortex per 5 secondi. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li><li> Scartare la soluzione EDC (passo 1,6) e preparare un nuovo campione dei 10 mg / ml EDC in acqua come sopra (passo 1,6). </li><li> Aggiungere altri 2,5 ml di soluzione fresca EDC per le microsfere e vortex per 5 secondi. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. </li><li> Lavare le perle con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,02% di Tween 20. Vortex (opzionale ultrasuoni per 20 secondi) in modo da risospendere le sfere. </li><li> Centrifugare 14000 xg 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le perle di nuovo con l&#39;aggiunta di 1 ml di solfato di sodio 0,1% dodecil (SDS). Vortex (opzionale ultrasuoni per 20 secondi) in modo da risospendere le sfere. </li><li> Centrifugare 14000 xg 1 minuto. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le sfere in 100 l (25 mL) di Tris-EDTA (TE) buffer [10 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0]. </li><li> Enumerare le perle in un emocitometro o contatore Coulter per determinare la concentrazione stock. </li><li> Preparare un Mix microsfere Maestro diluendo ogni perla ad una concentrazione finale di 100 perline / mL in TE buffer. Piscina accoppiato perline corrispondente al complesso desiderata del test (ad esempio per un 10-plex test, mix 10 perle diverse unita ad una concentrazione finale di 100/μl di ogni perla). </li><li> Conservare il Mix microsfere Maestro a 4 ° C al buio. L&#39;impasto può essere conservato per mesi se mantenuto in queste condizioni. </li></ol> 2. Chaperonine 60 universale destinazione (cpn60 UT) amplicone produzione e generazione di singoli filamenti. <ol><li> Generare la reazione a catena della polimerasi (PCR) del prodotto per ogni campione. Includere le fosforotioato-e impostare fondo biotina modificato 5 &#39;(Tabella 1). Vedere la Tabella 3 per i volumi per miscelare e concentrazioni. </li><li> Subito dopo la PCR è completa, aggiungete 2 microlitri (20 unità) di T7 exonuclease a ciascuna provetta PCR (PCR buffer sarà sufficiente per la reazione T7). Incubare la reazione a temperatura ambiente (~ 22-25 ° C) per 40 minuti. </li><li> Al termine di questa incubazione, aggiungere 12,5 ml di 0,5 M etilene diammina (EDTA) pH 8,0 e mescolare. Questo dà un totale di ~ 64.5μl del singolo filamento prodotto della PCR. </li></ol> 3. Ibridazione di singolo filamento prodotto PCR di oligonucleotidi ad accoppiamento perle di polistirene. <ol><li> Preriscaldare lo strumento a 60 ° C per mantenere la temperatura di ibridazione durante l&#39;analisi. Accendere il riscaldatore piattaforma utilizzando il software dello strumento e assicurarsi di utilizzare il blocco di riscaldamento in ottone che si inserisce la PCR-stile piatto che contiene la miscela ibridato tallone. </li><li> Risospendere microsfere Master Mix (step 1,20) con una pipetta, una quantità appropriata dispensare in una provetta Eppendorf, tappo del tubo, e sonicare in un sonicatore bagnomaria per 2 minuti. In alternativa, per garantire la coerenza assoluta nel tallone resuspeESPANSIONE, la master mix microsfere possono essere risospese vortex e pipettaggio, poi sonicazione come sopra, poi dispensare la quantità desiderata in un tubo di polipropilene Eppendorf. </li><li> Dispensare 17 ml di prodotto a singolo filamento PCR (punto 2.2) nei rispettivi pozzetti, di un basso profilo da 96 pozzetti Pozzetto piastra PCR (Tabella 2). Aggiungere 33 ml di risospeso, miscela sonciated perlina in ogni pozzetto. Coprire con coperchio in silicone (Tabella 2) e toccare delicatamente. </li><li> Mettere la piastra nel termociclatore con un programma di: 95 ° C per 5 min, 60 ° C per 10 min, 60 ° C attesa, 60 ° C per 5 minuti, fine. Avviare il programma. </li><li> Fai fresca streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) soluzione; avrete bisogno di 25 microlitri per bene (fare diversi pozzi extra). Fai la SA-PE soluzione diluendo magazzino SA-PE (1 mg / ml) 1:50 a 20 mcg / ml con 1x cloruro tetrametilammonio (TMAC) buffer (3 M TMAC; Sarkosyl 0,1%; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 , 4 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Quando il termociclatore arriva al 60 ° tenere passaggio C,aprire il coperchio, togliere il coperchio di silicone e aggiungere SA-PE soluzione direttamente a ciascun bene (non prendere la piastra dal termociclatore). Riposizionare il coperchio di silicone, chiudere il coperchio termociclatore e riprendere il programma. </li><li> Quando il programma è completo, prendere il piatto fuori e velocemente trasferire alla macchina Bioplex da leggere. Piastra deve essere letta entro 10 minuti. Leggi a 60 ° C, in modo che il Bioplex preriscaldata a questa temperatura. Essere certi che l&#39;altezza della sonda è stato adattato per ospitare la piastra utilizzato, come descritto nel manuale d&#39;uso per lo strumento utilizzato. </li><li> Per un accurato tallone e la rilevazione del segnale, le impostazioni cancello sulla Bioplex deve essere impostato in base al tipo di microsfere in uso. Perle di polistirene BioRad richiedono un&#39;impostazione cancello di 4,335-10,000 mentre microsfere magnetiche richiedono un ambiente di 5.000-25.000. C&#39;è anche la possibilità di utilizzare la piastra utilizzando l&#39;impostazione Alta PMT che aumenta il valore di guadagno reporter. Ciò che possoncrease l&#39;intensità dei segnali inferiore tuttavia è importante includere un controllo appropriato negativo come segnale di fondo sarà anche aumentata. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Uno dei nostri obiettivi nello sviluppo e attuazione del presente saggio è stato quello di renderlo il più semplice e snella possibile. Abbiamo quindi ottimizzato la critica post-amplificazione fasi, compreso il tempo di trattamento esonucleasi T7 e il tempo di ibridazione al fine di sviluppare un metodo che può essere completato in un arco di tempo ragionevole. Come mostrato nella Figura 2A, il trattamento T7 dell&#39;amplicone è essenziale per la generazione del segnale, come la maggior parte delle sonde avevano poco o nessun segnale con breve o nessun trattamento T7. Il segnale aumenta in modo lineare fino a circa 40 minuti, momento in cui l&#39;aumento del segnale di rallentamento. Nessun degrado del segnale è stata osservata anche a 2 ore di tempo di trattamento T7, indicando che la modifica fosforotioati dei primer è altamente efficace nel prevenire Targedegrado filone t come descritto 15. Abbiamo scelto 40 minuti per tempo di trattamento T7 ridurre al minimo il tempo complessivo di protocollo, ma è chiaro dalla Figura 2A che il trattamento T7 può andare avanti per molto più tempo. Abbiamo anche determinato l&#39;effetto del tempo sulla ibridazione generazione del segnale (Figura 2B) ed ha trovato che 10 minuti sono stati sufficienti per il massimo del segnale, in quanto non ulteriore aumento del segnale è stata osservata anche dopo 4 ore di ibridazione. Quindi, un passo ibridazione 10 minuti è stato scelto, ancora una volta per minimizzare il tempo complessivo di analisi. Con questi risultati in mente, e con tecniche rapide di estrazione del DNA come InstaGene (Bio-Rad), l&#39;analisi globale, compresa l&#39;estrazione del DNA, PCR, e analisi Luminex può essere completato in 4-5 ore. Su una nota di cautela, il livello di aggregazione delle perle di polistirene durante una corsa o Luminex Bioplex può avere un impatto importante sulla efficacia del test. Il software Bioplex mostrerà il livello di aggregazione tallone, che si verifica quandopiù di una perla viene rilevato nel percorso laser e comporta l&#39;esclusione del segnale di ibridazione dal aggregato. Apparente aggregazione tallone può anche essere causato da qualsiasi materiale particolato che non è la dimensione corretta per un unico tallone, e può anche essere causato da bolle d&#39;aria. In uno di questi eventi, il segnale proveniente dal aggregato perlina, bolla d&#39;aria, o particella viene scartato. Nella maggior parte dei casi, troviamo che l&#39;aggregazione tallone è minimo (figura 3A) e il livello mirato di 100 eventi contare per ogni perlina è facilmente realizzabile. Occasionalmente, tuttavia, le perle mostrano un moderato (Figura 3B) o grave (Figura 3C) livello di aggregazione. In questi casi, poiché la maggior parte dei dati viene scartato, lo strumento potrebbe avere problemi a raggiungere 100 eventi per ogni tipo di perla e il risultato può essere discutibile. Il passo sonicazione (passo 3.2) ha lo scopo di minimizzare l&#39;aggregazione tallone. Inoltre, l&#39;archiviazione le perle come un mix diluire maestro microsfere (punto 1.20) può aiutare. Abbiamo notato che TMAC escludendo dalla hybritampone dization - aggiungerla alla SA-PE diluente invece (passo 3.5) - aiuta a minimizzare l&#39;aggregazione tallone. Inoltre, mentre non abbiamo testato questo, le sfere magnetiche più recenti disponibili da Luminex o BioRad sono pensati per visualizzare meno di una tendenza ad aggregarsi. I risultati dell&#39;applicazione di un 5-complesso serie Luminex targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, e L. gasseri con corrispondente Gram strisci colorati tampone vaginale sono mostrati in figura 4. Questi campioni sono stati prelevati da un singolo individuo in momenti diversi. Al tempo 0, l&#39;individuo è stato diagnosticato un BV sulla base di colorazione di Gram (Figura 4A) ed i risultati Luminex da questo stesso campione (Figura 4B) mostrano che degli organismi rappresentati nella matrice, G. vaginalis è più diffusa, mentre A. vaginae e L. iners sono stati positivi. Nove giorni dopo, l&#39;individuo era ancora BV positivo e il signal per G. vaginalis sono notevolmente aumentate, mentre A. vaginae e L. iners erano ancora positivi. È importante sottolineare che, dopo questo tempo l&#39;individuo ha cominciato a transizione verso un microbiota normale come bacilli Gram positivi è diventato rilevabile nella strisci (Figura 4A) mentre il segnale di G. vaginalis svaniva ed il segnale per L. iners aumentato (Figura 4B). Con la nostra definizione originale di BV con questo metodo (campioni positivi per G. vaginalis e / o A. vaginae stati considerati positivi BV) 13, questo individuo era BV positivo a tutti i tempi, anche se la colorazione di Gram non è riuscito a rilevare G. vaginalis in questi ultimi due punti del tempo. Con il metodo descritto qui Luminex, le tendenze possono essere facilmente rispetto al sequenziamento metodi basati, ed i risultati del test confermano Luminex tipicamente colorazione di Gram 13, fornendo ulteriori informazioni sull&#39;identità organismo e abbondanza. <img src=&quot;/ Files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Schema del protocollo Luminex per la determinazione del profilo microbiota di un campione clinico complesso o ambientali. Il protocollo inizia con il DNA modello che è stato estratto dal campione di interesse. (1) Generare prodotto di PCR da DNA stampo utilizzando filo-specifico biotinilato, fosforotioato modificati cpn60 UT primer PCR accoppiata con non modificato cpn60 UT primer PCR (Tabella 1), (2) Questo genera un pool di PCR prodotto che rappresenta il microbiota con la biotina- fosforotioato modifica su un filo, (3) Digest double-stranded prodotto PCR con esonucleasi T7, che non può degradare la fosforotioato modificato filo e genera quindi a singolo filamento di DNA che si modifica al 5 &#39;con biotina, (4) Coppia perle di polistirene a specie-specifico cpn60 sonde UT - ogni perla ha un indirizzo univoco spettrale (indicata dal colore perla) che idistinguibili dal Luminex o Bio-Plex strumento s; (5) ibridare il singolo filamento prodotto di PCR generato dal campione di interesse per il suite di specie-specifico oligonucleotide accoppiato perle; (6) Aggiungere streptavidina-ficoeritrina coniugato che si lega alla il biotinilato a singolo filamento prodotto di PCR e agisce come un indicatore di ibridazione; (7) Determinare l&#39;indirizzo spettrale (tallone d&#39;identità) e l&#39;intensità del segnale di ibridazione con un Luminex o Bio-Plex strumento. Almeno 100 perline vengono conteggiati per ciascuna identità tallone e l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) del segnale ficoeritrina viene segnalato come l&#39;uscita. Fino a 100 diversi tipi cordone possono essere valutate contemporaneamente, ma un saggio che mostra la discriminazione di tre tipi tallone è illustrata. (8) Quando il MFI di PCR replica generata dallo stesso campione è significativamente maggiore rispetto al controllo negativo per un dato tallone (una coda studente t-test, p &lt;0,05), il campione è considerato positivo per tale organismo.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ottimizzazione dei parametri di test Luminex. Cinque diverse sonde mirati per anaerobius Peptostreptococcus sono stati utilizzati con ampliconi generati da un modello misto composto plasmidi contenenti il clonato cpn60 UT di 20 batteri noti per essere associati con la vagina, tra cui P. anaerobius. (A). Effetto del tempo di trattamento esonucleasi T7. Il protocollo sopra descritto è stato seguito, ma il tempo di trattamento con esonucleasi T7 è stata variata prima di ibridazione e l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) è stata determinata per tutte le sonde. (B). Effetto del tempo di ibridazione. Il protocollo sopra descritto è stato seguito con una varietà di tempi ibridazione. Gli stessi set di sonde sono state usate con un amplicon generato utilizzando lo stesso modello come in A e l&#39;intensità media di fluorescenza (MFI) è stata determinata per tutte le sonde. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Determinazione di aggregazione tallone utilizzando il software Bioplex. Tre esempi sono dati di piste Bioplex in cui il livello del tallone aggregazione è (A), accettabile (5%), (B), borderline (50%) e (C) inaccettabili (80%). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Applicazione di un 5-complesso serie Luminex alla diagnosi BV sequenziale in campioni prelevati da uno stesso individuo. (A). Gram-vetrini colorati che mostrano il tradizionale diagnostici utilizzati per valutare ogni campione di BV. (B). Applicazione di un 5-complesso serie Luminex preparata ed eseguita come descritto in questo protocollo per gli stessi quattro esemplari mostrati in (A). Obiettivi batterica IFM cui segnale è stato significativamente positivo per la nostra definizione (una coda studente t-test, p &lt;0,05) sono contrassegnati da un asterisco (*).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La specificità di generazione del segnale è di importanza critica, si deve essere sicuri che il segnale osservato rispecchia in pieno la rilevazione degli ampliconi generati da tale organismo. Software come PrimerPlex (Premier Biosoft) può aiutare a progettare delle sonde che ibridano in modo efficiente, ma può o non può cross-ibridare a specie non bersaglio. Quando universale primer PCR sono utilizzati come descritto in questo protocollo, è importante tenere a mente che l&#39;ha generato amplicone rappresenta tut...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome oligonucleotide </td><td> Azienda </td><td> Sequenza 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, o altri </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, fosforotioato-C, E, fosforotioato-G, F, fosforotioato-A, io, inosina, Y, C o T, R, A o G, K, T, G, S, C o G. </td></tr></tbody></table> Sequenze Tabella 1. Dei oligonucleotidi modificati per universale cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente</td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimmide HCl (EDC) </td><td> Perforare </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Perline fluorescenti di polistirene: Microplex Microsfere (Luminex), o Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex o Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx dove xxx corrisponde al tallone identificatore </td><td> Biglie magnetiche sono sempre disponibili per l&#39;accoppiamento oligonucleotidi e può offrire alcuni vantaggi. Non sono stati provati da questi autori. </td></tr><tr><td> Oligonucleotidi di cattura (5 &#39;amino C12 modificata) </td><td> Invitrogen, IDT, o altri </td><td> varie </td><td> Livello di purezza dissalate è accettabile. Sequenze delle sonde di cattura utilizzati per caratterizzare i tamponi vaginali sono forniti nel manoscritto su cui si basa questo protocollo 13. </td></tr><tr><td> T7esonucleasi </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Fare attenzione ad ottenere elevata purezza SA-PE, questo numero di catalogo è consigliato </td></tr><tr><td> Pozzetto 96 pozzetti PCR </td><td> Pescatore </td><td> CS006509 </td><td> rientrano in entrambe le termociclatore a 96 pozzetti e la macchina Bioplex </td></tr><tr><td> Pozzetto di tenuta tappeto </td><td> Pescatore </td><td> CS006555 </td><td> Possono essere riutilizzati; lavare con acqua e sapone, lavare bene e asciugare </td></tr><tr><td> TMAC 5M </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex o strumento Luminex </td><td> Bio-Rad o Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> Software per la progettazione PrimerPlex sonda </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Consigliato per Luminex sonda desegno, anche se piattaforme software possono essere utilizzati altri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> componente </td><td> microlitri / saggio </td><td> saggi μl/100 </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mm ciascuna </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 Nm </td></tr><tr><td> H280, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 Nm </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totali </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Consigliati miscele per PCR con primer modificato cpn60 UT (Tabella 1). Il test è costituito da 5 ml di DNA stampo e 0,5 microlitri (2,5 U) di Taq DNA polimerasi (Invitrogen). Normalmente grandi volumi sono preparati (ad esempio, sufficiente per 100 test) e conservati a -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Vaginosi batterica (BV) è una sindrome polimicrobica ricorrente che è caratterizzata da un cambiamento nel microbiota &quot;normale&quot; da Lactobacillus dominato ad un microbiota dominato da un numero di specie batteriche, tra cui Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e altri 1-3. Questa condizione è associata a una serie di esiti negativi per la salute, compreso l&#39;HIV acquisizione 4, e può essere difficile da gestire clinicamente 5. Inoltre, la diagnosi di BV ha invocato l&#39;uso della colorazione di Gram di strisci tampone vaginale che sono incise su vari criteri numerici 6,7. Anche se questa diagnosi è semplice, economico e adatto a risorse limitate, può soffrire di problemi legati ad interpretazioni soggettive e non dà un profilo dettagliato della composizione del microbiota vaginale 8. I recenti sforzi di sequenziamento profondo hanno rivelato una ricca e diversificata flora batterica vaginale, conchiare differenze tra campioni prelevati da individui che sono diagnosticati con BV rispetto a quegli individui che sono considerati normali 9,10, che ha portato alla identificazione di un numero di potenziali bersagli per la diagnosi molecolare di BV 11,12. Questi studi hanno fornito una grande quantità di informazioni utili, ma sequenziamento profondo non è ancora pratico come metodo diagnostico in ambito clinico. Abbiamo recentemente descritto un metodo rapido per il profiling del microbiota vaginale in un formato multiplex con oligonucleotidi accoppiati perline fluorescenti con rilevamento su una piattaforma Luminex 13. Questo metodo, come la corrente colorazione di Gram metodi basati, è rapido e semplice, ma aggiunge l&#39;ulteriore vantaggio di sfruttare le conoscenze molecolari derivanti da studi di sequenziamento nella progettazione della sonda. Questo metodo fornisce quindi un modo per profilo i microrganismi più importanti che sono presenti in un tampone vaginale che può essere utilizzato per diagnosticare BV con elevata specificità e sensibilità compared a macchia Gram fornendo ulteriori informazioni sulla presenza e abbondanza delle specie in modo semi-quantitativo e rapida. Questo metodo multiplex è espandibile ben oltre la portata della corrente analisi PCR quantitativa per gli organismi particolari, che attualmente è limitato a 5 o 6 test differenti in un singolo campione 14. È importante sottolineare che il metodo non si limita alla rilevazione di batteri nei tamponi vaginali e può essere facilmente adattato al profilo rapidamente quasi tutte le comunità microbica di interesse. Per esempio, abbiamo recentemente iniziato ad applicare questa metodologia per lo sviluppo di strumenti diagnostici per l&#39;impiego in impianti di trattamento delle acque reflue.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Views.  Agriculture and Agri-Food Canada. Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

L&#39;uso di Immuno-fluorescenza Chimica per il rilevamento di Edwardsiella ictaluri In pesce gatto di canale ( I. punctatus) I campioni

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Determinazione dell&#39;attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

In Situ Rilevamento di Autoreattivi CD4 cellule T nel cervello e nel cuore Utilizzo Maggiore di Istocompatibilità Dextramers classe Complex II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ rilevamento di batteri all&#39;interno dei tessuti in paraffina utilizzando una sonda DNA Digossina marcato targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Una strategia rapido per l&#39;isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l&#39;esposizione umana ad agenti patogeni ambientali

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.