Il sostegno finanziario del Ministero dell&#39;Istruzione, dell&#39;Università della Ricerca (PRIN-2009K3RH7N_002) e Marie Curie Intra-European Fellowship (CYCLOGUO-298555), nonché il patrocinio del COST Action CM0603 su &#39;Free Radicals in Chemical Biology e azione COST CM1201 su &quot;Chimica Biomimetic radicale&quot; Si ringraziano.

1. Sintesi di Mono-trans isomeri di esteri del colesterolo <ol><li> Sciogliere esteri del colesterolo (linoleato o arachidonato cholesteryl estere) in 2-propanolo (15 mm). Per una migliore solubilizzazione, i campioni sono stati sonicati per 15 min sotto argon. </li><li> Trasferire la soluzione in un reattore fotochimico quarzo, aggiungere 2-mercaptoetanolo in 2-propanolo (7 per raggiungere la concentrazione mM, da una soluzione 2 M magazzino del tiolo). Lavare la miscela di reazione con argon per 20 minuti al fine di eliminare la presenza di ossigeno nella soluzione. </li><li> Irradiare la miscela di reazione con luce UV utilizzando un 5.5W bassa pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 4 min. Monitor analitica Ag-TLC (cromatografia argento sottile strato) in evidenza la formazione di mono-trans esteri del colesterolo (vedi Figura 1 per le formule chimiche). La colorazione TLC viene effettuata versando la piastra nella cerio ammonio molibdato (CAM) soluzione, e le macchie appaiono sul riscaldamentola piastra. Estinguere la reazione in una fase iniziale, al fine di recuperare il materiale di partenza, che può essere riutilizzato per eseguire altre fasi di isomerizzazione, ottenendo un aumento del rendimento complessivo. </li><li> Raccogliere la miscela di reazione in un pallone, lavare l&#39;apparecchiatura con pochi ml di 2-propanolo. Rimuovere il solvente e purificare i mono-trans isomeri di esteri del colesterolo di Ag-TLC come descritto in letteratura. 5 Utilizzare esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente per mono-trans isomeri colesteril linoleato, mentre esano uso -dietil etere-acetico (9:1:0,1 v / v) di mono-trans isomeri arachidonato colesterolo. </li></ol> 2. Isolamento di Cholesteryl Frazione Esteri da siero umano <ol><li> Diluire 1 ml di siero umano (ottenuto per centrifugazione del sangue) con 1 ml di salamoia e versare la soluzione in un imbuto separatore sotto flusso di argon per evitare artefatti (es. addotti di ossidazione). Aggiungere 10 ml di cloroformio-metanolo (2: 1 v / v) tre volte. Agitare l&#39;imbuto di separazione molto lentamente per limitare la formazione dell&#39;emulsione dovuta alla presenza di albumina. </li><li> Lavare gli strati organici volta con salamoia (10 ml), poi raccogliere in una beuta sotto un flusso di argon, secca su sodio solfato anidro. Rimuovere volatili da evaporatore rotante per dare un olio giallo (totale frazione lipidica plasma). </li><li> Raccogliere il grezzo con 1 ml di cloroformio-metanolo (2:1 v / v), il carico su una TLC preparativa sotto flusso di argon e usare una miscela di esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente . Raschiare la parte di silice contenente la frazione colesterolo estere e versare in una fiala. Quindi, estrarre silice (3 × 5 ml) con cloroformio-metanolo (2:1 v / v), gli strati organici raccogliere e rimuovere il solvente dopo evaporazione ottenendo la frazione pura di esteri del colesterolo (solitamente ~ 1,5 mg). </li><li> Tenere esteri del colesterolo in un flaconcino scuro coperto da un foglio di alluminio sotto Argon e conservare a -20 ° C. Del colesterolo ester sono sensibili alla luce e ossigeno. </li></ol> 3. Caratterizzazione di esteri del colesterolo Mono-trans di Spettroscopia Raman <ol><li> Estratto esteri del colesterolo da siero umano (≥ 0,7 mg), come descritto nella sezione 2, sciogliere in una piccola quantità di tetracloruro di carbonio (≤ 10 pl) e mettere in un flaconcino. CCl 4 è selezionato come solvente perché il suo segnale Raman non si sovrappone alla regione di interesse di analisi degli esteri del colesterolo. </li><li> Trasferire la soluzione di supporto del campione attraverso una pipetta di vetro monouso, poi rimuovere il solvente da un lento flusso di argon. Una volta che una pellicola uniforme oleosa è formata sulla parete interna del supporto del campione, inserire quest&#39;ultima nello strumento di misurazione. </li><li> Trasformata di Fourier spettro Raman di esteri del colesterolo si ottiene direttamente sugli estratti lipidici senza alcuna reazione di derivatizzazione. La potenza del laser sul campione è &lt;100 mW per evitare danni campione. Il numero totale di scansioniper ogni spettro è ≥ 800 per minimizzare il rumore di fondo. </li><li> La gamma 1,700-1,630 cm -1 dello spettro Raman è analizzato poiché riflette il contributo dei C = C doppi legami presenti nella molecola (C = C stiramento mode). Un&#39;analisi di adattamento della curva viene eseguita su questa regione, consentendo la distinzione dei contributi sovrapposti di cis e trans doppi legami nella catena grassa alchile e doppio legame nell&#39;anello B anello di colesterolo (vedi Figura 2). </li><li> Per montare correttamente le bande vibrazionali, alcuni parametri devono essere fissati o vincolata entro limiti ragionevoli. I profili di picco del componente sono descritti come una combinazione lineare di Lorentzian e funzioni gaussiane, mentre le larghezze di banda a metà altezza sono meglio determinato dalla routine di ottimizzazione del computer. Il numero e la posizione dei picchi di componenti sono ottenuti utilizzando gli spettri quarto derivato, che consentono di rilevare anche alcune bande componenti deboli. Poiché il segnaleal rumore che deteriora sulla differenziazione del segnale può preclude l&#39;uso del derivato quarto, lisciato derivati ​​quarto con tredici punti Savitsky-Golay funzione, sono di vantaggio, quindi un giusto compromesso tra risoluzione e rapporto segnale-rumore è ottenuto . Migliore adattamento curva sono disponibili presso i più bassi possibili c 2 valori. </li><li> La presenza di trans isomeri è rivelata dal componente a 1671 ± 1 cm -1, in aggiunta, almeno, le due componenti, leggermente spostata verso frequenze più basse, a causa della catena di acido grasso e colesterolo legami C = C doppi. Rappresentante spettro Raman di plasma colesteril estere è mostrato in Figura 9. Nel riquadro confronto di una regione specifica di colesteril linoleato e mono-trans isomeri colesteril linoleico è mostrato. </li></ol> 4. Derivatizzazione di esteri metilici degli acidi grassi (FAME) e analisi mediante gascromatografia <ol><li> Sciogliereesteri del colesterolo (~ 1,5 mg) con 0,5 ml di una soluzione 1 M di idrossido di sodio in benzene-metanolo (2:3 v / v) e posto in un flacone scuro coperto da un foglio di alluminio sotto argon. </li><li> Lascia la miscela sotto agitazione a temperatura ambiente e monitor mediante TLC usando una miscela di esano-etere etilico (9:1 v / v) come eluente. Tempo di reazione è di solito 30 min ma un attento monitoraggio reazione è richiesto. Infatti, una volta che i corrispondenti esteri metilici si formano, la reazione deve essere raffreddato per evitare la formazione di prodotti di degradazione e di lato. TLC ha mostrato la formazione di esteri metilici quantitativa. </li><li> Estinguere la miscela di reazione con l&#39;aggiunta di 1 ml di salamoia ed estrarre gli esteri metilici con n-esano (3 x 2 ml). Raccogliere gli strati organici in una fiala e rimuovere il solvente mediante evaporazione rotante per dare la frazione metil estere, che viene quindi utilizzato per analisi GC senza ulteriore purificazione. </li><li> Sciogliere gli esteri metilici nel quantitativo minimo di n-esano (solitamente 1 mg a 50 microlitri) e iniettare nel gascromatografo dotato di 60 m × 0,25 mm × 0,25 micron (50%-cianopropile)-metilpolisilossano colonna. Utilizzare un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) con il seguente programma di forno: inizio temperatura a 165 ° C, mantenuta per 3 min, seguito da aumento di 1 ° C / min fino a 195 ° C, mantenuta per 40 minuti, seguita da una seconda aumento di 10 ° C / min fino a 240 ° C, e mantenere per 10 min. Una modalità pressione costante (29 psi) viene scelto. Elio o idrogeno può essere utilizzato come gas di trasporto. Esteri metilici vengono identificati per confronto con i tempi di ritenzione dei campioni autentici. Figura 10 mostra l&#39;analisi GC rappresentativo di FAME ottenuta da plasma esteri del colesterolo. </li></ol> 5. Sintesi di (5&#39;R) - e (5&#39;S) -5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiadenosina <ol><li> Sciogliere 33 mg di 8-bromo-2&#39;-deossiadenosina (8-Br-Dado) in acetonitrile (100 ml) in modo da raggiungere una concentrazione di 1 mM. Regolare il flusso di gas (Ar o N2) nel fotoreattore e riempire l&#39;appaRatus con la soluzione di 8-Br-Dado. </li><li> Preparare un setto con la dimensione appropriata per l&#39;ingresso del fotoreattore e passare un ago connesso alla linea di gas inerte attraverso il centro di esso. Chiudere il sistema con il setto. Lavare il gas inerte per 30 min. </li><li> Irradiate dalla luce UV utilizzando un 125W media pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 15 min, raccogliere la soluzione in 250 ml pallone. Lavare il fotoreattore con 10 ml di acetonitrile e raccogliere lavaggio nel matraccio stesso. </li><li> Estinguere la miscela grezza di reazione con 1 M NH 4 OH soluzione e si evapora il solvente nel evaporatore rotante. </li><li> Eseguire l&#39;analisi cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC-UV) con la colonna analitica (vedi sezione strumenti) in condizioni note, e confrontare il profilo con composti di riferimento. </li><li> Eseguire liquida ad alte prestazioni analisi cromatografica (HPLC-UV) con una colonna analitica (vedere sezione strumentazione) utilizzando la seguente solsfiati e gradienti: 2 mM ammonio formiato come solvente A e acetonitrile come solvente B. Impostare la portata di 1 ml / min e il gradiente da 0% solvente B al 0,3% di solvente B da raggiungere in 2,2 min. Poi B 0,8% solvente in in 4,0 min, quindi B 1% solvente in 4.8 min. Restare a 1% B solvente per 9 min e poi andare a 8% solvente B in 6 minuti. Dopo andare a 10% di solvente B in 4 min e il 30% di solvente B in 5 min e rimangono al 30% b solvente per altri 5 min. Raccogliere i picchi cromatografici corrispondenti ai due prodotti diastereomerici in due fiale diverse. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza delle due frazioni raccolte nello spettrofotometro UV e calcolare la concentrazione esatta in base al Lamber-Beer legge (A = εlC, dove A è l&#39;assorbanza, ε il coefficiente di estinzione e L la lunghezza della cella). Utilizzare il ε coefficiente di estinzione del 2&#39;-deossiadenosina (Dado) (15400 M -1 cm -1 a 260 nm). </li></ol> 6. Sintesi di (5&#39;R) - und (5&#39;S) -5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiguanosina <ol><li> Sciogliere 35 mg di 8-bromo-2&#39;-deossiguanosina (8-Br-dGuo) e 30 mg di ioduro di sodio (NaI) in acqua distillata (100 ml) in modo da raggiungere la concentrazione 1 mM e 2 mM, rispettivamente. Regolano gas inerte (Ar o N 2) collegato al flusso fotoreattore e riempire il fotoreattore con la soluzione di reazione. </li><li> Degassare la miscela di reazione come descritto nella procedura 5 (punto b). </li><li> Irradiate dalla luce UV utilizzando un 125W media pressione lampada al mercurio a 22 ± 2 ° C per 30 min, raccogliere la soluzione in 250 ml pallone. Lavare la fotoreattore con 10 ml di acqua e raccogliere lavaggio nel matraccio stessa. </li><li> Estinguere la miscela grezza di reazione con 1 M NH 4 OH soluzione e si evapora il solvente sotto vuoto. </li><li> Eseguire l&#39;analisi come descritto nella Procedura 5 (passi da E a g). Utilizzare il ε coefficiente di estinzione della 2&#39;-deossiguanosina (dGuo) (11.700 m -1 cm -1 a 260 nm). </li></ol> 7. Sintesi di isotopica Purina etichetta (5&#39;R) - e (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclonucleosides <ol><li> Preparare 2 ml di soluzione acquosa 1 mM (acqua distillata) dei 15 N isotopica nucleosidi purinici etichettati ([15N 5] Dado o [15N 5] dGuo) in una fiala di vetro (4 ml) con un coperchio a diaframma. </li><li> Collegare il flacone con il coperchio a diaframma e collegare alla linea gas (N 2 O per saturazione della soluzione) attraverso un ago nel setto che raggiunge il fondo della fiala. Un&#39;altra ago corto nel coperchio a diaframma funziona come l&#39;uscita del gas. </li><li> Lavare la soluzione con N 2 O per 30 min. Il flusso di gas è regolata per essere molto bassa. </li><li> L&#39;ago uscita viene prima tolto e dopo 1 &#39;quella lunga segue, in modo da avere una piccola pressione all&#39;interno del flacone. </li><li> Mettere la soluzione in un apparecchio di radiolisi gamma per 8 ore (calcolo sulla base di una dose tasso ca. 4,5 Gy / min). </li><li> Dopo la reazione placare la grezzo con 1 M NH 4 </sub&gt; OH soluzione. </li><li> Eseguire l&#39;analisi cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC-UV) in condizioni note, 6 e confrontare il cromatogramma con i riferimenti standard. </li></ol> 8. Radiolisi gamma di soluzioni acquose di DNA <ol><li> Preparare 1 ml di 0,5 mg / ml di soluzione (acqua distillata) del DNA di timo di vitello e messo in una fiala di vetro (2 ml) con un coperchio a diaframma. </li><li> Degassare la reazione come descritto nella procedura 7 (fasi bd). </li><li> Mettere la soluzione in un apparecchio di radiolisi gamma per 30 minuti (calcolo sulla base di dose / velocità di ca. 4,5 Gy / min). </li></ol> 9. La digestione enzimatica del DNA <ol><li> Ad un tubo Eppendorf contenente 80 pg di DNA, aggiungere 8 U di nucleasi P1, 0,01 U di fosfodiesterasi II, 20 nmol di EHNA in 20 pl di 300 mM acetato di sodio (pH 5,6) e 10 mM di cloruro di zinco. Incubare la miscela a 37 ° C per 48 ore. </li><li> Successivamente aggiungere una miscela di 8 U di fosfatasi alcalina, 0,02 U di phosphodiesterase I, in 40 ml di 0,5 M Tris-HCl (pH 8,9) a digestione miscela. Il campione viene incubato a 37 ° C per 2 h. </li><li> La miscela viene neutralizzata per aggiunta di 10% di acido formico. </li><li> Trasferire il campione in un Ultra-0.5 Amicon dispositivo centrifugo filtro (cutoff 3 kDa), aggiungere 200 ml di tridistilled H 2 O. Posizionare il Ultra-filtro nel rotore di centrifuga a 14000 xg per 15 min. Quindi separare il dispositivo Ultra filtro dalla provetta. Liofilizzare l&#39;enzima senza soluzione nella provetta. </li></ol> 10. DNA desalinizzazione campioni prima dell&#39;analisi <ol><li> Eseguire liquida ad alte prestazioni di analisi cromatografica (HPLC-UV) con la colonna analitica (vedere la sezione strumentazione) a seguito di condizioni note 6. </li><li> Sciogliere il DNA digerito liofilizzato in 20 ml di H 2 O e iniettare in HPLC-UV. </li><li> Raccogliere il campione in un flaconcino dopo l&#39;eluizione sale (primi minuti) e appena prima del tim eluizionee del nucleoside primo (5&#39;R-cdGuo), fino alla fine del programma cromatografico. </li><li> Il campione viene liofilizzato e resolubilized in 20 microlitri di acqua. </li></ol> 11. LC-MS/MS analisi quantitativa <ol><li> Preparare i HPLC-MS/MS (triplo quadrupolo) prima di iniziare l&#39;analisi caricando il metodo analitico e il metodo per il rivelatore MS (ESI). 6 </li><li> Aggiungere 1 ml della miscela isotopica etichettato composti nel campione preparato in Procedura 7. </li><li> Iniettare 20 pl della soluzione spiked DNA digerito in acqua distillata. </li><li> I dati cromatografici ottenuti sono elaborati sulla base della precedente taratura con composti di riferimento. Una HPLC rappresentante eseguire contenente adenosina e guanosina 2&#39;-deoxyribonucleosides e loro derivati ​​ossidativi e cicloolefine è mostrato in Figura 11. </li></ol>

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	<li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+lipidomics+and+the+geometry+of+unsaturated+fatty+acids:+from+biomimetic+models+to+biological+consequences.">Membrane lipidomics and the geometry of unsaturated fatty acids: from biomimetic models to biological consequences.</a> Methods Molecular Biology. 579, 391-412 (2009).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., Terzidis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purine+5',8-cyclonucleoside+lesions:+chemistry+and+biology.">Purine 5',8-cyclonucleoside lesions: chemistry and biology.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1368-1382 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+reductive+modifications+of+sulfur-containing+amino+acids+within+peptides+and+proteins.">Radiation-induced reductive modifications of sulfur-containing amino acids within peptides and proteins.</a> Journal of Proteomics. 74 (11), 2264-2273 (2011).</li><li>Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids:+the+free+radical+path.">Trans lipids: the free radical path.</a> Accounts Chemical Research. 38 (6), 441-448 (2005).</li><li>Melchiorre, M., Torreggiani, A., Chatgilialoglu, C., Ferreri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+markers+of+geometrical+radical+stress:+synthesis+of+mono-trans+cholesteryl+esters+isomers+and+detection+in+human+plasma.">Lipid markers of geometrical radical stress: synthesis of mono-trans cholesteryl esters isomers and detection in human plasma.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (38), 15184-15190 (2011).</li><li>Wang, J., Yuan, B., Guerrero, C., Bahde, R., Gupta, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Oxidative+DNA+Lesions+in+Tissues+of+Long-Evans+Cinnamon+Rats+by+Capillary+High-Performance+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+Stable+Isotope-Dilution+Method.">Quantification of Oxidative DNA Lesions in Tissues of Long-Evans Cinnamon Rats by Capillary High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with Stable Isotope-Dilution Method.</a> Analytical Chemistry. 83 (6), 2201-2209 (2011).</li><li>Boussicault, F., Kaloudis, P., Caminal, C., Mulazzani, Q. G., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+C5'+radicals+of+purine+nucleosides+under+oxidative+conditions.">The fate of C5' radicals of purine nucleosides under oxidative conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (26), 8377-8385 (2008).</li><li>Ferreri, C., Kratzsch, S., Brede, O., Marciniak, B., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans+lipids+formation+induced+by+thiols+in+human+monocytic+leukemia+cells.">Trans lipids formation induced by thiols in human monocytic leukemia cells.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 38 (9), 1180-1187 (2005).</li><li>Zambonin, L., Ferreri, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+trans+fatty+acids+in+rats+fed+a+trans-free+diet:+a+free+radical-mediated+formation.">Occurrence of trans fatty acids in rats fed a trans-free diet: a free radical-mediated formation.</a> Free Radicals Biology &amp; Medicine. 40 (9), 1549-1556 (2006).</li><li>Puca, A. A., Andrew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+profile+of+erythrocyte+membranes+as+possible+biomarker+of+longevity.">Fatty acids profile of erythrocyte membranes as possible biomarker of longevity.</a> Rejuvenation Research. 11 (1), 63-72 (2008).</li><li>Belmadoui, N., Boussicault, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+formation+of+purine+5',8-cyclonucleosides+in+isolated+and+cellular+DNA:+high+stereospecificity+and+modulating+effect+of+oxygen.">Radiation-induced formation of purine 5',8-cyclonucleosides in isolated and cellular DNA: high stereospecificity and modulating effect of oxygen.</a> Organic &amp; Biomolecular Chemistry. 8 (14), 3211-3219 (2010).</li><li>Chatgilialoglu, C., Bazzanini, R., Jimenez, L. B., Miranda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(5'S)-+and+(5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine:+mechanistic+insights+on+the+2'-deoxyguanosin-5'-yl+radical+cyclization.">(5'S)- and (5'R)-5',8-cyclo-2'-deoxyguanosine: mechanistic insights on the 2'-deoxyguanosin-5'-yl radical cyclization.</a> Chemical Research in Toxicology. 20 (12), 1820-1824 (2007).</li><li>Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxidative+DNA+lesions+8,5'-cyclopurines+accumulate+with+aging+in+a+tissue-specific+manner.">The oxidative DNA lesions 8,5'-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner.</a> Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).</li><li>Ferreri, C., Chatgilialoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fatty+acid-based+functional+lipidomics+in+the+development+of+molecular+diagnostic+tools.">The role of fatty acid-based functional lipidomics in the development of molecular diagnostic tools.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 12 (7), 767-780 (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La conversione di natura cis acidi grassi insaturi a trans isomeri geometrici è una trasformazione connessa con la produzione di stress radicalico nell&#39;ambiente biologico. Lipidi di membrana delle cellule, che contengono acidi grassi, sono un obiettivo rilevante biologico per stress radicalico e abbiamo prima studiato il endogeno cis-trans isomerizzazione fosfolipidi in colture cellulari, animali ed esseri umani valutando protocolli analitici in ogni caso. 8-10 Abbiamo dimostrato che questa trasformazione può avvenire da una varietà di composti contenenti S, incluse tioli, tioeteri e disolfuri, che in diverse condizioni di stress radicali sono in grado di generare radicali thiyl, cioè l&#39;agente isomerizzante (Figura 3). L&#39;esempio illustrato in questo articolo si concentra sulla classe di esteri del colesterolo, che rappresentano un noto frazione di lipidi plasmatici, strettamente coinvolto nel metabolismo delle lipoproteine. Il legame estere tra acidi grassi e cholesterol è biosynthesized dal trasferimento di acidi grassi dalla posizione 2 della frazione di glicerolo di fosfatidilcolina di colesterolo, un passo catalizzata dalla acile enzima colesterolo lecitina transferasi (LCAT). Pertanto, plasma esteri del colesterolo sono strettamente connesse con fatturato membrana di lipidi, e contengono percentuali piuttosto elevate di acidi grassi polinsaturi (PUFA) tipicamente presenti in fosfatidilcoline, linoleico e acidi arachidonico cioè. Formazione lipoproteina è coinvolto in malattie cardiovascolari e metaboliche. La reattività di esteri del colesterolo naturali con radicali liberi possono verificarsi i doppi legami di linoleato e residui arachidonico, che possono essere trasformati nei corrispondenti isomeri trans geometrici (vedi Figura 1 per le strutture). Caratterizzazione del contenuto di trans esteri del colesterolo nei campioni biologici è interessante per lo sviluppo di biomarker. Una metodologia indiretta consiste nella trasformazione di cholesteryesteri l isolato dal plasma ai corrispondenti esteri di acidi grassi (FAME metile) e la separazione mediante protocolli gascromatografiche. In questo caso, la calibrazione dei riferimenti standard di cis e trans esteri metilici degli acidi viene eseguita, per consentire la quantificazione del contenuto di trans nei campioni. Sulla base degli studi analitici effettuati sulla libreria esteri del colesterolo, si propone di applicare anche un metodo basato sulla spettroscopia Raman, che può essere effettuata direttamente sulla frazione esteri del colesterolo isolata da plasma, senza ulteriore derivatizzazione al FAME corrispondente (vedi figure 2 e 9). Vale la pena notare che fino ad ora non sono descritti metodi efficaci per cis separato e isomeri trans di acidi grassi contenenti lipidi mediante HPLC, come invece descritto da idroperossidi esteri del colesterolo. Finora, il metodo indiretto gascromatografico è ancora il metodo migliore finora disponibili. Con questo metodo il primo quantitativo valuzione del mono-trans contenuti derivati ​​da esteri del colesterolo isolate dal plasma di soggetti sani è stato fornito. Utilizzo Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) il limite di rilevabilità è soddisfacente (ppb) e quantità nanomolari dei composti sono stati rilevati. 5. Con i sistemi di rilevazione diverse questo limite può essere anche abbassato. L&#39;effetto delle radiazioni ionizzanti sulla esteri del colesterolo è questione di ulteriori studi, se una risposta lineare si ottiene rispetto alla dose applicata. Come secondo esempio, abbiamo scelto nucleosidi modificati che possono essere prodotti da danni dei radicali liberi del DNA. Radicali idrossilici (HO •) sono noti per essere la specie più nocive reattive dell&#39;ossigeno (ROS) per la loro capacità di causare modificazioni chimiche di DNA. Lesioni singole o multiple possono verificarsi su DNA, che in cellule eucariotiche si trova nel nucleo e mitocondri. Identificazione e misura delle principali classi di danni ossidativi al DNA generati richiedere la appropriate librerie molecolari, al fine di impostare i protocolli analitici. Abbiamo focalizzato il nostro interesse sulle lesioni più piccole tandem, che sono purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deoxyribonucleosides, avente un legame covalente ulteriore tra la base e le frazioni di zucchero creati dall&#39;attacco dei radicali liberi. I composti sono 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiadenosina e 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiguanosina esistente nelle 5&#39;R e 5&#39;S forme diastereomeriche (Figura 5). Il loro potenziale per diventare liberi marcatore stress radicalico è materia di ricerca fondamentale. 2 Infatti, quando il DNA è esposto a HO • astrazione radicale idrogeno dalla posizione C5 &#39;dello zucchero è uno dei possibili eventi che portano alla formazione di queste lesioni tandem. Purine 5 &#39;,8-cyclonucleosides può essere misurata come somma di diastereomeri da HPLC-MS/MS digeriti enzimaticamente in γ-irradiati campioni di DNA variabili 1-12 lesioni / 10 6 / nucleosidi Gy andando assenza forma di ossigeno a livello fisiologico di ossigeno Iotessuti n, il rapporto diastereomerico 5&#39;R / 5&#39;S essendo ~ ~ 4 e 3 per 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdGuo, rispettivamente (Figura 11). 11 Si noti che la relazione tra dose di radiazioni e 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdAdo lesioni rilevate nel DNA cellulare è lungi dall&#39;essere compreso. Il singolo esperimento sulla base dell&#39;irradiazione 2kGy riportati nella sperimentale non possono essere considerati conclusivi. 11 Ulteriori esperimenti di questo tipo e quantificazione analitica delle quattro lesioni sono necessari per definire tale rapporto. Il rilevamento di queste lesioni e le trasformazioni più popolari ossidativi (come 8-oxo-2&#39;-deossiguanosina, 8-oxodGuo) sono materia di intense evidenziando l&#39;importanza di entrambe le lesioni durante il metabolismo ossidativo. 6,13 L&#39;utilizzo di HPLC -MS/MS (triplo quadrupolo) ha un limite di rivelazione assieme a 30fmol per tutte e quattro le lesioni. Ultimi miglioramenti sono richiesti per raggiungere limiti di rilevazione dei livelli attomol dallo strumento produttoritori. Sulla base della letteratura molto recente, 6 procedure analitiche dover includere la pulizia corretta del campione e di arricchimento per soddisfare i limiti di rivelazione del MS / MS / MS (ion trap) o del MS / MS (triplo quadrupolo) utilizzati nel nostro caso. Procedure di sintesi bio-ispirati di composti 1-4 sono stati sviluppati a partire da 8-bromopurine strumenti derivati ​​di cui o fotolisi. 7,12 Queste procedure comportano una reazione radicalica a cascata che imita il meccanismo di danno al DNA di formazione di 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdGuo lesioni. Da prospettive biologiche, è stato trovato che queste lesioni si accumulano con l&#39;invecchiamento in un tessuto-specifica (fegato&gt; rene cervello&gt;), dimostrando che i meccanismi di riparazione del DNA sono inadeguati per conservare il materiale genetico di queste lesioni. 13 Infatti, nucleotide excision repair (NER) è l&#39;unica via attualmente individuate per la riparazione di queste lesioni. 2 I due classees di composti mostrato nelle figure 1 e 5 non sono commercialmente disponibili al momento, tuttavia dalle strategie sintetiche descritte in letteratura non sarebbe difficile preparare questi composti per uso commerciale. L&#39;approccio multidisciplinare è fornito da studi di biologia chimica non solo ha un valore enorme per l&#39;identificazione di nuovi meccanismi che si verificano in ambiente biologico, ma dà anche un contributo fondamentale alla scoperta di biomarcatori e la diagnostica, in ultima analisi, portare novità nella cura della salute e le strategie di prevenzione. 14 Il contributo chimica è necessaria per uno sviluppo positivo della medicina molecolare, la creazione di piattaforme integrate e pannelli per profili metabolici che si prevede di consentire una razionalizzazione ottimale di progettazione dell&#39;intervento, sia terapeutico e nutrizionale, riducendo le incertezze e gli errori quando possono essere prevedibili.

La reattività dei radicali liberi rivelato la sua enorme importanza per molti eventi biologici, inclusi anziani e l&#39;infiammazione. Oggigiorno è sempre più evidente che la chiarificazione di ogni fase chimici coinvolti in questa reattività è necessario, al fine di comprendere i meccanismi e le strategie prevedono efficaci per il controllo dei radicali liberi e di riparazione del danno. Il contributo studi chimici è fondamentale, ma lo studio diretto nell&#39;ambiente biologico può essere difficile, in quanto la sovrapposizione di diversi processi complica e perturba l&#39;esame dei risultati e delle relative conclusioni. Di conseguenza, la strategia di modellare reazioni dei radicali liberi in condizioni biologicamente connessi è diventato un passo fondamentale nella ricerca di meccanismi chimici in biologia. Negli ultimi dieci anni il nostro gruppo ha sviluppato modelli di processi senza radicali in condizioni biomimetiche. In particolare endal viso trasformazioni biologicamente rilevanti di acidi grassi insaturi, nucleosidi, e aminoacidi contenenti zolfo e metterli in pista per essere valutati e validati come biomarker dello stato di salute. 1-4 Il nostro approccio generale si compone di tre moduli: <ul><li> Sintesi organica, che fornisce l&#39;accesso a biomolecole opportunamente modificati. Il piano sintetico può essere anche progettato per simulare i processi radicali liberi presenti nell&#39;ambiente biologico, applicando così condizioni in grado di simulare il processo biologico di interesse, che è il principio della chimica biomimetica radicale. In modelli biomimetici mezzo di reazione è acqua o un mezzo eterogeneo per la coesistenza di compartimenti idrofili e idrofobi. Il vantaggio di lavorare con modelli biomimetici è quello di avere un ambiente semplificato con i partner di reazione note, dove la reattività e prodotti possono essere esaminati più in dettaglio, eventualmente scoprirenuovi percorsi chimici. Da questo punto informazioni sui meccanismi e cinetiche possono essere raccolti; </li><li> Purificazione, analisi e caratterizzazione dei prodotti, fornendo informazioni strutturali e chimiche delle biomolecole modificate per organizzare librerie molecolari e facilitare recognition.in l&#39;ambiente più complesso biologico. Protocolli sono stabiliti anche in vista di risolvere miscele complesse di composti come quelli derivati ​​da campioni biologici; </li><li> Biomarker di sviluppo utilizzando campioni biologici, derivanti sia da esperimenti in vitro su colture cellulari e studi in vivo da animali ed esseri umani. I protocolli sviluppati in modelli biomimetici sono poi applicato all&#39;analisi di campioni complessi, per prevedere le trasformazioni radicali liberi in condizioni diverse. Librerie molecolari sviluppati da sintesi sono di enorme aiuto alle scoperte delle scienze della vita. Le informazioni raccolte sul trasformazioni radicali liberi give la possibilità di capire le strategie di riparazione e prevenzione. Database dei risultati possono essere utilizzati per un&#39;attenta valutazione mediante analisi multivariata del significato biomarker nonché possibili fattori associati. </li></ul> Abbiamo scelto due classi di biomarcatori rilevanti per accreditare questo approccio: esteri del colesterolo e purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deoxyribonucleosides.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>MATERIALS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl linoleate &ge;98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0289-100 mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl arachidonate&ge;95% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C8753-25mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M6250-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-propanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34965-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Methanol 215 SpS </td>
 <td>Romil</td>
 <td> H409-2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>02860-2.5L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Chloroform SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H135 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> n-Hexane 95% SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td> H389 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetonitrile 230 SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H047 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Dichloromethane SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H2022,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Carbon tetrachloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>107344-1L </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Diethyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td> 309966-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S7653-5KG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaOH solid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221465-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NH4OH sol. 28%-30%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221228-1L-A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320099-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221759-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Molybdate tetrahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A7302-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sulfuric Acid 95%-98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320501-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Silver Nitrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>209139-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium sulfate anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>238597-500G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nuclease P-I from penicillium citrinum</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N8630-1VL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase II type I-sa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P9041-10UN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E114-25MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphatase alkaline type VII-t from*bov</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P6774-1KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase I type VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P3134-100MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonuclease II type IV from*porcin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D4138-20KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Trizma(r) base, biotechnology performanc ce</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T6066-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1644-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Succinic acid bioxtra</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3674-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5670-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Formic acid, 98 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>06440-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC500324</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyguanosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3290-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyadenosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3300-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3899-CA-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3895-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nitrous oxide (N2O) </td>
 <td>Air Liquide </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonucleic acid from calf thymus</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D4522-5MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60Co-Gammacell</td>
 <td>AECL- Canada </td>
 <td>220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immersion well reaction medium pressure 125 watts </td>
 <td>Photochemical reactors ltd</td>
 <td>Model 3010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Evaporating flask 250 ml</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luna 5 &mu;m C18(2) 100 &Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>00A-4252-E0 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 &mu;m</td>
 <td>Grace</td>
 <td>88081</td>
 <td>Semipreparative</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SecurityGuard Kit</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>KJ0-4282</td>
 <td>Analytical holder kit and accessories</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Holder for 10.0 mm ID cartridges</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7220</td>
 <td>Semipreparative holder </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.0 mm ID cartridges </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7221 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-performance liquid chromatography (HPLC) </td>
 <td>Agilent</td>
 <td>1100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LC/MS/MS </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4000QTRAP System</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tandem mass ESI spectrometer </td>
 <td>(Bruker Daltonics) </td>
 <td>Esquire 3000 plus </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 2-4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27517</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>

free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development

Il coinvolgimento dei radicali liberi nelle scienze della vita è costantemente aumentato con il tempo ed è stato collegato a numerosi processi fisiologici e patologici. Questo tema abbraccia diverse aree scientifiche, che vanno dalla fisica, chimica biologica e bioorganica alla biologia e la medicina, con applicazioni al miglioramento della qualità della vita, la salute e l&#39;invecchiamento. Competenze multidisciplinari sono necessari per la completa indagine delle molteplici sfaccettature dei processi radicali in ambito biologico e chimico conoscenza svolge un ruolo cruciale nello svelare i processi ei meccanismi di base. Abbiamo sviluppato un approccio di biologia chimica in grado di connettersi gratuitamente reattività radicale chimica con i processi biologici, fornendo informazioni sui percorsi meccanici e prodotti. Il nucleo di questo approccio è la progettazione di modelli biomimetici per studiare il comportamento biomolecola (lipidi, acidi nucleici e proteine) in sistemi acquosi, ottenendo intuizioni della reazione percorsi nonché unas costruire librerie molecolari dei prodotti di reazione radicali liberi. Questo contesto può essere usato con successo per il rilevamento e biomarker esempi sono forniti con due classi di composti: mono-trans isomeri di esteri del colesterolo, che sono sintetizzati e utilizzati come riferimenti per il rilevamento in plasma umano, e purine 5 &#39;,8-ciclo-2 &#39;-deoxyribonucleosides, preparati e utilizzati come riferimento nel protocollo per il rilevamento di tali lesioni in campioni di DNA, dopo radiazioni ionizzanti o ottenuti da diverse condizioni di salute.

Il processo di isomerizzazione è stato descritto in particolare esteri del colesterolo, che offrano le mono-trans isomeri di acidi linoleico e arachidonico mostrati in Figura 1 come i primi prodotti di questo attacco, che possono verificarsi in condizioni di stress radicalico libero nell&#39;ambiente biologico. 5 In figura 3 il meccanismo chimico coinvolto nel cis-trans isomerizzazione doppio legame è mostrato. La fonte radicale è indicata in modo generico di permettersi S-radicali centrati. Nei protocolli descritti la fonte radicale è luce UV che è in grado di rompere homolitically presente SH legame nella molecola RSH tiolo. Figura 4 riassume il protocollo tre fasi per la sintesi della classe lipidi modificati e loro rilevamento nel plasma umano: la sintesi rappresenta un processo biomimetico radicali liberi e fornisce anche un one-pot voce conveniente alla GEOMETisomeri mochimico, senza alcuna contaminazione da parte di isomeri di posizione seguita da protocolli di purificazione e isolamento. Diverse metodologie analitiche possono essere applicate per un rilevamento ad alta sensibilità del contenuto isomero trans e caratterizzazione del mono-trans biblioteca esteri del colesterolo. In particolare, spettroscopia Raman può essere effettuata direttamente sulla frazione esteri del colesterolo senza derivatizzazione (vedere la Figura 2 e la Figura 9). Il secondo esempio riguarda purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deoxyribonucleosides, quali lesioni del DNA creati dall&#39;attacco dei radicali liberi alla posizione C5 &#39;del residuo di zucchero e successiva formazione di un legame covalente tra lo zucchero e la base frazioni. Quattro strutture possono essere prodotti, cioè, 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiadenosina e 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiguanosina, sia esistenti nelle 5&#39;R e 5&#39;S forme diastereomeriche (Figura 5). In figura 6 tmeccanismo di reazione si è mostrato, che coinvolge fotolisi di 8-bromopurine derivati ​​da 5 a dare i corrispondenti C8 radicale 6, che astrae intramolecularly un atomo di idrogeno dalla posizione del C5 &#39;selettivo che offrano le 2&#39;-deoxyadenosin-5&#39;-il radicale 7. 7 radicale subisce ciclizzazione con una velocità costante nell&#39;intervallo 10 5 -10 6 s -1, 2 seguito da ossidazione del radicale eteroaromatico 8 per dare i prodotti finali 9. La reazione dei radicali idrossilici, generato da radiolisi dell&#39;acqua, con 2&#39;-deossiadenosina e 2&#39;-deossiguanosina (10) è stata riscontrata ca. 10% per astrazione di idrogeno dalla posizione C5 &#39;7. Il nostro approccio biologia chimica per le biblioteche di purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deoxyribonucleosides (compresi composti marcati) è illustrato in figura 7, con l&#39;identificazione di queste lesioni in oligonucleotidi come pure in campioni di DNA ottenuti da various fonti quali, ad esempio, trattate in condizioni di radiazioni ionizzanti, come simulare delle condizioni di stress radicali. In figura 8 una apparecchiatura fotoreattore tipico è mostrato. Il dispositivo permette di irradiazione dei composti disciolti nel solvente appropriato. È costituita da: i) la camera di reazione equipaggiato con l&#39;ingresso per il gas inerte (in basso) e due ingressi per l&#39;uscita del gas e per l&#39;aggiunta dei reagenti; ii) una camera interna contenente la lampada a mercurio appropriata collegato ad un sistema di raffreddamento e di energia elettrica, che è inserito nella camera di reazione tramite un giunto di vetro. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> Figura 1. Mono-trans isomeri di linoleato colesterolo e arachidonico. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> Figura 2. Esteri del colesterolo nel siero umano, di analisi e diretto per la mono-trans isomeri mediante spettroscopia Raman. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;aggiunta-eliminazione processo che porta al cis-trans isomerizzazione di doppi legami da radicali thiyl. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Tre passi protocollo per lo sviluppo di mono-trans esteri del colesterolo come biomarker di libero stress radicalico. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. I quattro purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deossiribonucleosidi diastereoisomeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> Figura 6. Generazione di C5 &#39;radicali, sia per fotolisi di 5 o per reazione di 10 con i radicali HO •, e il meccanismo di purine 5&#39; ,8-ciclo-2 &#39;la formazione di deossiribonucleoside. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Protocollo fo l&#39;identificazione di alcuni radicali a base di lesioni del DNA; mtDNA: DNA mitocondriale, nDNA: DNA nucleare. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Reattore fotochimico. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Rappresentante spettro Raman del plasma colesteril estere. Nel riquadro confronto di una regione specifica di colesteril linoleato e colesteril mono-trans isomeri dell&#39;acido linoleico. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="Figura 10" /> Figura 10. Rappresentante analisi GC di FAME ottenuto da plasma esteri del colesterolo. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;strong&gt; Figura 11. Rappresentante HPLC eseguire contenente 2&#39;-deossiadenosina e 2&#39;deoxyguanosine insieme alla loro ossidativo e delle purine 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-deoxyribo nucleosidi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.

I radicali liberi in Chemical Biology: da comportamento chimico a sviluppo Biomarker

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

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Radical Chemistry

Alkene Structure and Reactivity

SCIENTISTS IN ACTION

20.1K Views.  Consiglio Nazionale delle Ricerche. Radicale a base chimica biomimetica è stato applicato alla costruzione-up librerie necessarie per lo sviluppo di biomarker.

Video: Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high surface area microporous materials, such as metal-organic frameworks (MOFs), unique challenges present themselves for PECVD treatments. Herein the protocol for development of a MOF that was previously unstable to humid conditions is presented. The protocol describes the synthesis of Cu-BTC (also known as HKUST-1), the treatment of Cu-BTC with PECVD of perfluoroalkanes, the aging of materials under humid conditions, and the subsequent ammonia microbreakthrough experiments on milligram quantities of microporous materials. Cu-BTC has an extremely high surface area (~1,800 m2/g) when compared to most materials or surfaces that have been previously treated by PECVD methods. Parameters such as chamber pressure and treatment time are extremely important to ensure the perfluoroalkane plasma penetrates to and reacts with the inner MOF surfaces. Furthermore, the protocol for ammonia microbreakthrough experiments set forth here can be utilized for a variety of test gases and microporous materials.

Herein the procedures for plasma enhanced chemical vapor deposition of perfluoroalkanes on microporous materials such as metal-organic frameworks to enhance their stability and hydrophobicity are described. Furthermore, breakthrough testing of milligram quantities of samples is described in detail.

Preparazione del idrofobi Frameworks Metal-Organic tramite Plasma avanzata Chemical Vapor Deposition del perfluoroalcani per la rimozione di ammoniaca

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Un approccio di analisi inversa per la caratterizzazione dei Trasporti Chemical nelle vernici

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Sviluppo di un Backbone ciclico Peptide Biblioteca come potenziale Antiparassitaria Therapeutics Uso Microonde irradiazione

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

Dalle molecole ai materiali: nuovi cristalli liquidi ionici attraverso legame alogeno di ingegneria

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

Preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

One-pot Microwave-assisted Conversion of Anomeric Nitrate-esters to Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate glycosyl donor. Following azido-nitration of a glycal, the product 2-azido-1-nitrate ester can be hydrolyzed under microwave-assisted irradiation. This transformation is usually achieved using strongly nucleophilic reagents and extended reaction times. Microwave irradiation induces hydrolysis, in the absence of reagents, with short reaction times. Following denitration, the intermediate anomeric alcohol is converted, in the same pot, to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate.

A 2-azido-1-nitrate-ester can be converted to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate in a one-pot procedure. The goal of the manuscript is to demonstrate utility of the microwave reactor in carbohydrate synthesis.

One-pot assistita da microonde conversione di anomerica nitrato-esteri Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Costruzione di peptidi elicoidale Via foto-indotta del tiolo-ene/yne Hydrothiolation Thioether/vinile solfuro-tethered

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-base della sintesi proteica Cell-Free: protocolli per la tecnologia della piattaforma robusta, flessibile e accessibile

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...