Questo lavoro è finanziato da RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) nell&#39;ambito di un accordo di ricerca in collaborazione con la Wake Forest University School of Medicine. GL Prasad è un dipendente a tempo pieno di RJRT.

NOTA: consenso informato scritto per fare questo studio è stato ottenuto in una unità di ricerca clinica locale in corso di approvazione IRB, per Good Clinical Practices. Lavorazione di sangue, l&#39;isolamento delle PBMC e altri esperimenti di coltura cellulare sono eseguite in condizioni sterili, utilizzando forniture microbiologicamente sterili e reagenti. 1. WS-CM Preparazione <ol><li> Generare WS-CM 12 come precedentemente descritto. <ol><li> Preparare WS-CM passando fumo di quattro sigarette 3R4F riferimento attraverso Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium senza rosso fenolo utilizzando il seguente regime di fumare: 35-60-2, il volume in ml soffio, soffio intervallo in secondi, e la durata puff in sec, rispettivamente. Ogni preparazione genera un campione di 20 ml. </li></ol></li><li> Tubo Label (s) con data, ora completato, e il nome e il numero di sigarette. Conservare i 500 microlitri aliquote a -80 ° C subito dopo il fumo è completato. </li><li> Analizzare aliquote di WS congelate-CM Per determinare i livelli di nicotina, nitrosammine specifiche del tabacco, e gli idrocarburi policiclici aromatici come descritto in precedenza 12. </li></ol> 2. Isolamento di PBMC <ol><li> Prelevare il sangue fresco da donatori sani (che sono non consumatori di prodotti del tabacco) Isolare PBMC da sangue fresco come descritto di seguito nella sezione separata approvazione da Wake Forest Baptist Health IRB 15. <ol><li> Prima dell&#39;arrivo della sacca di sangue, avere una bottiglia da 500 ml, forbici, buffer di isolamento, e tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (RT) pronto in un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) cappa coltura cellulare. Buffer di isolamento deve essere protetto dalla luce. </li><li> Tenere la sacca di sangue capovolta e tagliare il tubo appena sotto dove è stato bloccato lasciando almeno 3 cm di tubo. </li><li> Togliere il tappo dalla bottiglia da 500 ml e mantenere il tubo sopra l&#39;apertura della bottiglia. Raccogliete la sacca di sangue e capovolgere per permettere al sangue di fluire liberamente dal sacchetto in tegli bottiglia fino al sacchetto è vuoto. Lasciare il sangue di fluire sulla parete interna della bottiglia rispetto verso il basso da evitare la creazione di bolle. </li><li> Versare buffer di isolamento nella bottiglia in un rapporto 1: 5 di tampone di isolamento al sangue. Tappare il flacone e capovolgere delicatamente, end-over-end, 10 volte. Lasciare la bottiglia nella cappa coltura cellulare ad incubare con luci spente, per 1 ora a RT. </li><li> A, strato di colore paglierino chiaro costruirà sopra il sangue. Rimuovere questo livello con un 25 ml pipetta sierologica in 50 ml provette coniche. La quantità raccolte possono variare 50-300 ml, a seconda del soggetto che sangue donato. </li><li> Centrifugare le provette a 200 xg per 10 min a RT. </li><li> Aspirare il surnatante trasparente, lasciando il pellet di sangue di colore scuro. Il pellet sarà sciolto ma viscoso. </li><li> Pipettare 3 ml di tampone isolamento in 15 ml provette coniche. </li><li> Per il pellet risospendere, aggiungere 20 ml di DPBS per ogni 50 ml di liquido color paglierino raccolti in sTep 2.1.5. Vortex a mescolare bene, e consolidare il liquido risospeso da più tubi. Questo liquido contiene globuli sospeso. </li><li> Con una pipetta di trasferimento, trasferimento 5 ml di globuli sospesi su 3 ml di tampone di isolamento nel passaggio 2.1.8. Inclinare il tubo da 15 ml contenente lentamente e delicatamente la sospensione cellulare per creare due livelli separati. Centrifugare le provette a 400 xg per 40 min a RT con accelerazione minima e senza freno. </li><li> Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere lo strato risultante torbida centrale (buffy coat) contenente PBMC in una provetta conica da 50 ml. Evitare disegno altri livelli chiari di sotto di essa. Trasferimento non più di 25 ml in ciascun tubo da 50 ml. </li><li> Aggiungere 25 ml di tampone fredda (o più per riempire l&#39;intero volume rimanente del tubo conico 50 ml) per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di corsa. Questo contiene PBMC. Contare le celle e utilizzare immediatamente o posto in ghiaccio per congelamento. </li></ol></li></ol> 3. gelo e disgelo il PBMC <ol><li> Centrifuga le PBMC che sono stati raccolti in fase 2.1.13 per 10 min a 400 x g. </li><li> Riempire il contenitore congelamento con alcool isopropilico per le istruzioni del produttore. ATTENZIONE: alcol isopropilico è infiammabile e altamente tossici. </li><li> Risospendere il pellet con terreno RPMI 1640 (4 ° C) contenente siero bovino fetale 20% (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Questo è RPMI 1640 medium di congelamento. Risospendere il pellet con una quantità di congelamento mezzo che si tradurrà in una sospensione con circa 5 x 10 7 cellule / ml. Il numero di cellule disponibili per il congelamento varierà. </li><li> Dispensare 1 ml aliquote di sospensione cellulare in 2 ml cryotubes e posizionare i cryotubes nel contenitore di congelamento. Posizionare il contenitore congelamento con cryotubes in un congelatore a -80 ° C per memorizzare O / N e quindi rimuovere i cryotubes e trasferire per memorizzare in uncongelatore criogenico tra -150 ° C a -190 ° C. </li><li> Rimuovere il cryotube dallo stoccaggio criogenico e scongelare rapidamente con agitazione in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Trasferire immediatamente le PBMC scongelati nel cryotube in una provetta conica da 15 ml con 10 ml RPMI 1640 medium completa (4 ° C) contenente 10% FBS, 1% Pen / Strep e 1% di L-glutammina. Il contenuto del cryotube scongelata devono essere trasferite quanto prima possibile avere la vitalità cellulare massima 15. </li><li> Centrifugare le PBMC a 400 xg per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet con 5 ml RPMI 1640 completo e contare le cellule. </li><li> Misurare la vitalità delle cellule con metodi consolidati come trypan metodo di esclusione blu. Generalmente vitalità cellulare con questo metodo è circa il 90 - 95%. Le PBMC sono ora pronti per l&#39;uso negli esperimenti. </li></ol> 4. Cella Morte Determinazione NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo study. Le diluizioni possono essere modificati di conseguenza. <ol><li> Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto, come indicato di seguito. </li><li> Diluire WS-CM alle seguenti concentrazioni: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, e 5 mg / mL di unità equi-nicotina (in base al contenuto di nicotina in WS-CM) 12. </li><li> Diluire nicotina nel mezzo RPMI alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l&#39;ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto. </li><li> Ai fini di questo studio, preparare due serie di piastre come sopra. Coprire le piastre e incubare una piastra per 24 ore e una piastra per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Regolare punti di tempo, se necessario. </li&gt; <li> Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta. </li><li> Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7-aminoactinomycin D (7AAD) a ciascun pozzetto per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone di corsa ai tubi del cluster. Trasferire l&#39;intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro. </li><li> Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positive in citometria a flusso software di analisi. </li></ol> 5. EC 50 Determinazione <ol><li> I valori di EC 50 di WS-CM e nicotina sono determinati da 7AAD-positivo colorazione dei PBMC. </li><li> Il valore EC50 è definito come il concentration alla quale il 50% delle cellule non erano più vitali in un saggio di 24 ore, ed i valori sono espressi come pg di equi-nicotina unità / ml. </li><li> Ai fini di questo studio, i valori di EC 50 sono stati determinati per essere 1,56 mg / ml e 1.650 mg / ml per WS-CM e la nicotina, rispettivamente. </li></ol> 6. citochine secrete NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza. <ol><li> Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina. </li><li> Diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 e 3000 mg / mL. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l&#39;ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo a ciascun pozzetto ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto.Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto. </li><li> Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine sospensione cellule con 200 ml di tampone di corsa ghiacciata e ripetendo la fase di lavaggio una volta. </li><li> Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Aggiungere 200 pl di 10 ug / ml di mezzo LPS in ciascun pozzetto. </li><li> Coprire la piastra ed incubare per 4 ore, 24 ore, 48 ore, o 72 ore a 37 ° C e 5% di CO 2. Regolare tempi di incubazione, se necessario. </li><li> Centrifugare la piastra a 300 g per 3 min. </li><li> Prendete 175 ml di surnatante da ogni bene e conservare in un freezer a -80 ° C per eseguire i test in step 7 e 8. </li></ol> 7. citometria Bead Array Assay &lt;ol&gt; <li> Scongelare i supernatanti cellulari preparati dal punto 6.10 e l&#39;uso nel saggio CBA. Eseguire il test di matrice tallone di citometria (CBA) come da istruzioni del produttore. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> Scongelare i supernatanti cellulari dal punto 6.10 e l&#39;uso in IL-8 ELISA. Eseguire il test ELISA secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 9. intracellulare colorazione e Citometria a Flusso NOTA: Le diluizioni elencati qui sono per lo scopo di questo studio. Le diluizioni possono essere regolati di conseguenza. <ol><li> Diluire WS-CM in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto alla concentrazione di 0,3, 1,56, 3, e 5 ug / ml di unità equi-nicotina. </li><li> Nella stessa piastra, diluire nicotina alle seguenti concentrazioni: 2, 10, 50, 100, 500, 2000 e 4000 mg / ml. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e Hazar dell&#39;ambientedous. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBMC sospese in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule più WS-CM o nicotina, sarà di 200 microlitri / pozzetto. </li><li> Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare le cellule a RT per centrifugazione a 300 xg per 3 min, aspirare il supernatante, vortex il fondo della piastra con piastra coperta e infine risospendere le cellule con 200 ml di ghiaccio freddo tampone di corsa, e ripetere la fase di lavaggio una volta. </li><li> Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo alla piastra, e ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> Preparate le concentrazioni di lavoro di 2 ml / ml GolgiPlug e 10 mcg / LPS ml con RPMI terreno completo e aggiungere 200 microlitri di ogni bene. </li><li> Incubare la piastra per 6 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Al termine della fase 9.8, lavare le cellule con tampone di corsa (4 ° C) e centrifugazione a 300xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 100 ml di Cytofix a ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule 3 volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 45 ml di 1x Cytoperm ciascun pozzetto seguito da 5 ml di ciascuna di uno dei seguenti anticorpi in ciascun pozzetto: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubare a 4 ° C per 30 min. </li><li> Lavare le cellule due volte come descritto al punto 9.9 con 1x Permwash (4 ° C) e una volta con tampone di corsa (4 ° C) a 300 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere le cellule con 200 ml di 2% paraformaldeide (4 ° C). Trasferire le cellule in provette 12 × 75 mm, e analizzare i campioni citofluorimetro. ATTENZIONE: Paraformaldeide è corrosivo, acutamente tossico e pericoloso per la salute. </li></ol> 10. K562 Assay Uccidere NOTA: K562 devono essere coltivatein coltura a 37 ° C e 5% CO 2 con mezzo completo RPMI fino a raggiungere 80% di confluenza prima del dosaggio. <ol><li> Preparare una 5mM carbossifluoresceina estere succinimidil (CFSE) stock soluzione con l&#39;aggiunta di 18 ml di DMSO al flacone. </li><li> Diluire WS-CM o nicotina in una piastra a 96 pozzetti utilizzando RPMI terreno completo per un volume totale di 100 microlitri / pozzetto per ottenere le unità equi-nicotina desiderati o concentrazioni di nicotina per ciascun pozzetto. ATTENZIONE: La nicotina è acutamente tossico e pericoloso per l&#39;ambiente. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBMC in terreno RPMI completo ad una concentrazione di 1,5 x 10 6 cellule / pozzetto. Il volume totale di cellule con WS-CM o nicotina sarà di 200 microlitri / pozzetto. </li><li> Coprire la piastra e incubare per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare le cellule K562 con l&#39;aggiunta di 10 ml di DPBS e centrifugare a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di DPBS e contare le cellule K562. </li><li> Preparare CFSE workisoluzione ng aggiungendo 1 ml di soluzione madre CFSE a 1 ml DPBS. </li><li> Aggiungere 1 ml della soluzione di lavoro CFSE a 1 ml di sospensione cellulare K562 contenente 1 -, 2 x 10 7 cellule. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere immediatamente 200 ml di FBS. Vortex e incubare proprio per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 10 ml di RPMI terreno completo e centrifugare la provetta a 400 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante RPMI e rompere il pellet e risospendere le cellule con 10 ml di mezzo RPMI completo e contare le cellule K562-CFSE etichettati. </li><li> Lavare le PBMC mediante centrifugazione la piastra a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il surnatante per decantazione del liquido. Riposizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra. Aggiungere 200 ml di RPMI terreno completo e ripetere lavaggio ancora una volta. </li><li> Aggiungere cellule K562-CFSE etichettati con un rapporto di 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMC) a ciascun pozzetto della piastra di PBMC e in seguito incubate per 5 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare il mix cellule per centrifugazione a 300 xg per 3 min a RT. Aspirare il supernatante scartando il liquido. Posizionare il coperchio e agitare la parte inferiore della piastra. </li><li> Aggiungere 200 ml di tampone di corsa e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 10.14 ancora una volta. </li><li> Aggiungere 95 ml di tampone di corsa seguiti da 5 ml di 7AAD a ciascun pozzetto un volume totale di 100 microlitri / pozzetto. Incubare la piastra al buio a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l&#39;intero volume di sospensione cellulare da ciascun pozzetto della piastra a tubi di cluster e acquisire i campioni al citofluorimetro. </li><li> Determinare la percentuale di cellule 7AAD-positivi e CFSE positivi citometria a flusso software di analisi. </li></ol>

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	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).</li><li>Zeller, M., Hatsukami, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Strategic+Dialogue+on+Tobacco+Harm+Reduction:+a+vision+and+blueprint+for+action+in+the+US.">The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US.</a> Tob. Control. 18, 324-332 (2009).</li><li>Sopori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cigarette+smoke+on+the+immune+system.">Effects of cigarette smoke on the immune system.</a> Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).</li><li>Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tobacco-smoke+on+key+signaling+pathways+in+the+innate+immune+response+in+lung+macrophages.">Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages.</a> J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).</li><li>Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+inhibits+lipopolysaccharide-induced+production+of+inflammatory+cytokines+by+suppressing+the+activation+of+activator+protein-1+in+bronchial+epithelial+cells.">Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells.</a> J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).</li><li>Moodie, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+cigarette+smoke+alter+chromatin+remodeling+but+differentially+regulate+NF-kappaB+activation+and+proinflammatory+cytokine+release+in+alveolar+epithelial+cells.">Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells.</a> Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).</li><li>Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+induces+IL-8,+but+inhibits+eotaxin+and+RANTES+release+from+airway+smooth+muscle.">Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle.</a> Respir. Res. 6, 74 (2005).</li><li>Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+induces+coordinate+activation+of+HSF+and+inhibition+of+NFkappaB+in+human+monocytes:+effects+on+TNFalpha+release.">Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).</li><li>Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+alveolar+type+II+epithelial+cell+chemokine+release:+effects+of+cigarette+smoke+and+neutrophil+elastase.">Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).</li><li>Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+and+nicotine+product+testing.">Tobacco and nicotine product testing.</a> Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).</li><li>Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+Regulatory+Science:+Research+to+Inform+Regulatory+Action+at+the+Food+and+Drug+Administration's+Center+for+Tobacco+Products.">Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products.</a> Nicotine Tob. Res. , (2014).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cytotoxicity+of+different+tobacco+product+preparations.">Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations.</a> Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).</li><li>Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+cell-specific+cytotoxic+responses+of+oral+cavity+cells+to+tobacco+preparations.">Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations.</a> Toxicol In Vitro. , (2012).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combustible+and+non-combustible+tobacco+product+preparations+differentially+regulate+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+functions.">Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).</li><li>Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li><li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry.">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li><li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells:+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay.">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li><li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells.">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li></ol>

The authors declare that there are no conflicts of interest.

Noi e altri abbiamo già dimostrato che il trattamento dei PBMC con centrali termiche sopprime diverse risposte, tra cui l&#39;espressione e la secrezione di citochine e misure funzionali come cellula bersaglio uccidendo 14. I metodi sperimentali descritti nel precedente lavoro richiedono periodi di incubazione più lunghi e sono stati modesti in grandezza 14. Date le potenziali applicazioni di questa affascinante ex vivo modello di ricerca di base e applicata, abbiamo studiato se nessuno ...

Un numero consistente di punti di conoscenza per gli effetti negativi per la salute del fumo di sigaretta cronica, tra cui malattie cardiovascolari (CVD), broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e il cancro 1,2. Il fumo di sigaretta cronica è stato conosciuto per causare infiammazione e la soppressione immunitaria, e queste alterazioni sono segnalati per contribuire ad un aumento del rischio di infezioni microbiche e cancro nei fumatori 3. In vitro e ex vivo le tecniche sono utili a chiarire le basi molecolari degli effetti fisiopatologici di fumo di sigaretta 4-9 (Tabella 1) e sono riconosciuti come importanti strumenti per guidare la regolamentazione emergente di vari prodotti del tabacco 10,11. Ad esempio, abbiamo dimostrato che sostanze infiammabili prodotti del tabacco (centrali termiche) come complesso medio-fumo condizionata (WS-CM) e particolato totale (TPM) sono di gran lunga più citotossici e dannoso perDNA di centrali termiche non combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, è stato recentemente riportato che le centrali termiche combustibili o nicotina 12,13. Coerentemente con il lavoro pubblicato, abbiamo recentemente riportato che centrali termiche combustibili causato marcata immunosoppressione. Ciò è stato dimostrato dalla soppressione del numero verde come recettore (TLR) -ligands, stimolata la secrezione di citochine, e mirata delle cellule (K562) l&#39;uccisione da PBMC in un modello ex vivo 14. Data l&#39;importanza di infiammazione in processi di malattia fumo-indotta sigaretta, un&#39;ulteriore ottimizzazione delle condizioni di analisi per valutare gli effetti modulatori immunitari del fumo di sigaretta è presentata in questo rapporto. Gli ex vivo saggi tipicamente misurate intracellulare e citochine, nonché la funzione citolitica di T citotossici e le cellule NK nella cella K562 uccidendo 14 saggi secreti. I saggi coinvolti pre-incubazione con WS-CM e nicotina e successiva stimolazione di PBMCs con TLR agonisti per un periodo di 3 giorni; le letture finali sono eseguite utilizzando saggi immunoenzimatica (ELISA) e / o di citometria a flusso. Abbiamo utilizzato lipopolisaccaride batterico (LPS), che si lega a recettori TLR-4 e stimola PBMC conseguente produzione di citochine intracellulari e secrezione di citochine. Oltre all&#39;ottimizzazione dei vari passaggi del test per valutare gli effetti immunomodulatori di centrali termiche, abbiamo anche i metodi attuali per PBMCs isolamento, saggi di morte cellulare, e IL-8 quantificazione. Questi metodi possono essere applicati per affrontare altre questioni di ricerca e ulteriormente raffinato per valutare i prodotti del tabacco nel contesto normativo. Tabella 1. Pubblicato segnalazioni di in vitro e ex vivo i metodi utilizzati per studiare varilus effetti fisiopatologici di preparati prodotti tabacco CS, media fumo di sigaretta.; CSC, fumo di sigaretta condensa; CSE, estratto di fumo di sigaretta; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi; qPCR, reazione a catena della polimerasi quantitativa; RT, in tempo reale reazione a catena della polimerasi quantitativa; TS, fumo di tabacco. <table><tbody><tr><td> Autore (Anno di corso) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Le cellule utilizzate </td><td> Le cellule umane bronchiali endoteliali (BEAS-2B), neutrofili umani </td><td> Cellule epiteliali alveolari umani (A549) </td><td> Vie aeree liscio cellule muscolari umane (HASMC) </td><td> U937 premonocytic umane, monociti umani </td><td> Tipo alveolare II cellule epiteliali (ATII) </td><td> Monocitica umanalinea cellulare (THP-1), macrofagi polmonari umane </td></tr><tr><td> TPP usato </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Metodo utilizzato </td><td> ELISA, qPCR, immigrazione, spostamento elettromobilità </td><td> Immunoistochimica-chimica, elettroforesi, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, elettroforesi </td><td> Spostamento Gel-mobility </td><td> La microscopia ottica, microscopia elettronica, elettroforesi, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit E-toxate (Sigma), piastra di p65 dosaggio (Transam), elettroforesi, vari kit immunodosaggio </td></tr><tr><td> Misura </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migrazione </td><td> Acetiltransferasi istoni, istone deacetilasi, NF-kB, IL-8, pI kB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotassina </td><td> Calore scossa / di stress proteine ​​(HSP / Hsp70), HF fattore di trascrizione NF-kB,TNF-α </td><td> Tensioattivo proteina (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, α-TNF, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK fosforilazione, cJun: legame al DNA, il glutatione, p65: legame al DNA </td></tr><tr><td> Risultato finale </td><td> CSE down-regola la produzione di citochine mediante la soppressione di AP-1 attivazione. </td><td> H 2 O 2 e CSC migliorare acetilazione delle proteine ​​istoniche, diminuire l&#39;attività dell&#39;istone deacetilasi, differenziale regolano il rilascio di citochine proinfiammatorie. </td><td> Il fumo di sigaretta può causare il rilascio di IL-8 da HASMC, arricchito da TNF-α, il 20% CSE meno di IL-8 rilascio, inibizione di eotassina e RANTES dal fumo di sigaretta. </td><td> TS attivati ​​fattore HF di trascrizione, che è stato associato con Hsp70 sovraespressione e l&#39;inibizione di NFkB attività e di rilascio del TNF-α vincolante. </td><td> Ridotto ATII livelli chemochine derivati ​​dalle cellule compromesso alveoriparazione lar, contribuendo al fumo di sigaretta indotto danno alveolare e l&#39;enfisema. </td><td> I dati forniscono spiegazione meccanicistica del perché i fumatori sono aumentate le infezioni respiratorie. Soppressione della risposta innata è accompagnata da un aumento di IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Tra le altre modifiche fisiopatologiche, l&#39;esposizione cronica al fumo di sigaretta provoca l&#39;infiammazione e la soppressione immunitaria, che sono stati collegati a una maggiore suscettibilità dei fumatori a infezioni microbiche e di tumori. Ex vivo soppressione delle risposte immunitarie recettoriali nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) trattato con componenti del fumo è un approccio interessante per studiare i meccanismi e valutare i probabili effetti a lungo termine dell&#39;esposizione ai prodotti del tabacco. Qui, abbiamo ottimizzato metodi per eseguire test ex vivo utilizzando PBMC stimolate da lipopolisaccaride batterico, una Toll-like receptor-4 ligando. Gli effetti di tutto a medio-fumo condizionata (WS-CM), una preparazione prodotto del tabacco combustibili (TPP), e la nicotina sono stati esaminati sulla secrezione di citochine e obiettivo l&#39;uccisione delle cellule dai PBMC nelle ex vivo saggi. Abbiamo dimostrato che le citochine secrete IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 e citochine intracellulari IFN-47 ;, TNF-α, e MIP-1α sono stati soppressi in PBMC WS-CM-esposte. La funzione citolitica di PBMC effettrici, come determinato da un saggio di cellula bersaglio K562 uccidere è stato ridotto da esposizione a WS-CM; nicotina era minimamente efficace in questi test. In sintesi, vi presentiamo una serie di migliori test per valutare gli effetti delle centrali termiche nel ex vivo saggi, e questi metodi potrebbero essere facilmente adattato per testare gli altri prodotti di interesse.

I risultati sono stati presentati come media ± errore standard della media (quattro campioni dei donatori). T-test di Student tra i campioni trattati e di controllo non trattati è stata effettuata utilizzando il software Excel nonché comparazioni t-test per tutti i trattamenti ai rispettivi controlli corrispondenti. La significatività statistica è stata indicata da: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Per misurare l&#39;effetto dell&#39;esposizione alla WS-CM e nicotina, ...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K Views.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

Video: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Due metodi di Formazione Heterokaryon per scoprire fattori di restrizione HCV

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Istituzione e Ottimizzazione di un programma di installazione High Throughput per studiare<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infezione come modello per Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Sviluppo di un virus System Reporter dell&#39;epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

L&#39;uso di un monociti monostrato test per valutare fagocitosi Fcy recettore-mediata

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Un romanzo In Vitro ferita guarigione test per valutare la migrazione cellulare

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Progettazione del doppio modello di legatura e puntura ceca dell'infezione intranasale dell'immunosoppressione indotta dalla sepsi

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Sartoria in vivo saggi di citotossicità per studiare l'Immunodominanza nelle risposte delle cellule CD8+ T specifiche del tumore

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...