Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health, concedere No. NIH / NCRR P41-RR 016.292 (per ACERT).

1. Materiale Tutti i solventi utilizzati in questo lavoro è stata di grado reagente. La trappola di rotazione, tra cui N-ter-butil-α-phenylnitrone (PBN) e l&#39;etichetta di rotazione standard di 2,2,6,6-tetrametil-1-piperinyoxyl (TEMPO) sono stati ottenuti da Sigma e sono stati utilizzati come fornito. Gli antiossidanti vegetali sono stati ottenuti commercialmente da Swanson, Inc. negli Stati Uniti. 2. Preparazione del fumo di sigaretta e l&#39;analisi dei radicali liberi <ol><li> Per introdurre gli antiossidanti nel filtro, il picnogenolo antiossidanti e estratto di semi d&#39;uva sono stati disciolti in etanolo al 95%, mentre il licopene è stato dissolto in acetone. I volumi di solventi sono stati diversi a seconda della solubilità antiossidante. </li><li> La quantità di antiossidanti di 0,4 mg / filtro è stato usato. Sono stati poi ricoperto con 10 mg di carbone attivo. A questo scopo carbone attivo fu in agitazione per ~ 12 ore con la soluzione antiossidante in condizioni anaerobiche, filtrato e essiccato sotto vuoto. </li&gt; <li> Gli antiossidanti sono stati poi introdotti nel filtro di acetato convenzionali (CA filtro). A tal fine, il filtro è stato tagliato in due pezzi. Il rivestimento antiossidanti vegetali sono stati inseriti tra due pezzi di filtro e avvolto con un pezzo di nastro per formare un filtro - filtro antiossidante-sandwich (fig. 1A). Questo filtro combinato è stata successivamente attaccati a canne di sigarette contenenti tabacco. Il controllo è stato fatto filtrare nello stesso modo come il filtro antiossidante tranne antiossidante non è stato aggiunto. </li><li> Prima della simulazione fumo, le sigarette di ricerca sono stati spacchettati e conservato in un ambiente di umidità costante (20 ° C, umidità relativa 60%) con una soluzione satura NaBr per un minimo di 2 giorni. </li><li> Simulazione di fumo per analisi di routine è stato eseguito a temperatura ambiente utilizzando una singola porta del dispositivo fumo che, come mostrato in Fig.1, è costituito da un aspiratore d&#39;acqua o GAST DOA-P104-BN Pompa a vuoto / compressore d&#39;aria (Benton Harbor, Mich) collegato allo spin-trappingmontaggio attraverso un incrocio a T con una estremità aperta. Sbuffi sono state effettuate inserendo l&#39;estremità aperta che è rimasto aperto tra sbuffi. Il flusso di gas è stato controllato da misuratore di portata e cala alle ~ 2.2 SCFH = 17.5 mL / s, regolando una valvola posta tra la pompa e lo sfiato. </li><li> Le sigarette fumate di ricerca sono stati sotto la condizione del volume sfoglia di 35 ml per una durata di 2 secondi ripetuti ogni 60 secondi, simile a 1. Simulazione di fumo per la stima quantitativa della fase gassosa radicali liberi è stata effettuata in collaborazione con il sistema di spin trapping come mostrato in fig. 1. </li><li> Dieci sbuffi intenso (35 mL / puff) sono stati prelevati per ogni sigaretta. In fase gassosa radicali liberi sono stati raccolti facendo passare la MCS attraverso un filtro di Cambridge pad e poi introdotto nella soluzione di spin trapping (0,05 M PBN in benzene, 2,0 ml). </li><li> Dopo l&#39;ultima boccata, la soluzione cattura bolle è stata rimaneggiata al suo volume iniziale (2,0 ml) con il benzene stesso. Un&#39;aliquota è stato trasferito in un ~ 250 millimetri di lunghezza, 3 ID mm di vetro del tubo chiuso ad una estremità. </li><li> La soluzione è stata deossigenato cattura utilizzando un freeze-pump-disgelo procedura. E &#39;stato congelato sotto azoto liquido, e il vuoto è stato applicato. Poi è stato scongelato in atmosfera di argon, permettendo bolle di gas intrappolate di fuggire, e ricongelato. Dopo questo ciclo è stato ripetuto tre volte, il tubo era fiamma sigillato sotto vuoto ed utilizzati in altre misure ESR. Questo passaggio è necessario perché l&#39;ossigeno, che è ben solubile in benzene, amplia le linee ESR di radicali organici. Deossigenazione migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore. </li><li> X-Band ESR spettri sono stati registrati su uno spettrometro Bruker EMX ad una frequenza di 9,34 GHz in condizioni standard. Le impostazioni spettrometro utilizzato in maggior parte degli esperimenti sono stati: centro campo 3312.5G, scansione larghezza 80G, modulazione di ampiezza 0.5G, costante di tempo di 82 microsecondi, il tempo di scansione 40 sec. </li><li> Il addotti rotazione trappola sono relativamente stabili alle condizioni esperimento, che in alcuni casi required 25 accumuli, che in genere si ~ 20 min. Tuttavia, dopo 12 ore l&#39;intensità dei segnali ESR in soluzione benzene è diminuito di un fattore ~ ​​5. </li><li> Per quantificare la concentrazione del addotto cattura, la sua iniziale del primo derivato spettro ESR è stato integrato. Lo spettro di assorbimento risultante mostra un ampio background singoletto, molto probabilmente a causa della fuliggine / catrame prodotti contenuti nel fumo. Dopo la sottrazione di questo sfondo la tripletta separato del addotto cattura è stato integrato ancora una volta (Fig. 2). </li></ol> 3. Rappresentante Risultati La maggior parte dei radicali liberi a bruciare sigarette prodotte in fumo (fase gas) sono istantanei e instabili. Per osservare questi radicali una tecnica trappola giro è impiegato. Cattura in fase gassosa i radicali liberi, trasformandoli in un addotto rotazione che è più stabile e può essere rilevato da ESR (Fig.1). Nel presente studio, lo spin-trappola soluzione di 0,05M PBN è stato utilizzato per la raccolta di gas fumo fase di radicali liberi, che sono una miscela di radicali di ossigeno e carbonio-centrata che sono difficili da separare 15. Nel nostro caso, tuttavia, osservato costanti splitting iperfine a N = 13.7G e H = 1.95g sono molto simili ai corrispondenti valori di cattura addotti di alcossi radicali liberi (RO.) 2, suggerendo che essi sono il prodotto principale. Abbiamo dimostrato che i segnali deboli a bassa ESR e riproducibilità osservate nelle nostre misurazioni iniziali (Fig. 2) sono stati a causa dell&#39;umidità nel flusso di fumo. Per risolvere questo problema, abbiamo aggiunto un azoto liquido (LN2) trappola tra il filtro di Cambridge e la soluzione trappola di spin. La LN 2 trappola rimosso l&#39;acqua dal flusso MCS da congelamento rapido e catturarlo sulla parete interna del tubo di vetro. Questo migliorato notevolmente i segnali ESR e ha permesso di risultati altamente riproducibili (Fig. 3). La quantità di radicali liberi, intrappolati è stato determinato utilizzando uncampione di riferimento. Per i campioni di controllo, senza antiossidanti, la concentrazione addotto tipico benzene stimato dal confronto del suo spettro doppio integrale con uno spettro doppio integrale per concentrazione nota di TEMPO di 1,24 mM (Fig.2). Dal momento che la quantità di aria passa attraverso ogni sigaretta durante il fumo è stato ~ 350 ml, questo dà una stima per la concentrazione di radicali liberi in fase gassosa di MCS di ~ 7.1X10 -9 m, e un numero totale di radicali intrappolati dalla fase gassosa di una sigaretta intera ~ 1.5X10 15. Una stima per l&#39;importo totale di radicali liberi nel fumo di una sigaretta intera, sia di gas e particolato fase, è stata ~ 10 16 radicali liberi 9. Diversi livelli di effetto scavenging di antiossidanti vegetali in fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta principale flusso è stato osservato. I loro tassi di evacuazione sono stati presentati in fig. 4. Licopene e estratto di semi d&#39;uva hanno mostrato i tassi più alti, mentre bassitasso di ER è stato osservato per picnogenolo (Fig.4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma di design migliorato la simulazione di fumare per la raccolta fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta tradizionale (MCS) con trappola di spin. MCS è stato redatto da un aspiratore acqua attraverso CA filtro, poi a Cambridge filtro (filtro giallo) e passato attraverso una trappola di azoto liquido per rimuovere H 2 O. La fase gassosa prodotti alla fine è andato a girare trappola e gorgogliare attraverso la soluzione trappola di spin. Antiossidante impianto è stato collocato tra due pezzi di filtri acetato convenzionali (Ampliata nel cerchio A) allegata alla sigaretta per combattere i radicali liberi nella MCS. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" /> Figura 2. Una stima quantitativa per lo spin-trapping concentrazione di benzene richiede addotto a sottrarre un segnale ampio sfondo da l&#39;integrazione primal spettro. I parametri di splitting iperfine per lo spin-trapping addotti sono a = 1,95 H G, una N = 13.7G. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" /> Figura 3. Passando per LN2 trappola migliora sostanzialmente la qualità dei segnali ESR ottenuto da spin-trapping di MCS. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto di antiossidanti naturali sulla concentrazione di radicali liberi nella MCS. Le intensità dei relativi segnali sono: controllo - 100%, picnogenolo - 55%, estratto di semi d&#39;uva - 12%, licopene - 10%.

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Rep. 6, 161-171 (2001).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+stable+free+radicals+in+mechanisms+of+oxidative+damage,+carcinogenesis+and+synergistic+effects+with+other+respirable+particles.">Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una stima attendibile degli effetti di diversi spazzini dei radicali liberi nel fumo di tabacco richiede una tecnica riproducibile per la rilevazione quantitativa dei radicali liberi. In precedenza 1, è stato dimostrato che piccole quantità di soluzioni di rotazione più elevati trappola concentrazione in solventi non polari sono più efficaci di intrappolare i radicali liberi dal fumo di tabacco. Il fumo di sigaretta contiene sempre vapore acqueo dalla combustione di composti organici e l&#39;umidità residua nel tabacco che possono finire nel solvente cattura. Questa mescolanza di acqua nella soluzione trappola rotazione PBN diminuisce sensibilmente la durata di addotti lo spin trapping e l&#39;intensità dei loro segnali ESR. La rimozione di questo umidità semplice MCS passando attraverso un tubo a U raffreddati con azoto liquido notevolmente migliorato la qualità degli spettri ESR nei nostri esperimenti, anche se alcune frazioni di fase gassosa potrebbe essere anche radicali intrappolati sulla superficie ghiacciata. Usando tla sua tecnica abbiamo confrontato l&#39;efficienza relativa dei diversi radical-scavenging composti naturali introdotto i filtri di sigarette. Abbiamo scoperto che il licopene estratto di semi d&#39;uva e subito dopo l&#39;integrazione nel filtri delle sigarette sono in grado di pulire fino al 90% dei radicali liberi dalla MSC fase gassosa. Tale elevata capacità di scavenging ranghi questi composti facilmente reperibili a buon mercato naturale tra i più efficienti riportato protettori dei radicali liberi come l&#39;emoglobina e shikonine 8,14. Eppure, nei nostri filtri per sigarette esperimenti carichi di antiossidanti naturali studiato perso una parte notevole della loro capacità di scavenging dopo una settimana di conservazione a temperatura ambiente. Risolvere questo problema può stimolare futura applicazione di licopene ed estratto di semi d&#39;uva nei filtri delle sigarette commerciali.

a protocol for detecting and scavenging gas-phase free radicals in mainstream cigarette smoke

Il fumo di sigaretta è associato a tumori umani. E &#39;stato riportato che la maggior parte delle morti per cancro al polmone sono causati dal fumo di sigaretta 5,6,7,12. Anche se catrami tabacco e prodotti affini in fase di particelle di fumo di sigaretta sono le principali cause di malattie correlate cancerogene e mutagene, il fumo di sigaretta contiene significative quantità di radicali liberi che sono considerati un importante gruppo di agenti cancerogeni 9,10. I radicali liberi attaccano costituenti cellulari da danneggiare la struttura delle proteine, i lipidi e le sequenze di DNA e di aumentare il rischio di sviluppare diversi tipi di tumori. Inalati producono radicali addotti che contribuiscono a molti degli effetti negativi sulla salute del fumo di tabacco nei polmoni 3. Gli studi sono stati condotti per ridurre i radicali liberi nel fumo di sigaretta per diminuire i rischi del fumo danno indotto. E &#39;stato riportato che l&#39;emoglobina e di eme composti contenenti potrebbe in parte pulire l&#39;ossido nitrico, reattivaossidanti e cancerogene nitrosocompounds volatili di 4 fumo di sigaretta. A &#39;bio-filtro&#39; costituito da carbonio emoglobina e attivato è stato utilizzato per pulire i radicali liberi e di rimuovere fino al 90% dei radicali liberi dal fumo di sigaretta 14. Tuttavia, a causa del costo-inefficacia, non è stato commercializzato con successo. Un altro studio ha mostrato una buona efficienza di lavaggio shikonin, un componente di erboristeria cinese 8. Nel presente studio, riportiamo un protocollo comune per l&#39;introduzione di estratti antiossidanti naturali nel filtro delle sigarette per lo scavenging dei radicali liberi fase gas nel fumo di sigaretta e la misurazione degli effetti scavenge sui radicali liberi in fase gassosa nel fumo di sigaretta tradizionale (MCS) con spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spettroscopia 1,2,14. Abbiamo dimostrato elevata capacità di scavenging di licopene ed estratto di semi d&#39;uva che potrebbe indicare la loro futura applicazione nei filtri delle sigarette. Un vantaggio importante di questi professionistispazzini pective è che possono essere ottenuti in grandi quantità da sottoprodotti dell&#39;industria pomodoro o vino rispettivamente 11,13

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A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Spin-trapping spettroscopia ESR è stato utilizzato per studiare l&#39;effetto di antiossidanti vegetali licopene, picnogenolo ed estratto di semi d&#39;uva su scavenging fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta.

Un protocollo per il rilevamento e scavenging in fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.2K Views.  CDCF-AOX Lab. Spin-trapping spettroscopia ESR è stato utilizzato per studiare l'effetto di antiossidanti vegetali licopene, picnogenolo ed estratto di semi d'uva su scavenging fase gassosa radicali liberi nel fumo di sigaretta.

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protocollo per il Biofilm Streamer formazione in un dispositivo a microfluidi con Micro-pilastri

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

Valutazione dell&#39;impatto di esposizione ripetuta di organotipica 3D bronchiali e nasali coltura tissutale modelli di Whole fumo di sigaretta

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are encapsulated within the aerogels. However, few reports on encapsulating proteins within sol&#8211;gels that are processed to form aerogels exist. A procedure for encapsulating cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels that are supercritically processed to form bioaerogels with gas-phase activity for nitric oxide (NO) is presented. Cyt. c is added to a mixed silica sol under controlled protein concentration and buffer strength conditions. The sol mixture is then gelled and the liquid filling the gel pores is replaced through a series of solvent exchanges with liquid carbon dioxide. The carbon dioxide is brought to its critical point and vented off to form dry aerogels with cyt. c encapsulated inside. These bioaerogels are characterized with UV-visible spectroscopy and circular dichroism spectroscopy and can be used to detect the presence of gas-phase nitric oxide. The success of this procedure depends on regulating the cyt. c concentration and the buffer concentration and does not require other components such as metal nanoparticles. It may be possible to encapsulate other proteins using a similar approach making this procedure important for potential future bioanalytical device development.

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

This procedure describes how to encapsulate cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels, process these gels to form bioaerogels, and use these bioaerogels to rapidly recognize nitric oxide (NO) through a gas-phase reaction. This type of protocol may aid in the future development of biosensors or other bioanalytical devices.

incapsulante citocromo<em&gt; c</em&gt; In Silica Aerogel nanoarchitetture senza metallo nanoparticelle, pur mantenendo bioattività gas-phase

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Un microcontrollore azionato il dispositivo per la generazione di estratti liquidi da Aerosol elettronico e fumo di sigaretta sigaretta convenzionale

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Rigida incorporamento di fisso e macchiato, complesso, scala millimetrata esemplari per l'istologia privo di sezione 3D da Micro-tomografia computerizzata

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Lo Scavenging catalitica di pianta reattive dell'ossigeno specie In Vivo di nanoparticelle di ossido di cerio anionici

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...