Questo protocollo ci permette di identificare le vie di guida dell'assone attive nel nervo oculomotore e di valutare i loro ruoli in diversi punti lungo la traiettoria nervosa in tempo reale. Questa tecnica preserva gli ambienti locali attraverso i quali viaggiano gli assoni e i loro obiettivi finali. Gli assoni in crescita non vengono tagliati, quindi è possibile valutare la crescita iniziale dell'assone, piuttosto che la rigenerazione.
Questo metodo fornisce informazioni sulla guida dell'assone nel sistema motorio oculare, ma potrebbe essere adattato allo studio della guida dell'assone di altri nervi. Questa tecnica porta la pratica a padroneggiare e lavorare rapidamente è estremamente importante. Quando lo si prova per la prima volta, utilizzare solo pochi embrioni, piuttosto che un'intera cucciolata.
Prima di iniziare la procedura, prima confermare la gravidanza tramite ultrasuoni il giorno embrionale 10.5 da un accoppiamento a tempo. Raccogliere gli embrioni, spruzzare l'addome del topo incinta con il 70% di etanolo e utilizzare le forbici per aprire la cavità addominale per estrarre l'utero. Lavare l'utero in una piastra di Petri di HBSS ghiacciato prima di posizionare l'organo in una seconda piastra di Petri di HBSS fresco ghiacciato.
Sotto un mirino di sezionazione, rimuovere gli embrioni dal corno uterino e dalle loro singole sacche amniotiche, posizionando ogni embrione sul lato inferiore del coperchio di una piastra di 12 po ', sul ghiaccio, mentre vengono raccolti. Utilizzare carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido che circonda ogni embrione, senza toccare gli embrioni stessi, e immergere gli embrioni in liquido al 4% di agarosio a bassa fusione. Posizionare il coperchio del piatto sul ghiaccio per solidificare l'agarosio.
Quando l'agarosio si è indurito, capovolgere gli embrioni e coprire l'altro lato di ogni campione con agarosio aggiuntivo. Quando il secondo volume di agarosio si è solidificato, utilizzare un microscopio di sezionazione a fluorescenza per tagliare l'agarosio attorno a ciascun embrione in modo che ogni embrione sia orientato correttamente sullo stadio del vibratomo. I nuclei oculomotori e le prime crescita dell'assone dovrebbero essere fluorescenti.
Allineare ogni embrione in modo che il nucleo, gli assoni in crescita e l'occhio formino una linea, e utilizzare una lama di rasoio per tagliare l'agarosio parallelo a questa linea. Quindi, riempire la camera del vibratomo con tampone di fette ghiacciate e supercollare il primo embrione allo stadio del vibratomo in modo che la lama sia parallela al nucleo oculomotore e agli occhi. Quando la supercolla è asciutta, immergere lo stadio del vibratomo in modo che l'embrione sia orientato rivolto verso l'lontano dalla lama e utilizzare una nuova lama vibratoma per ottenere fette da 400 a 450 micrometri.
Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per trasferire ogni fetta nel tampone di affettare a freddo man mano che viene acquisita e utilizzare il microscopio di sezionamento a fluorescenza per selezionare la fetta contenente i nuclei oculomotori e gli occhi. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, trasferire la fetta su un inserto di coltura cellulare in una piastra a sei potte contenente 1,5 millilitri di mezzo di coltura per pozzo e posizionare la piastra in un incubatore Celsius di 37 gradi. Rimuovere l'agarosio residuo dallo stadio del vibratomo e supercollare l'embrione successivo sul palco, continuando a raccogliere fette fino a quando tutti gli embrioni non sono stati sezionati e placcati.
Aggiungere quindi l'appropriata concentrazione dell'inibitore o della molecola ricombinante di interesse, diluita in un solvente appropriato, al mezzo di ogni pozzo. Creare una curva dose-risposta. Immagini le fette ogni 30 minuti per contrasto di fase e microscopia a fluorescenza per un massimo di 72 ore.
Durante il normale sviluppo dell'utero, i primi assoni oculomotori positivi alle proteine fluorescenti verdi raggiungono l'orbita entro il giorno embrionale 11.5 prima di diramarsi verso i loro obiettivi finali, come osservato in questa coltura rappresentativa della fetta. L'orientamento della fetta sullo stadio del vibratomo è fondamentale, in quanto le fette non sono interpretabili se non sono orientate correttamente. Ad esempio, se l'embrione è inclinato al suo fianco, solo un nucleo oculomotore sarà osservato all'interno della fetta.
Se l'embrione incorporato è inclinato troppo verso la schiena, gli occhi non saranno presenti all'interno della fetta, e invece possono essere inclusi l'arto superiore e il cervello posteriore o il midollo spinale. È anche importante fare attenzione che durante il posizionamento della fetta sulla membrana di coltura, il tessuto non si pieghi. Prestare attenzione quando si dissolvono gli inibitori e i fattori di crescita nei solventi organici.
Ad esempio, in questo esperimento, la fetta è morta dopo l'aggiunta di etanolo al mezzo. Ricorda di tenere tutto sul ghiaccio e di ridurre al minimo il tempo tra l'estrazione degli embrioni e il posizionamento delle fette nell'incubatrice. Utilizzando questa tecnica, abbiamo iniziato a identificare ulteriori meccanismi di guida dell'assone in funzione nel sistema motorio oculare.
Ricordarsi di usare cautela quando si lavora con lamette da barba e che alcuni inibitori possono essere pericolosi e devono essere maneggiati con attenzione in base ai loro profili di sicurezza.
