Ringraziamo Martine Emond e Isabel Brachmann per il loro aiuto nello stabilire la organotipica sistema cultura fetta e Wolfgang Hübner e Liviu Gabriel Bodea per la lettura critica del manoscritto. Vorremmo ringraziare Frank Costantini per la R26 topi reporter e Tabin Cliff per i topi Creer Shh. Questo studio è stato finanziato da un premio di ricerca del Ministero della Scienza e della Ricerca del Nord-Reno Westfalia (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Parti di questo protocollo sono modificate da Daza et al., 2007 7. 1. Preparativi <ol><li> Possono essere preparati un giorno di anticipo <ol><li> Preparare 1X tampone Krebs (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2.5 mM CaCl 2, 11 mM glucosio, 25 mM NaHCO 3; aggiustare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,22 dimensione dei pori micron) e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare il terreno di coltura (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml di glucosio DMEM alto, 850 ml di glucosio al 30%, 5 ml di siero di cavallo (25%). Aggiungere 200 microlitri Penicllin 100X / streptomicina. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare prima di iniziare la dissezione <ol><li> Preparare 100 ml di fusione agarosio 4% bassa (LMP agarosio) in 1X tampone Krebs: forno a microonde la soluzione fino a quando l&#39;agarosio è completamente sciolto e poi posto l&#39;agarosio in un bagno di acqua a 45 ° C. </li><li> Riempire le vibrazionitome vassoio buffer con gelida tampone 1X Krebs e avviare l&#39;elemento di raffreddamento (mantenere a 4 ° C). Fissare una lametta nel supporto lama e set-up della zona vibratome con un bisturi, un pennello fine e un cucchiaio forato mini per raccogliere le fette. Preparare piastre sterili (35 x 10 mm) con tampone 1x Krebs per la raccolta delle fette. Tenere su ghiaccio. </li><li> Set-up della zona dissezione con piastre sterili (100 x 15 mm) per la dissezione e piccoli piatti Petri sterili (35 x 10 mm) per l&#39;incorporamento, piccole forbici, due pinze fine (Dumont 5), un cucchiaio forato mini, un bicchiere pipetta Pasteur fuoco lucido con una punta rotonda chiusa e 1 L di tampone 1X Krebs sul ghiaccio. Pulire tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo. </li><li> Aggiungi terreno di coltura per i pozzi di un bambino di sei pozzetti (1,5 mL / pozzetto) e metterla in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Preparare una a sei pozzetti con 1,5 mL / pozzetto sterile 1X tampone Krebs e 15 microlitri Penicilin / streptomicina (100X) / bene. In condizioni sterili, luogo Millicell Cultura inserisce cellule nei pozzetti. Posto a sei pozzetti accanto al vibratome in modo che le fette di cervello possono essere trasferiti sulle membrane filtro subito dopo il sezionamento. </li></ol></li></ol> 2. Dissezione e incorporamento di cervello embrionale <ol><li> Anestetizzare un topo femmina gravida con isoflurano e sacrificio il mouse da dislocazione cervicale (embrioni dovrebbe essere allo stadio E12.5). Sezionare fuori l&#39;utero del mouse sollevando l&#39;utero con una pinza. Utilizzare pinze altri per separare il mesometrium via dall&#39;utero. Posto l&#39;utero in gelida tampone 1X Krebs. Utilizzare una pinza sottile per separare la parete muscolare dell&#39;utero, membrana Reichert e la viscerale sacco vitellino dall&#39;embrione. Rimuovere gli embrioni dall&#39;utero. Mettere gli embrioni sezionato in un recipiente a parte con Petri sterile 1X tampone Krebs. </li><li> Sezionare il cervello sotto uno stereomicroscopio. Per sezionare il cervello, prima tagliare la testa dell&#39;embrione. Fissare la testaforando una pinza sottile attraverso la testa (altezza degli occhi). Utilizzare un altro paio di pinze per rimuovere con cura la pelle e il cranio. Utilizzare pinze per sollevare con attenzione il cervello fuori e trasferirla in una capsula di Petri con la sterile 1X tampone Krebs. E &#39;molto importante che l&#39;integrità di tutto il cervello si mantiene durante la dissezione, dal momento che i danni al tessuto cerebrale creerà problemi (come la distruzione dei tessuti) durante il sezionamento sul vibratome. </li><li> Lavare il cervello una volta nel 4% a basso punto di fusione (LMP) agarosio. Incorpora 2-3 cervelli in un momento di fresco 4% agarosio LMP. Porre le capsule incorporare sul ghiaccio più uniforme possibile. Utilizzare una pipetta Pasteur con un fuoco lucido punta rotonda per sollevare il cervello fino in fondo l&#39;agarosio si è solidificato. Il cervello dovrebbe stabilirsi in una posizione piana orizzontale nella parte inferiore del blocco di agarosio. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato completamente (dopo circa 3 min), tagliare l&#39;agarosio che circonda il cervello e incollare il blocco agarosio sul palco campionedel vibratome. Per incollare i blocchi, assicuratevi che il lato ventrale del cervello è parallelo alla piattaforma, dal momento che il cervello dovrebbe essere tagliato in un piano di sezione orizzontale. </li></ol> 3. Vibratome sezionamento <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio per sezionamento. Per ottenere fette intatto è molto importante per mantenere la temperatura a 4 ° C durante il sezionamento. </li><li> Sezione 300 micron fette spesse orizzontali ad una frequenza di 50 Hz, ampiezza lama di 1,1 mm e una velocità di 25 mm / sec. </li><li> Usa il pennello sottile per spingere la fetta in un cucchiaio forato mini per raccogliere le fette di cervello e trasferirli in un piatto con sterile gelida tampone 1X Krebs. Scegliere la slice che contiene tessuto mesencefalo ventrale (vedi Figura 1). In un cervello E12.5 il mouse c&#39;è solo una fetta di 300 micron orizzontale che contiene tessuto mesencefalo ventrale compresi i neuroni dopaminergici. </li></ol> 4. Fetta della cultura Passi 4,2-4,5 deve essere effettuata in condizioni sterili. <ol><li> Trasferire le fette di cervello su un inserto cultura Millicell membrana cellulare in sei pozzetti con 1x tampone Krebs (vedi punto 1.2.5). Per trasferire la fetta utilizzare il mini cucchiaio forato (Strumenti di scienze arti) e un pennello fine. Fino a 3 fette possono essere posizionati su una membrana. </li><li> Trasferire la membrana con la fetta di sei pozzetti con terreno di coltura (vedi punto 1.2.5). La parte superiore della membrana non dovrebbero essere coperti da medium. La fetta cervello riceve media dal basso e l&#39;aria dall&#39;alto. </li><li> Posto a sei pozzetti in un incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C. E &#39;molto importante che le fette sono posti in incubatrice entro 2 ore dopo la fase iniziale della dissezione. Un tempo di preparazione più estesa può provocare scarsa sopravvivenza delle fette. </li><li> Fette possono essere mantenuti in vitro fino a 3 giorni. Cambia il 50% del terreno di coltura il giorno 2 °. </li></ol><ol><li> Lasciate le fette di recuperare in incubatore per 4-5 ore prima di iniziare il time-lapse imaging. </li><li> Per time-lapse imaging, tenere le fette sull&#39;inserto membrana e trasferire l&#39;inserto in un 35 mm Ibidi μ-piatto (il fondo del piatto è composto da materiale di alta qualità ottica). </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno di coltura più 1,5 microlitri di acido ascorbico (200 mm) al piatto. L&#39;acido ascorbico protegge contro le fette di fototossicità. </li><li> Incubare fette in una camera climatica a 37 ° C con 5% di CO2 durante il time-lapse imaging. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati La Figura 1 illustra la preparazione di culture fetta organotipica da E12.5 cervello di topo. La figura 2 mostra fette orizzontali organotipica (acuta e dopo alcuni giorni di cultura) ottenuto forma E12.5 cervello di topo. Per confronto, le sezioni cervello congelato nelle fasi di equivalente svilupposono mostrati. Mesencefalo neuroni dopaminergici sono visualizzati con immunoistochimica per la tirosina idrossilasi (TH). Mesencefalo progetto neuroni dopaminergici a obiettivi nel proencefalo. Queste proiezioni cominciano a formarsi a E12.5 e si estendono verso il prosencefalo durante i giorni successivi. Noi consideriamo lo sviluppo di proiezioni proencefalo come una buona indicazione per il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici nella cultura. Nel mesencefalo orizzontale fette neuroni dopaminergici estendere le proiezioni verso il loro spazio adeguato bersaglio proencefalo. Dopo 3 DIV (giorni in vitro) o quando le aree bersaglio proencefalo sono danneggiati, proiezioni aberrante si estendono verso il mesencefalo dorsale. Esempi di fette coronali del E12.5 mesencefalo sono mostrati in Figura 3. Neuroni dopaminergici visualizzate con immunocolorazione per TH estendere proiezioni aberrante al mesencefalo dorsale. Figura 4 mostra l&#39;analisi di proliferare, le cellule necrotiche e apoptotiche nelle culture fetta organotipica. BrdU immunostaining di visualizzare le cellule proliferanti dimostra che le cellule proliferano in condizioni di coltura dopo 1 DIV. Proliferazione è ridotto dopo 4 DIV. Dopo 3 DIV, molte cellule nel mesencefalo ventrale incontro a necrosi (colorazione ioduro di propidio) e apotosis (immunocolorazione per spaccati della caspasi-3). Figura 5 mostra i percorsi migratori di YFP marcato i neuroni monitorati in un time-lapse esperimento di imaging in una fetta acuta . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica che illustra la preparazione di culture fetta organotipica. 300 micron fette orizzontali cervello sono preparati da sezionare uno E12.5 cervello utilizzando un vibratome. (A) Schema sagittale di un cervello E12.5 il mouse. I livelli di sezioni sono indicate. L&#39;area che contiene i neuroni dopaminergici è raffigurato in rosa, le proiezioni sono indicati in blu. (B) Schema delle tre sezioni che possono essere ottenute da dorsale a ventrale e that contengono sia proencefalo (Fb) e mesencefalo (Mb). Da notare che solo una fetta contiene i neuroni dopaminergici (b slice). La fetta appropriata può essere identificato in base alla posizione dei ventricoli e la continuità del tessuto mesencefalo e proencefalo (frecce, confrontare b sezione con la sezione A e C). L&#39;area che contiene i neuroni dopaminergici è indicato in rosa, l&#39;area che contiene precursori dopaminergici è raffigurato in verde, le frecce blu indicano le proiezioni di sviluppo. (C) La sezione che contiene i neuroni dopaminergici sono coltivati ​​su inserti di membrana. Abbreviazioni: VMB, mesencefalo ventrale, DMB, mesencefalo dorsale; Hyp, l&#39;ipotalamo, Hb, rombencefalo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig2.jpg" /> Figura 2. Proiezioni dei neuroni dopaminergici del mesencefalo in culture fetta organotipica dipendono l&#39;integrità del proencefalo. Immunoistochimica per la tirosina idrossilasi (TH) per etichettare i neuroni dopaminergici. (A) fetta acuta (0 DIV)che illustrano la posizione normale dei neuroni dopaminergici nel mesencefalo ventrale. La freccia bianca indica l&#39;area che viene mostrato in alto ingrandimento nel riquadro. Proiezioni per il proencefalo non hanno ancora sviluppato. Dopo 1 DIV, proiezioni al proencefalo cominciano a formarsi. Le proiezioni si estendono nel proencefalo a 2-3 DIV. Frecce bianche indicano la posizione dei corpi cellulari mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice bianca). Frecce gialle evidenziare le proiezioni normali a fette intatto mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice gialla). Proiezioni aberrante sviluppare a fette con proencefalo danneggiati. Frecce rosse indicano le proiezioni aberrante al mesencefalo dorsale mostrato in alto ingrandimento nella riquadri (riquadro rosso). Il danno è indicata con un asterisco rosso. Dopo 3 DIV, più fette (n = 5 / 7) aveva proiezioni aberrante verso il mesencefalo dorsale. (B) immunocolorazione TH su sezioni orizzontali cervello congelato a diversi stadi di sviluppo per seguire l&#39;evoluzionedi proiezioni dopaminergiche in vivo. Frecce bianche indicano la posizione dei corpi cellulari mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice bianca). Frecce gialle evidenziare la posizione delle proiezioni mostrato in alto ingrandimento nella inserti (cornice gialla). Il livello delle sezioni congelate è stato scelto per corrispondere al meglio il livello delle culture fetta organotipica. Si noti che una singole sezioni congelate (12 micron) non rappresenta la fetta intera organotipica (300 micron). Pertanto, proiezioni mostrato a E13.5 e E14.5 sono stati osservati su degli articoli 120 micron più ventrale rispetto alla sezione che contiene i corpi cellulari (asterisco giallo). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig3.jpg" /> Figura 3. Culture fetta mesencefalo coronale colorate per la tirosina idrossilasi (TH) come marcatore per i neuroni dopaminergici. (AC) Fette dopo DIV 1, 2 o 3. Neuroni dopaminergici sviluppare proiezioni aberrante verso il mesencefalo dorsale (rfrecce ndr). Frecce indicano la posizione dei corpi delle cellule dopaminergiche. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig4.jpg" /> Figura 4. Proliferazione cellulare e la vitalità cellulare in colture fetta mesencefalo organotipica. (A) Le cellule in proliferazione sono stati etichettati con l&#39;aggiunta di BrdU (50 ng / ml, Sigma) al mezzo di coltura per 18 h. Fette sono stati successivamente immunostained per BrdU. Dopo 1 DIV, le cellule BrdU etichettate si trovano nelle zone ventricolare (frecce rosse). Dopo 4 DIV, le cellule proliferanti sono più sparsi ed una zona ventricolare distinta non è più mantenuto. (B), le cellule necrotiche sono stati etichettati con l&#39;aggiunta di ioduro di propidio (1μg/μL, Sigma) al mezzo di coltura, per 2 ore e visualizzati al microscopio a fluorescenza. Dopo 1 DIV, il mesencefalo ventrale (VMB) non è necrotico, ma molte cellule ioduro di propidio marcata può essere visto nel mesencefalo dorsale e proencefalo. Dopo 3 DIV la vitalità cellulare diminuisce nel midbra ventraleScala in bar: 500 micron (C) per Immunostaing spaccati della caspasi-3 per visualizzare cellule apoptotiche. A 1 o 2 DIV, i neuroni dopaminergici solo pochi (TH) sono apoptotico. Dopo 3 DIV, i neuroni dopaminergici iniziare l&#39;apoptosi. Pannelli al centro e sulla destra sono più alti ingrandimenti della zona in scatola nei pannelli di sinistra. Le immagini più elevati ingrandimenti sono proiezioni di massima intensità z-stack di 14-16 frame. Le immagini sono state scattate ogni 0,5 micron con un Apotome Zeiss set-up. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3350/3350fig5.jpg" /> Figura 5. Rotte migratorie di YFP marcato i neuroni in una fetta acuta. (A) Fetta orizzontale utilizzata per l&#39;imaging lasso di tempo di YFP marcato i neuroni. La fetta è stato incubato per 5 ore prima di imaging. Le cellule sono state etichettate con un inducibile Cre / loxP sistema 6. Shh topi Creer 8 e ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP topo giornalista 9 abbiamore utilizzato. Ricombinazione degli alleli giornalista ROSA (e di espressione EYFP) è indotta nelle cellule che esprimono Creer (Shh cellule che esprimono), ma solo la somministrazione di Tamoxifene (Sigma). In questo esempio, Tamoxifen (3 mg/40 g di peso corporeo) è stato somministrato a femmine di topo gravide a E8.5. Questo set-up sperimentale risultati soprattutto per l&#39;etichettatura dei precursori dei neuroni dopaminergici e dei loro discendenti nel mesencefalo ventrale 10,11. Scala grafica: 500 micron. (B) Tracciare la rotta migratoria di YFP marcato i neuroni in una fetta acuta. Time-lapse immagini di YFP marcato i neuroni destino mappati sono stati acquisiti ogni 30 min per un tempo totale di 5 ore e 30 minuti su una Axio Observer-microscopio Zeiss (obiettivo CE PLnn 10x / 0,3). Fette sono state incubate in una camera climatica (incubatore XLS1 Pecon) a 37 ° C e forniti con il 5% di CO 2 durante l&#39;imaging. La posizione iniziale delle cellule è segnato con frecce rosse; posizioni migrazione sono contrassegnati con un asterisco rosso.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il metodo organotipica cultura fetta qui presentato fornisce un sistema di breve termine in analisi in vitro di neuroni dopaminergici e sviluppare le loro rotte migratorie e di proiezione nel mesencefalo ventrale embrionale. Abbiamo scoperto che ci sono una serie di passaggi critici nel protocollo che dovrebbe essere attentamente curato in modo da ottenere fette che permettono il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo ventrale. La fase più critica è la dissezione del cervello embr...

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche <table border="1"><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio 30% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528-250 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Invitrogen </td><td> 26050-088 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM (4,5 g / L Glc., Con L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D6429-500 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 100x </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333-20 </td><td></td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4403 </td><td> preparare magazzino 200mm e conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ultrapura agarosio LMP </td><td> Invitrogen </td><td> 15517-022 </td><td></td></tr><tr><td> Millicel inserti </td><td> Millipore </td><td> PICMORG50 </td><td></td></tr><tr><td> μ-piatto 35 mm, a basso </td><td> Ibidi </td><td> 80136 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Microm </td><td> HM 650V </td><td></td></tr><tr><td> Lametta </td><td> Plano GmbH </td><td> 121-6 </td><td></td></tr><tr><td> Histoacryl colla </td><td> BRAU9381104 </td><td> Braun Aesculap </td><td></td></tr><tr><td> Spoon Dia perforata diametro 15 mm </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10370 -18 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza 5 Dumoxel </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11252-30 </td><td></td></tr></table> Anticorpi utilizzati per immunostainings: <table border="1"><tr><td&gt; Nome dell&#39;anticorpo </td><td> Azienda </td><td > Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Coniglio anti-tirosina idrossilasi </td><td> Millipore </td><td> AB152 </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> Topo anti-tirosina idrossilasi </td><td> Millipore </td><td> MAB318 </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> Topo anti-BrdU </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555627 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Coniglio anti-caspasi 3 spaccati </td><td> Tecnologia delle celle di segnalazione </td><td> 9661 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr><tr><td> Donkey anti-IgG di coniglio-Alexa 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A21206 </td><td> Diluizione 1:500 </td></tr><tr><td> Donkey IgG anti-topo-Cy3 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-165-150 </td><td> Diluizione 1:200 </td></tr></table>

organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain: a system to study dopaminergic neuronal development in vitro

Il mouse è un organismo modello eccellente per studiare lo sviluppo del cervello dei mammiferi a causa della abbondanza di dati molecolari e genetici. Tuttavia, il cervello di topo in via di sviluppo non è adatto per una facile manipolazione e di imaging in vivo in quanto l&#39;embrione del mouse è inaccessibile e opaco. Culture fetta organotipica di cervelli embrionali sono quindi ampiamente utilizzati per studiare lo sviluppo del cervello murino in vitro. Ex-vivo, la manipolazione o l&#39;uso di topi transgenici permette la modifica dell&#39;espressione genica in modo che le sottopopolazioni di cellule neuronali e gliali possono essere etichettati con proteine ​​fluorescenti. Il comportamento delle cellule etichettate possono essere osservate con time-lapse imaging. Time-lapse imaging è stata particolarmente efficace per lo studio dei comportamenti delle cellule che sono alla base dello sviluppo della corteccia cerebrale a fine fase embrionale 1-2. Embrionale organotipica sistemi fetta della cultura nelle regioni del cervello al di fuori del prosencefalo sono establis menoHED. Pertanto, la ricchezza di time-lapse dati di immagini che descrivono la migrazione delle cellule neuronali è limitato al 3,4 proencefalo. Non è ancora noto, se i principi scoperti per il cervello dorsale valere per le aree del cervello ventrale. Ventrale del cervello, i neuroni sono organizzati in gruppi neuronali, piuttosto che i livelli e spesso devono sottoporsi a complicate traiettorie migratorie per raggiungere la loro posizione finale. Il mesencefalo ventrale non è solo un buon sistema modello per lo sviluppo cerebrale ventrale, ma contiene anche le popolazioni neuronali come i neuroni dopaminergici che sono rilevanti nei processi di malattia. Mentre la funzione e la degenerazione dei neuroni dopaminergici è stato studiato in grande dettaglio nel cervello adulto e l&#39;invecchiamento, poco si sa circa il comportamento di questi neuroni durante la fase di differenziazione e migrazione 5. Descriviamo qui la generazione di culture fetta dal giorno embrionale (E) 12,5 mesencefalo ventrale del mouse. Queste fetta cultoUres siano potenzialmente idonei per il monitoraggio dello sviluppo dei neuroni dopaminergici per diversi giorni in vitro. Evidenziamo i passaggi critici nella generazione di fette di cervello in queste prime fasi di sviluppo embrionale e discutere le condizioni necessarie per mantenere il normale sviluppo dei neuroni dopaminergici in vitro. Abbiamo inoltre presentare i risultati di esperimenti di imaging lasso di tempo. In questi esperimenti, precursori mesencefalo ventrale (compresi i precursori dopaminergici) ed i loro discendenti sono stati etichettati in modo mosaico utilizzando un Cre / loxP basato destino sistema inducibile mappatura 6.

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

organotypic-slice-cultures-embryonic-ventral-midbrain-system-to-study

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Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

17.8K Views.  University of Bonn. Un metodo per generare fette organotipica dal mesencefalo murino embrionale E12.5 è descritto. Le culture fetta organotipica può essere usato per osservare il comportamento dei neuroni dopaminergici o di altri neuroni del mesencefalo ventrale.

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The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l&#39;esame di danno neuronale

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

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Neuroscienze

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Interfacciamento 3D Engineered neuronali Culture a Micro-Electrode Array: Un innovativo<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello sperimentale

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...