Questo lavoro è stato sostenuto dal premio NSF # 0920274 e South Carolina Experiment Stazione Project (SC-1700340) per KSS. Questa carta è No. contributo tecnico 5929 della Stazione Clemson Experiment University.

Lo schema generale di questo protocollo è descritto nella Figura 1. 1. Preparazione soluzione per le curve standard e saggi <ol><li> Preparare 100 mL di una mol / L 2 soluzione di idrossilammina-HCl. Pesare 13,9 g di cloridrato di idrossilammina (MW 69,49 g / mol) e si dissolvono in circa 50 ml di acqua distillata, deionizzata (DDH 2 O). Regolare il pH a 7,0 con pellet di idrossido di potassio o di una soluzione concentrata. Portare il volume finale a 100 ml. La soluzione può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di 30 giorni a 4 ° C per un massimo di 90 giorni. </li><li> Preparare 100 ml di una soluzione di cloruro ferrico / soluzione di acido cloridrico. Pesare 13,5 g di cloruro ferrico (PM 270,32 g / mol) e si dissolvono in circa 50 mL DDH 2 O. Aggiungere 41,3 ml di acido cloridrico concentrato (12,1 mol / L) e portare ad un volume finale di 100 mL. La concentrazione finale di cloruro ferrico sarà di 0,5 mol / L e la concentrazione finale di acido cloridrico sarà di 5 mol/ L. La soluzione è conservato a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 100 mL di una mol / L 1,84 soluzione di acido trichoroacetic. Pesare 30,0 g di acido tricloroacetico (MW 163,39 g / mol), si sciolgono in DDH 2 O e portare il volume finale a 100 ml. La soluzione è conservato a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 5 ml di un mol / L di soluzione 0,1 acetil fosfato. Pesare 0,092 g di fosfato acetil (MW 184,06 g / mol), si sciolgono in DDH 2 O e portare il volume finale di 5 ml. Aliquota la soluzione ai tubi da microcentrifuga (0,25 ml per provetta) e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Soluzione scongelati dovrebbero essere immessi sul ghiaccio e può essere utilizzata per circa 1 ora. Soluzione di fosfato acetil che è stato scongelato non deve essere ricongelato e riutilizzati. </li><li> Preparare 5 ml di un mol / 0,1 L soluzione di ADP. Pesare 0,24 g di ADP (MW 472,5 g / mol), si sciolgono in DDH 2 O, e portare il volume finale di 5 ml. Aliquota della soluzione in tubi microcentrifuga (0,5 ml per provetta) e congelare a -20 ° C finouso. Mantenere soluzione scongelati su ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare 50 mL di una mol / L 1 soluzione di Tris. Pesare 6,06 g di Tris (MW 121,14 g / mol), e si sciolgono in 40 ml DDH 2 O. Regolare il pH della soluzione a 7,0 con acido cloridrico e portare il volume finale a 50 ml. Soluzione conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10 mL di una mol / L 1 soluzione di cloruro di magnesio. Pesare 2,03 g di cloruro di magnesio (PM 203,31 g / mol), si sciolgono in DDH 2 O, e portare il volume finale a 10 ml. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 25 mL di soluzione di sviluppo mescolando volumi uguali di cloruro ferrico / soluzione di acido cloridrico e la soluzione di acido tricloroacetico. Soluzione di sviluppo deve essere preparato fresco ogni giorno e conservati a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparazione di una curva standard acetil fosfato <ol><li> Una curva standard acetil fosfato è generato con quantità note di acetil fosfato. Una curva standard da sei a eighpunti di t è adatto. Gli standard deve variare da 0,03 a 0,9 μmoles μmoles per 300 ml, che è correlato alla concentrazione finale da 0,1 a 3 mmol / L. Diluire la soluzione madre acetil fosfato alle concentrazioni appropriate soluzione a 100 mM Tris in un volume finale di 300 ml. Un campione di controllo senza fosfato acetil dovrebbe anche essere preparati. </li><li> Incubare ciascun standard e il controllo a 37 ° C in un blocco di calore per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di cloridrato di idrossilammina per ciascuno standard e il controllo e mescolare agitando tre volte. Posizionare lo standard in un blocco di calore 60 ° C e incubare per cinque minuti. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di sviluppo per gli standard e il controllo, mescolare agitando tre volte, e permettere sviluppare il colore per almeno un minuto a temperatura ambiente. </li><li> Centrifuga tutti gli standard e il controllo in una microcentrifuga a 18.000 xg per 1 minuto. </li><li> Misurare i campioni spettrofotometricamente unot 540 nm utilizzando cuvette 1 ml di plastica, utilizzando il controllo come il bianco per spettrofotometria. </li><li> Generare una curva standard utilizzando appropriate analisi dei dati e software grafici (Kaleidagraph ad esempio, il software Synergy). R 2 valori di 0,99 o superiori sono desiderabili. I dati sono riportati come assorbanza a 540 nm contro μmoles del presente acetil fosfato. </li></ol> 3. Test per l&#39;attività acetato chinasi <ol><li> Utilizzando le soluzioni descritte, preparare una miscela di reazione contenente una concentrazione finale di 0,1 mol / L di tampone Tris, 10 mmol / L di cloruro di magnesio, 5 mmol / L ADP, e 2 mmol / L acetil fosfato. A 10 ml di miscela di reazione richiede 8,2 mL DDH 2 O, 1,0 ml soluzione Tris, 0,1 ml di soluzione di cloruro di magnesio, 0,5 ml di soluzione di ADP, e 0,2 ml di soluzione di fosfato acetil. Distribuire la miscela di reazione in 300 microlitri aliquote ai tubi microcentrifuga. Per la determinazione dei parametri cinetici e di ottimizzazione delle concentrazioni di substrato, un substrato può esserevaria e l&#39;altra presso una concentrazione costante nelle reazioni. </li><li> Pre-incubazione le reazioni per 1 minuto a 37 ° C in un blocco di calore. </li><li> Aggiungere una quantità desiderata di enzima per la reazione e restituire immediatamente il tubo per il 37 ° blocco C di calore. Includono anche una reazione di controllo a cui non enzima viene aggiunto. Se le reazioni sono diverse eseguiti, aggiungere enzima per i tubi ad intervalli di tempo specifici. Assicurati di tenere traccia del tempo. (NOTA: la quantità di enzima da utilizzare dovranno essere ottimizzati per assicurare che tutte le acetil-fosfato o substrato ADP non sarà esaurito - vedi sezione Discussione) </li><li> Dopo 5 minuti, aggiungere 50μl della soluzione di cloridrato di idrossilammina per ogni reazione e il controllo, mescolare, e posto i tubi in un blocco di calore 60 ° C. Se le reazioni sono diverse corso di esecuzione, questo deve essere fatto a l&#39;intervallo di tempo stesso l&#39;enzima è stato aggiunto. </li><li> Incubare le reazioni e il controllo per 5 minuti a 60 ° C. </li><li> Aggiungere 100 &amp;mu, L della soluzione di sviluppo per ogni reazione e il controllo, mescolare, e posto in un rack tubo sul banco di laboratorio. Lasciar sviluppare il colore per almeno 1 minuto. </li><li> Centrifugare tutte le provette in una microcentrifuga a 18.000 xg per 1 minuto. </li><li> Campioni di misura spettrofotometricamente a 540 nm utilizzando cuvette 1 ml di plastica e determinare la quantità di fosfati presenti acetil rispetto alla curva standard di acetil fosfato. </li><li> La quantità di substrato acetil fosfato impoverito può essere determinato sottraendo la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica dalla quantità di acetil-fosfato presenti nel controllo enzima mancante. Effettuare l&#39;analisi dei dati utilizzando i dati e software appropriati grafici (Kaleidagraph ad esempio, il software Synergy). R 2 valori superiori a 0,97 sono desiderabili. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Lo scopo di questo saggio è quello di misurare l&#39;attività chinasi di acetato in direttaione della formazione di acetato. Questo viene fatto attraverso la misurazione del consumo del substrato acetil fosfato, in quanto non vi è facile, la misura diretta per la produzione di acetato. Acetil fosfato che rimane dopo un certo tempo durante la reazione enzimatica viene convertito in acetil hydroxamate e, successivamente, al complesso hydroxamate di ferro, che ha un colore rossastro (Figura 2) che può essere misurato a 540 nm. La curva standard tracciando assorbanza contro μmoles acetil fosfato presenti nelle norme viene utilizzato per determinare la quantità di fosfato acetil rimanente in ogni reazione. La curva standard deve essere lineare attraverso il punto zero. Una curva rappresentativa di serie mostrato in Figura 3 ha una pendenza di 1,2332 unità di assorbanza per μmole presenti acetil fosfato e di un valore 2 R di 0,99, indicando i dati approssima l&#39;equazione lineare bene. L&#39;equazione per la misura lineare ai dati curva standard viene utilizzato per calcolare la quantità di fosfato acetil rimasti nella reazione. Il μmolesdi fosfato acetil consumato è determinato come differenza tra il μmoles di acetil fosfato presenti nella reazione di controllo carente dell&#39;enzima e la μmoles di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica. Purificato, ricombinante M. chinasi acetato thermophila è stato analizzato utilizzando il protocollo descritto. Per l&#39;esperimento mostrato nella Figura 4, la concentrazione di ADP si è tenuta costante a 5 mmol / L e la concentrazione di fosfato acetil nella reazione è stata variata per determinare la m K per l&#39;acetil fosfato. Come previsto, questo esperimento dimostra che l&#39;enzima segue standard di Michaelis-Menten-come cinetica per ogni substrato e prodotto una curva iperbolica di saturazione durante la stampa in funzione della concentrazione di attività acetil fosfato. L&#39;apparente K valore m per acetil fosfato è stata di 0,27 ± 0,01 mmol / L, che confronta favorevolmente alla pubblicazione valore K m di 0,47 ± 0,01 mmol / L utilizzando l&#39;accoppiata comedire 13. Il test diretto può essere utilizzato anche per misurare l&#39;attività delle chinasi acetato che utilizzano supporti diversi da ATP, che non è possibile con il test standard di accoppiamento. Ricombinante purificata E. histolytica acetato chinasi 16, che produce i PP piuttosto che ATP in acetato che formano la direzione, è stato sottoposto a questo test utilizzando fosfato di sodio al posto di ADP. La concentrazione di fosfato di sodio nella reazione si è tenuta costante a 0,2 mol / L e la concentrazione di fosfati acetil è stato variato. Per quanto riguarda il M. thermophila chinasi acetato, la E. chinasi acetato histolytica seguito Michaelis-Menten-come cinetica per acetil fosfato e una curva di saturazione iperbolica è stato osservato (Figura 5). L&#39;apparente K valore m per acetil fosfato è stato 0,50 ± 0,006 mmol / L. Reeves e Guthrie 15 ha determinato un valore di K m di 0,06 mmol / L per fosfato acetil per l&#39;enzima nativo; come<html> mai, il loro enzima è stato solo parzialmente purificato e la loro analisi coinvolti quattro enzimi di accoppiamento che erano anche solo parzialmente purificato. Così, è difficile confrontare direttamente questi valori. Schema di protocollo <ol><li> Generare una curva standard acetil fosfato </li><li> Diluire enzima alla concentrazione desiderata </li><li> Preparare la miscela di reazione e aliquota 300 ml per tubi da microcentrifuga </li><li> Reazioni Preincubare a 37 ° C per 1 minuto </li><li> Avviare le reazioni con l&#39;aggiunta di enzimi ad intervalli di tempo specifici </li><li> Aggiungi idrossilammina agli stessi intervalli di fermare le reazioni ed incubare a 60 ° C per 5 minuti </li><li> Aggiungi cloruro ferrico / soluzione di acido tricloroacetico per lo sviluppo del colore </li><li> Centrifugare i tubi a 18.000 xg per 1 minuto </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 540 nm </li><li> Determinare la quantità di fosfato acetil consumato dal confronto con la curva standard </li></ol>tp_upload/3474/3474fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Protocollo Scheme <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig2.jpg" /> Figura 2. Standard acetil fosfato. Concentrazioni crescenti di fosfato sono stati acetil reagito con idrossilammina e il colore è stato sviluppato come descritto. Il controllo manca acetil fosfato è giallo brillante, e le reazioni contenenti quantità crescenti di acetil-fosfato sono successivamente di colore più scuro. Questo cambiamento di colore è misurato a 540 nm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig3.jpg" /> Figura 3. Esempio di curva standard acetil fosfato. Quantità variabili di acetil-fosfato sono stati reagito con idrossilammina e la soluzione di sviluppo del colore e assorbanza è stata misurata a 540 nm. L&#39;assorbanza a 540 nm contro μmoles acetil fosfato è stato tracciato e una misura lineare ai dati è stato applicato. &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig4.jpg" /> Figura 4. Utilizzo di fosfato acetil dalla ATP-produzione M. thermophila acetato chinasi. Attività enzimatica è stata determinata nella direzione della formazione di acetato in presenza di 5 mmol / L ADP con concentrazioni variabili di acetil fosfato. La quantità di fosfato consumato acetile è stato determinato come differenza tra l&#39;importo iniziale di acetil-fosfato nella reazione e la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia con barre di errore visualizzato. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3474/3474fig5.jpg" /> Figura 5. Utilizzo di fosfato acetil dal PP i produttori di E. histolytica acetato chinasi. Attività enzimatica in direzione della formazione di acetato è stato determinato in presenza di 0.2 mol / L di fosfato di sodio, con concentrazioni variabili di acetil fosfato. La quantità di fosfato consumato acetile è stato determinato come differenza tra l&#39;importo iniziale di acetil-fosfato nella reazione e la quantità di acetil-fosfato che rimane dopo la reazione enzimatica. I saggi sono stati eseguiti in triplice copia con barre di errore visualizzato.

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	<li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ATPase+domain+common+to+prokaryotic+cell+cycle+proteins,+sugar+kinases,+actin,+and+hsp70+heat+shock+proteins.">An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).</li><li>Bork, P., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+evolution+of+similar+enzymatic+function+on+different+protein+folds:+the+hexokinase,+ribokinase,+and+galactokinase+families+of+sugar+kinases.">Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases.</a> Protein Sci. 2, 31-40 (1993).</li><li>Buss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urkinase:+structure+of+acetate+kinase,+a+member+of+the+ASKHA+superfamily+of+phosphotransferases.">Urkinase: structure of acetate kinase, a member of the ASKHA superfamily of phosphotransferases.</a> J. Bacteriol. 183, 680-686 (2001).</li><li>Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sugar+kinase/heat+shock+protein+70/actin+superfamily:+implications+of+conserved+structure+for+mechanism.">The sugar kinase/heat shock protein 70/actin superfamily: implications of conserved structure for mechanism.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25, 137-162 (1996).</li><li>Holmes, K. C., Sander, C., Valencia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+ATP-binding+fold+in+actin,+hexokinase+and+Hsc70.">A new ATP-binding fold in actin, hexokinase and Hsc70.</a> Trends. Cell. Biol. 3, 53-59 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+sequence+analysis,+and+hyperexpression+of+the+genes+encoding+phosphotransacetylase+and+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Cloning, sequence analysis, and hyperexpression of the genes encoding phosphotransacetylase and acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Bacteriol. 175, 6822-6829 (1993).</li><li>Ingram-Smith, C., Barber, R. D., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+histidines+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">The role of histidines in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 275, 33765-33770 (2000).</li><li>Miles, R. D., Iyer, P. P., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutational+analysis+of+active+site+residues+in+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Site-directed mutational analysis of active site residues in the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 276, 45059-45064 (2001).</li><li>Miles, R. D., Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+transition+state+analog,+MgADP-aluminum+fluoride-acetate,+in+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Evidence for a transition state analog, MgADP-aluminum fluoride-acetate, in acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 277, 22547-22552 (2002).</li><li>Ingram-Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+acetate+binding+pocket+in+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase.">Characterization of the acetate binding pocket in the Methanosarcina thermophila acetate kinase.</a> J. Bacteriol. 187, 2386-2394 (2005).</li><li>Gorrell, A., Lawrence, S. H., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+kinetic+analyses+of+arginine+residues+in+the+active+site+of+the+acetate+kinase+from+Methanosarcina+thermophila.">Structural and kinetic analyses of arginine residues in the active site of the acetate kinase from Methanosarcina thermophila.</a> J. Biol. Chem. 280, 10731-10742 (2005).</li><li>Gorrell, A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+Methanosarcina+thermophila+acetate+kinase+mechanism+by+fluorescence+quenching.">Investigation of the Methanosarcina thermophila acetate kinase mechanism by fluorescence quenching.</a> Biochemistry. 46, 14170-14176 (2007).</li><li>Reeves, R. E., Guthrie, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase+(pyrophosphate).+A+fourth+pyrophosphate-dependent+kinase+from+Entamoeba+histolytica.">Acetate kinase (pyrophosphate). A fourth pyrophosphate-dependent kinase from Entamoeba histolytica.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 66, 1389-1395 (1975).</li><li>Fowler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+and+structural+characterization+of+the+novel+PPi-dependent+acetate+kinase+from+the+parasite+Entamoeba+histolytica.">Kinetic and structural characterization of the novel PPi-dependent acetate kinase from the parasite Entamoeba histolytica.</a> , (2011).</li><li>Lipmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+synthesis+of+acetyl+phosphate.">Enzymatic synthesis of acetyl phosphate.</a> J. Biol. Chem. 155, 55-70 (1944).</li><li>Lipmann, F., Tuttle, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+micromethod+for+determination+of+acyl+phosphates.">A specific micromethod for determination of acyl phosphates.</a> J. Biol. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+enzymes+involved+in+the+proponic+acid+fermentation.">Purification and properties of enzymes involved in the proponic acid fermentation.</a> Journal of Bacteriology. 87, 171-187 (1964).</li><li>Clarke, P. M., Payton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzymatic+assay+for+acetate+in+spent+bacterial+culture+supernatants.">An enzymatic assay for acetate in spent bacterial culture supernatants.</a> Anal. Biochem. 130, 402-405 (1983).</li><li>Mukhopadhyay, S., Hasson, M. S., Sanders, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+assay+of+acetate+kinase+activity:+measurement+of+inorganic+phosphate+release+generated+by+hydroxylaminolysis+of+acetyl+phosphate.">A continuous assay of acetate kinase activity: measurement of inorganic phosphate release generated by hydroxylaminolysis of acetyl phosphate.</a> Bioorg. Chem. 36, 65-69 (2008).</li><li>Nakajima, H., Suzuki, K., Imahori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+acetate+kinase+from+Bacillus+stearothermophilus.">Purification and properties of acetate kinase from Bacillus stearothermophilus.</a> J. Biochem. 84, 193-203 (1978).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il rilevamento di fosfato di acetile in questo saggio dipende da una concentrazione sufficiente di cloridrato di idrossilammina e la concentrazione e l&#39;acidità della soluzione di cloruro ferrico. Alterazione del volume test richiederà riconsiderazione di entrambi questi componenti. Le reazioni enzimatiche qui descritti sono stati eseguiti a 37 ° C con la cessazione idrossilammina eseguita a 60 ° C per 5 minuti. Questa temperatura più alta è fondamentale per consentire la rapida conversione del restante acetil ...

<table border="1"><tr><td width="160"> Nome del reagente </td><td width="108"> Azienda </td><td width="134"> Numero di catalogo </td><td width="103"> Commenti </td></tr><tr><td> Acetil fosfato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 01409 </td><td> Sale di litio (97%) </td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico (disidratazione) </td><td> ThermoFisher </td><td> S381 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico (anidro) </td><td> ThermoFisher </td><td> S374 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio (esaidrato) </td><td> ThermoFisher </td><td> M33 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> ThermoFisher </td><td> B152 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro ferrico (esaidrato) </td><td> ThermoFisher </td><td> I88 </td><td></td></tr><tr><td> Acido tricloroacetico </td><td> ThermoFisher </td><td> A324 </td><td></td></tr><tr><td> Idrossilammina cloridrato </td><td> ThermoFisher </td><td> H330 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina 5&#39;-difosfato sale di sodio </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2754 </td><td></td></tr><tr><td> BIOMATE III Spettrofotometro </td><td> ThermoFisher </td><td> 142982082 </td><td> Standard di UV / Vis spettrofotometro </td></tr></table>

direct detection of the acetate-forming activity  of the enzyme acetate kinase

Chinasi acetato, un membro della acetato e zucchero chinasi-Hsp70-actina (ASKHA) superfamiglia degli enzimi 1-5, è responsabile della fosforilazione reversibile tra acetato e fosfato acetil utilizzando ATP come substrato. Chinasi acetato sono onnipresenti nei batteri, che si trova in un genere di Archaea, e sono presenti anche nei microbi del Eukarya 6. Le chinasi acetato più ben caratterizzato è che dal metano che producono archaeon Methanosarcina thermophila 7-14. Un acetato chinasi che può utilizzare solo i PP ma non ATP in direzione della acetil-fosfato formano è stato isolato da Entamoeba histolytica, l&#39;agente eziologico della dissenteria amebica, e finora state trovate solo in questo genere 15,16. In direzione della formazione di acetil-fosfato, acetato chinasi attività è in genere misurata mediante il test hydroxamate, in primo luogo descritto da Lipmann17-20, un test accoppiato in cui è accoppiato conversione di ATP in ADP all&#39;ossidazione del NADH a NAD + dal piruvato chinasi enzimi e lattico deidrogenasi 21,22, o un saggio di misurazione rilascio di fosfato inorganico dopo la reazione del prodotto acetil fosfato con idrossilammina 23. L&#39;attività in senso opposto, acetato di formazione direzione si misura con accoppiamento formazione di ATP da ADP alla riduzione del NADP + a NADPH dagli enzimi esochinasi e glucosio-6-fosfato deidrogenasi 24. Qui si descrive un metodo per l&#39;individuazione di attività chinasi acetato nella direzione della formazione di acetato che non richiede enzimi di accoppiamento, ma è invece basato sulla determinazione diretta del consumo di acetil fosfato. Dopo la reazione enzimatica, rimanendo acetil-fosfato viene convertito in un complesso hydroxamate ferrico che può essere misurato spettrofotometricamente, come per il test hydroxamate. Così, a differenza del stANDARD test accoppiato per questa direzione che dipende dalla produzione di ATP da ADP, questo saggio diretto può essere utilizzato per chinasi acetato che producono ATP o PP i.

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Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Un metodo per la determinazione dell&#39;attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l&#39;attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

direct-detection-acetate-forming-activity-enzyme-acetate

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K Views.  Clemson University. Un metodo per la determinazione dell'attività acetato chinasi è descritto. Questo test utilizza una reazione diretta per determinare l'attività enzimatica e la cinetica di acetato chinasi in acetato che formano direzione con diversi accettori fosforil. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per il saggio altro acetil fosfato o acetil-CoA che utilizzano enzimi.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Ricerca

Biologia

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous mycotoxins in food commodities. In this protocol we show how to fabricate and interrogate an electrochemical competitive Enzyme linked immunomagnetic assay based on the use of magnetic beads as solid support for the immunochemical chain3 and screen printed electrodes as sensing platform.
Our method aims to determine the total amount of HT-2 and T-2 toxins, mycotoxins belonging to the trichothecenes family and of great concern for human health4. The use of an antibody clone with a cross reactivity of 100% towards HT-2 and T-2 allows to simultaneously detect both toxins with similar sensitivity5.
The first step of our assay is the coating step where we immobilize HT2-KLH conjugate toxin on the surface of magnetic beads. After a blocking step, necessary to avoid non-specific absorptions, the addition of a monoclonal antibody allows the competition between immobilized HT-2 and free HT-2 or T-2 present in the sample or dissolved in a standard solution.
At the end of the competition step, the amount of monoclonal antibody linked to the immobilized HT-2 will be inversely proportional to the amount of toxin in the sample solution.
A secondary antibody labeled with alkaline phosphatase (AP) is used to reveal the binding between the specific antibody and the immobilized HT-2. The final measurement step is performed by dropping an aliquot of magnetic bead suspension, corresponding to a specific sample/standard solution, on the surface of a screen-printed working electrode; magnetic beads are immobilized and concentrated by means of a magnet placed precisely under the screen-printed electrode. After two minutes of incubation between magnetic beads and a substrate for AP, the enzymatic product is detected by Differential Pulse Voltammetry (DPV) using a portable instrument (PalmSens) also able to initiate automatically eight measurements within an interval of few seconds.

ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

A protocol to detect trichothecenes (mycotoxins of concern for human health) using a newly developed screening method based on a competitive immunochemical method and a final electrochemical detection is demonstrated.

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later stages of embryonic development, and to define how enhancers and promoters regulate gene expression within the embryo. The protocol demonstrated here can be used to efficiently produce transgenic Xenopus laevis embryos. This transgenesis approach involves three parts: 1. Sperm nuclei are isolated from adult X. laevis testis by treatment with lysolecithin, which permeabilizes the sperm plasma membrane. 2. Egg extract is prepared by low speed centrifugation, addition of calcium to cause the extract to progress to interphase of the cell cycle, and a high-speed centrifugation to isolate interphase cytosol. 3. Nuclear transplantation: the nuclei and extract are combined with the linearized plasmid DNA to be introduced as the transgene and a small amount of restriction enzyme. During a short reaction, egg extract partially decondenses the sperm chromatin and the restriction enzyme generates chromosomal breaks that promote recombination of the transgene into the genome. The treated sperm nuclei are then transplanted into unfertilized eggs. Integration of the transgene usually occurs prior to the first embryonic cleavage such that the resulting embryos are not chimeric. These embryos can be analyzed without any need to breed to the next generation, allowing for efficient and rapid generation of transgenic embryos for analyses of promoter and gene function. Adult X. laevis resulting from this procedure also propagate the transgene through the germline and can be used to generate lines of transgenic animals for multiple purposes.

Production of Transgenic Xenopus laevis by Restriction Enzyme Mediated Integration and Nuclear Transplantation

This video protocol demonstrates a method for generating transgenic Xenopus laevis by introduction of transgenes into sperm nuclei followed by nuclear transplantation into unfertilized eggs.

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Stable integration of cloned gene products into the Xenopus genome is necessary to control the time and place of expression, to express genes at later ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

Rilevamento di ossido nitrico e anione superossido radicale da spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica da cellule con Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. Current strategies for microbial analysis include both traditional laboratory culture-dependent techniques and those based on direct extraction and determination of certain biomarkers1, 2. Few among the diversity of microbial species inhabiting soil can be cultured, so culture-dependent methods introduce significant biases, a limitation absent in biomarker analysis.
The glucosamine, mannosamine, galactosamine and muramic acid have been well served as measures of both the living and dead microbial mass, of these the glucosamine (most abundant) and muramic acid (uniquely from bacterial cell) are most important constituents in the soil systems3, 4. However, the lack of knowledge on the analysis restricts the wide popularization among scientific peers. Among all existing analytical methods, derivatization to aldononitrile acetates followed by GC-based analysis has emerged as a good option with respect to optimally balancing precision, sensitivity, simplicity, good chromatographic separation, and stability upon sample storage5.
Here, we present a detailed protocol for a reliable and relatively simple analysis of glucosamine and muramic acid from soil after their conversion to aldononitrile acetates. The protocol mainly comprises four steps: acid digestion, sample purification, derivatization and GC determination. The step-by-step procedure is modified according to former publications6, 7. In addition, we present a strategy to structurally validate the molecular ion of the derivative and its ion fragments formed upon electron ionization. We applied GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS and isotopically labeled reagents to determine the molecular weight of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid; we used the mass shift of isotope-labeled derivatives in the ion spectrum to investigate ion fragments of each derivatives8. In addition to the theoretical elucidation, the validation of molecular ion of the derivative and its ion fragments will be useful to researchers using &delta;13C or ion fragments of these biomarkers in biogeochemical studies9, 10.

We describe a method protocol for the GC-based analysis of the aldonitrile acetate derivatives of glucosamine and muramic acid extracted from soil. For elucidation of the chemical mechanism, we also present a strategy to confirm the structure of the derivative and the ion fragments formed upon electron ionization.

GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Studying the Activity of Neuropeptides and Other Regulators of the Excretory System in the Adult Mosquito

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the foundation to develop novel strategies for pest control. Here, a series of methods are described that are routinely utilized to determine the functional roles of neuropeptides and other neuronal factors (i.e., biogenic amines) on the excretory system of the mosquito, Aedes aegypti. The Malpighian tubules (MTs), responsible for primary urine formation, can continue functioning for hours when removed from the mosquito, allowing for fluid secretion measurements following hormone treatments. As such, the Ramsay assay is a useful technique to measure secretion rates from isolated MTs. Ion-selective microelectrodes (ISME) can sequentially be used to measure ion concentrations (i.e., Na+ and K+) in the secreted fluid. This assay allows for the measurement of several MTs at a given time, determining the effects of various hormones and drugs. The Scanning Ion-selective Electrode Technique uses ISME to measure voltage representative of ionic activity in the unstirred layer adjacent to the surface of ion transporting organs to determine transepithelial transport of ions in near real time. This method can be used to understand the role of hormones and other regulators on ion absorption or secretion across epithelia. Hindgut contraction assays are also a useful tool to characterize myoactive neuropeptides, that may enhance or reduce the ability of this organ to remove excess fluid and waste. Collectively, these methods provide insight into how the excretory system is regulated in adult mosquitoes. This is important because functional coordination of the excretory organs is crucial in overcoming challenges such as desiccation stress after eclosion and before finding a suitable vertebrate host to obtain a bloodmeal.

This protocol outlines methodologies behind the Ramsay assay, ion-selective microelectrodes, Scanning Ion-selective Electrode Technique (SIET) and in vitro contraction assays, applied to study the adult mosquito excretory system, comprised of the Malpighian tubules and hindgut, to collectively measure ion and fluid secretion rates, contractile activity, and transepithelial ion transport.

Studiare l'attività dei neuropeptidi e di altri regolatori del sistema escretore nella zanzara adulta

Studies of insect physiology, particularly in those species that are vectors of pathogens causing disease in humans and other vertebrates, provide the ...