Autori desiderano ringraziare Nancy Downer e tutti i membri del laboratorio di Chimica Analitica, Università di Roma &quot;Tor Vergata&quot; per la loro collaborazione e supporto logistico. Questo lavoro è stato supportato dal progetto UE &quot;Biocop&quot;.

1) Il blocco rivestito sfere magnetiche: Procedere come segue per bloccare patinata sfere magnetiche: <ol><li> Preparare una serie di tubi Eppendorf da 2 ml; </li><li> Omogeneizzare (agitazione, ma non vortex) rivestito sfere magnetiche (si veda l&#39;appendice per la preparazione di carta patinata sfere magnetiche) con il campione di rotazione mixer; </li><li> Immediatamente dopo omogeneizzazione, pipettare 10 ml di rivestimento sfere magnetiche in ogni tubi separati Eppendorf; </li><li> Aggiungere 1 ml di latte scremato blocco soluzione in ciascuna provetta Eppendorf del set; </li><li> Lasciate sfere magnetiche incubare per 30 minuti a temperatura ambiente sul mixer campione rotante; </li><li> Rimuovere il blocco soluzione: farlo posto il tubo di concentratore di particelle magnetiche con la parte magnetica messo su per 2 min (vedere sfere magnetiche attaccare sulla parete laterale del tubo); pipetta con attenzione il sopranatante, lasciando indisturbato perline; </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone PBS + NaN 3 + BSA come soluzione di storage per ogni tubo; </li><li> Conservare patinata e bloccato sfere magnetiche a 4 ° C (si noti che rivestiti sfere magnetiche sono stabili per almeno 2 mesi a 4 ° C); </li></ol> 2) catena immunologici su sfere magnetiche per la costruzione della curva di calibrazione e analisi dei campioni Procedere come segue per avere sfere magnetiche pronte per la misura: <ol><li> Prendete un tubo Eppendorf (2 ml) di soluzione rivestito e bloccati per ogni campione che si sta per analizzare; </li><li> Prendete un tubo Eppendorf in più per ogni soluzione calibrante di lavoro; </li><li> Omogeneizzare sfere magnetiche per 2 minuti sul mixer campione rotanti prima dell&#39;uso; </li><li> Rimuovere il liquido di storage utilizzando concentratore magnetico delle particelle; </li><li> Lavare le sfere magnetiche tre volte con PBS / BSA soluzione di lavaggio. Rimuovere il liquido di lavaggio; </li><li> Passo concorso: Aggiungere per ogni tubo contenente le sfere magnetiche lavate, 200μl di campione preparato, utilizzare un tubo perla magnetica per ogni campione. Ripetete la stessa procedura per ogni soluzione standard. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di anticorpo monoclonale ad ogni provetta perla magnetica. Lasciate sfere magnetiche incubare per mezz&#39;ora sul mixer campione rotante a temperatura ambiente; </li><li> Rimuovere dai tubi Eppendorf la soluzione utilizzata per la concorrenza-passo; </li><li> Etichettatura passo: Aggiungere 400μl di anticorpo secondario ad ogni magnetico tubo Eppendorf tallone. Lasciate sfere magnetiche incubare per mezz&#39;ora sul mixer campione rotante a temperatura ambiente; </li><li> Rimuovere l&#39;etichettatura soluzione da tubi Eppendorf; </li><li> Lavare le sfere magnetiche tre volte con PBS / Tween ® 20 soluzione di lavaggio. Asportare il liquido; </li><li> Risospendere con 100μl di tampone DEA ciascuna aliquota di sfere magnetiche. Ora le sfere magnetiche sono pronti per il passo di misura elettrochimica; </li></ol> 3) Assemblea dei PalmSens con Multiplexer (Mux) Opzioni Si prega di notare: prodotto di idrolisi enzimatica del substrato falli la superficie dell&#39;elettrodo, per questo motivo un nuovo elettrodo è necessario per ogni misurazione. <ol><li> Collegare un PC portatile per PalmSens attraverso il cavo seriale; </li><li> Collegare il 9-connettore DIN di CH8 Multiplexer con PalmSens. </li><li> Collegare il cavo seriale del canale Mux Otto contatto elettrico con CH8 Multiplexer; </li><li> Luogo striscia elettrodo sul blocco magnete otto. Prestare attenzione al luogo in ogni magnete sotto ogni elettrodi di lavoro (di nota, la necessità di un magnete unico per ogni elettrodo è indispensabile altrimenti la particella magnetica non sarà concentrata sulla superficie degli elettrodi di lavoro); </li><li> Collegare striscia elettrodi in otto contatto canale Mux elettrici; </li></ol> Per la misurazione DPV utilizzare i seguenti parametri nelle caselle appropriate: E comincia: 0 (V); fine E: 0,6 (V); passo E: 0,016 (V); E impulso: 0,0339 (V); E condizionata: Velocità di scansione;:: 0 (V) 0 (V) E deposizione : 0,1 (V / s); T impulso: 0,06 (s); condizionata T: 0 (s); deposizione T: 0 (s); equilibrio T: 8 (s). 4) reazione enzimatica ed elettrochimica di misura <ol><li> Omogeneizzare agitando delicatamente ogni tubo Eppendorf contenente microsfere magnetiche pronte per il passo di misura elettrochimiche in modo da ottenere una sospensione e dispersi di grani magnetici; </li><li> Pipetta da ogni Eppendorf, subito dopo omogeneizzazione, una aliquota di 20 microlitri della dispersione magnetica tallone sulla superficie dell&#39;elettrodo di lavoro corrispondente. Per ogni elettrodo di un uso striscia 20 l di sfere magnetiche presi da diverse provette Eppendorf (ad esempio l&#39;uso di elettrodi per otto otto diversi Eppendorf); </li><li> Aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul primo elettrodo. Start 2 min il conto alla rovescia. Dopo 14 secondi, aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul secondo elettrodo. Dopo altri 14 secondi, aggiungere 80 ml di soluzione di substrato enzimatico sul terzo elettrodo. Procedere al tempo stesso interval (14 secondi) fino all&#39;ultimo l&#39;elettrodo (che significa: ogni goccia aliquota del substrato con intervalli di 14 sec). L&#39;intervallo di tempo di 14 sec è calcolato come il tempo richiesto dalla potenziostato per eseguire la misura; di nota, le 80 ul di soluzione per ogni sensore dovrebbe coprire l&#39;elettrodo di lavoro di riferimento e contatore. Inoltre, le soluzioni per ogni sensore non deve venire in contatto con le soluzioni di elettrodi vicini. </li><li> Dopo il conto alla rovescia 2 min dalla prima aggiunta della soluzione di substrato enzimatico, avviare la misurazione elettrochimica; </li><li> Utilizzare il PalmSens Lite software per ottenere i picchi di corrente (mA) per ogni soluzione. </li></ol> 5) Calcolo Costruire una curva di calibrazione utilizzando una equazione logistica 4 parametri e calcolare la concentrazione del totale HT-2/T-2 quantità di tossine in nanogrammi per millilitro per ogni tubo Eppendorf contenente campione incognito. I dati sperimentali, altezza del picco (mA) contro la concentrazione dei calibratori (ng / ml), devono essere montati con un non-lineare a quattro parametri logistici (4-PL) plot equazione (1) (utilizzando Plot Sigma 8.0 o Kaleidagraph). Il non lineare 4-PL modello è di solito adottato per descrivere ligando saggi vincolanti (LBA) 6. <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq1.jpg" alt="Equazione 1" /> (1) a, b, x0, y0 sono parametri logistici come indicato dal programma Sigma Plot forma curva. Utilizzare la formula per calcolare esplicitato il contenuto di tossina HT-2/T-2 quantità totale presente nella soluzione diluita campione <img src="/files/ftp_upload/1588/1588eq2.jpg" alt="Equazione 2" /> (2) x è la concentrazione di massa della quantità totale di HT-2/T-2 tossine nella soluzione di estratto diluito, calcolato dalla equazione logistica 4 parametri in nanogrammi per milliltre (ng / ml) y è il valore corrente in μA ottenuti per il campione sconosciuto Appendice 6) rivestito sfere magnetiche Procedere come segue per avere rivestito sfere magnetiche: Procedura di lavaggio <ol><li> Omogeneizzare Dynabeads tosylactivated ® M-280 (magazzino soluzione 2 x 109 perline / ml), agitando e vortex (velocità max) per 1 min (evitare la formazione di schiuma) (notare la concentrazione di sfere magnetiche deve essere sempre lo stesso per garantire la riproducibilità in la misura); </li><li> Immediatamente pipetta 1 ml di perline sopra omogeneizzato in una provetta Eppendorf da 2 ml; </li><li> Porre il tubo in concentratore di particelle magnetiche con la parte magnetica messo su per 2 min (vedere sfere magnetiche attaccare sulla parete laterale del tubo); </li><li> Con attenzione pipetta il sopranatante, lasciando indisturbato perline; </li><li> Togliere la provetta Eppendorf da concentratore di particelle magnetiche e risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M tampone borato pH 9.5. Mescolare delicatamente per 2 minuti nel mixer campione rotante per 2 minuti; </li><li> Pipetta il sopranatante; </li><li> Pipettare 1 ml di soluzione tampone borato nel tubo Eppendorf. Biglie magnetiche sono ora pronti per la fase di rivestimento; </li></ol> Procedura di rivestimento <ol start="8"><li> Aggiungere 600 ml di HT-2, coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella), soluzione madre di 1 ml di perline magnetiche) (finale HT-2-KLH concentrazione di 375 mg / ml); incubare sfere magnetiche e HT-2-KLH soluzione per 20h a 37 ° C * con rotazione lenta inclinazione sulla rotazione mixer campione; </li><li> Dopo luogo di incubazione del tubo nel concentratore di particelle magnetiche e pipetta il sopranatante; Lavare perline ricoperto due volte con 1 ml di PBS / BSA soluzione tampone. Tra ogni lavaggio rimuovere PBS / BSA soluzione. Tutti fase di lavaggio sono state effettuate impostando sfere magnetiche e PBS / BSA in un miscelatore rotante per 5 minuti; </li><li> Lavare sfere magnetiche, una volta con 1 ml di TRIS / BSA soluzione tampone. Rimuovere TRIS / soluzione BSA. Effettuare questa operazione impostando sfere magnetiche e TRIS / BSA tampone sulla rotazione mixer per 4 ore a 37 ° C *; </li><li> Lavare sfere magnetiche, una volta con 1 ml di aggiornare (conservato in frigorifero a 4 ° C) PBS / BSA soluzione tampone. Rimuovere PBS / BSA soluzione. Eseguire questo passo impostazione sfere magnetiche e PBS / BSA tampone sulla rotazione mixer per 5 minuti a temperatura ambiente; </li><li> Dopo il lavaggio passo rimuovere tutto il liquido di lavaggio e aggiungere 1 ml di tampone PBS + NaN 3 + BSA come liquido di stoccaggio; </li><li> Conservare rivestito sfere magnetiche a 4 ° C (si noti che rivestiti sfere magnetiche sono stabili per almeno 2 mesi a 4 ° C); </li></ol> * A tal fine il miscelatore è posto in forno dotato di un foro che permette l&#39;inserimento del cavo per l&#39;alimentazione. In alternativa, il mixer può essere inserito in una camera termostatata a 37 ° C. 7) Preparazione dei campioni e l&#39;estrazione 25 g di campione macinato finemente (per bambini cereali alimentari o prima colazione) siamoighed in un vaso frullatore ed estratti con 100 ml di acetonitrile / soluzione acquosa (86/14) per 3 minuti in un frullatore ad alta velocità. Dopo centrifugazione a 4000 giri (3000 g) per 5 minuti, 8 ml di surnatante sono state prese e purificata con colonna Mycosep, 4 ml di estratto sono stati puliti essiccato sotto flusso di azoto. Campioni essiccati possono essere conservati a -30 ° C fino a diversi mesi. 8) la ricostituzione del campione Cereali per la colazione Ricostituire l&#39;estratto secco di cereali prima colazione (alimentari a base di cereali destinati al consumo degli adulti) con 40 ml di PBS pH 7,4. In questo modo, un campione con una concentrazione di tossina pari al limite legale supposta (200 ng / g), si cede il passo misura un segnale cade nel mezzo del campo di lavoro. Alimenti per bambini Ricostituire il cibo secco estratto per l&#39;infanzia (alimenti a base di cereali destinati al consumo infantile) con 4 ml di PBS. In questo modo, un campione con una concentrazione di tossine pari al limite legale presunta (20-25 ng / g), si cede il passo misura un segnale cade nel mezzo del campo di lavoro.

<ol>
	<li>Koch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+of+trichothecenes+analysis.">State of the art of trichothecenes analysis.</a> Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).</li><li>Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+the+analysis+of+type-A+and-B+trichothecene+mycotoxins+in+cereals.">State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals.</a> Fresenius J. Anal. Chem. 371, 285-299 (2001).</li><li>Morozova, T. Y., Morozov, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+differentiation+in+recognition+of+cross-reactive+antigens+by+magnetic+beads.">Force differentiation in recognition of cross-reactive antigens by magnetic beads.</a> Anal. Biochem. , 263-271 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAO+Food+and+Nutrition+Paper+74.">FAO Food and Nutrition Paper 74.</a> JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES Fifty-sixth meeting. , 115 (2001).</li><li>Piermarini, S., Volpe, G., Ricci, F., Micheli, L., Moscone, D., Palleschi, G., Fuhrer, M., Krska, R., Baumgartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Screening+Electrochemical+Methods+for+Aflatoxin+B1+and+Type-A+Trichothecenes:+a+preliminary+study.">Rapid Screening Electrochemical Methods for Aflatoxin B1 and Type-A Trichothecenes: a preliminary study.</a> Anal. Lett. 40, 1333-1346 (2007).</li><li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays.">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li><li>Ricci, F., Volpe, G., Micheli, l., Palleschi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+novel+developments+and+applications+of+immunosensors+in+food+analysis.">A review on novel developments and applications of immunosensors in food analysis.</a> Anal. Chim. Acta. 605 (2), 111-129 (2007).</li></ol>

L&#39;uso di anticorpi come sonde biomolecolari riconoscimento ha visto un ampio utilizzo di tecnologie di rilevamento, metodologie di rilevazione immunochimica, quali ELISA e MEIAs, sono, al giorno d&#39;oggi, tra le piattaforme più utilizzate e applicate in molti laboratori 7. Anche se questi approcci raggiungere una sensibilità eccezionale e specificità, un obiettivo primario di molti gruppi di ricerca negli ultimi anni è stato il miglioramento e l&#39;ottimizzazione delle ...

Reagenti <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td></td></tr><tr><td> Idrogeno fosfato disodico </td><td> Sigma </td><td> S3264 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl2 anidro </td><td> Sigma </td><td> M8266 </td><td></td></tr><tr><td> DEA (99,5%) </td><td> Sigma </td><td> 31589 </td><td></td></tr><tr><td> HCl 37% </td><td> Sigma </td><td> 320331 </td><td></td></tr><tr><td> H 3 BO 3 </td><td> Sigma </td><td> B6768 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [idrossimetil]-amminometano </td><td> Sigma </td><td> 252859 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (albumina sierica bovina) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> NaN 3 </td><td> Aldrich </td><td> 71290 </td><td></td></tr><tr><td> 1-naftil fosfato sale disodico </td><td> Fluka </td><td> N7255 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di latte scremato in blocco - non grassa del latte secco </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella), soluzione madre (1 mg / ml in PBS): </td><td> Biopure </td><td> 004050 </td><td> L&#39;HT-2-KLH coniugato è stato ottenuto da CDI-metodo in cui sono stati attivati ​​i gruppi-OH libero in posizione 3 e 4 alla tossina HT-2 da N, N&#39;-carbonyldiimidazole (CDI) e l&#39;attivazione HT-2 tossina è stata lasciare a reagire con aminogroups della proteina (KLH) per generare un legame stabile carbammati. </td></tr><tr><td> Secondaria anticorpo marcato: Anti-mouse IgG (H + L) dal cavallo, coniugato con fosfatasi alcalina, concentrazione 1 mg / ml. </td><td> Laboratori Vector </td><td> AP-2000 </td><td></td></tr><tr><td> HT-2 tossina </td><td> Biopure </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biglie magnetiche: Dynabeads ® </td><td> Dynal </td><td> M-280 Tosylactivated </td><td> Concentrazione di 2 x 10 9 sfere / ml. </td></tr></table> Soluzioni <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Preparazione </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Tampone fosfato (PBS), pH 7,4 </td><td> Sciogliere 0,20 g di cloruro di potassio, 0,20 g di potassio fosfato monobasico, 1,16 g di fosfato acido disodico e 8,00 g di cloruro di sodio in 900 ml di acqua </td><td></td></tr><tr><td> Dietanolammina buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M di KCl, pH 9,8 </td><td> Sciogliere 0.0476g di MgCl2 anidro e 7.3.59 g di KCl in ~ 300 ml di acqua. A dissoluzione avvenuta aggiungere 51 ml di DEA (99,5%). Regolare il pH a 9,8 con HCl (6 M). Diluire a 500 ml con acqua. </td><td></td></tr><tr><td> Borato tampone, 0,1 M, pH 9,5 </td><td> Sciogliere 3,09 g di H 3 BO 3 a ~ 300 ml di acqua distillata, aggiustare il pH a 9,5 con NaOH e / o HCl (6 M o concentrazioni più basse). Diluire a 500 ml con acqua distillata. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 </td><td> Sciogliere 3,85 g di Tris [idrossimetil]-amminometano in 100 ml di acqua. Aggiustare il pH 8.5 con NaOH e / o HCl (6 M o concentrazioni più basse). Diluire a 200 ml con acqua. </td><td></td></tr><tr><td> TRIS tampone + soluzione di BSA (0,1%), pH 8,4 </td><td> Sciogliere 0,050 g di BSA in 50 ml di tampone TRIS pH 8.4. </td><td> Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> PBS + 0,05% Tween ® </td><td> Sciogliere 0,250 g di Tween 20 in 500 ml del preparato in precedenza tampone PBS, pH 7,4 </td><td></td></tr><tr><td> PBS + BSA soluzione 0,1% </td><td> Sciogliere 0,050 g di BSA in 50 ml di tampone PBS, pH 7.3. </td><td> Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> PBS + BSA 0,1% + 0.02% NaN3 </td><td> Sciogliere 0,050 g di BSA e 0,010 di NaN 3 in 50 ml di tampone PBS, pH 7.3. </td><td> Stoccaggio soldistribuzione pesi </td></tr><tr><td> Substrato enzimatico </td><td> Sciogliere 0,010 g di sale 1-naftil fosfato di sodio in 100 ml di pH tampone DEA 9.8. Avvolgere il pallone strettamente in un foglio di alluminio. </td><td> Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> Soluzione di latte scremato in blocco </td><td> Aggiungere 0,20 g di Blotting grado Blocker non-Fat Milk secco (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a 200 ml di tampone PBS pH 7.3. </td><td> Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> HT-2 Soluzione </td><td> Sciogliere 10 mg di tricoteceni HT-2 fiala tossina, in 10 ml di acetonitrile per dare una soluzione con una concentrazione di 1 mg / ml. </td><td> Diviso questa soluzione in un solo usare aliquote di 30 ml e conservarli a meno di -30 ° C. </td></tr><tr><td> HT-2 Soluzione standard </td><td> Pipettare 20 ml di HT-2 soluzione di tossina magazzino in un ml 2 calibrato pallone tarato e diluire con acetonitrile per ottenere un HT-2 soluzione di lavoro contenente 10 mg / ml di tossina tricoteceni. </td><td> Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> HT-2 soluzioni calibrante di lavoro </td><td> Diluire il HT-2 soluzione standard di lavoro (10 mg / ml) per preparare la soluzione di lavoro calibrante 100 ng / ml. Diluire HT-2 soluzione di lavoro calibrante 100 ng / ml per preparare soluzioni di lavoro calibrante delle seguenti concentrazioni 0 (bianco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. </td><td> Queste soluzioni devono essere preparato fresco il giorno di utilizzo. </td></tr><tr><td> HT-2 coniugato con KLH </td><td> Suddivisi HT-2 coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella) soluzione madre (1 mg / ml in PBS) in monouso aliquote di 350 microlitri. </td><td> Aliquote conservare a -30 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo monoclonale specifico </td><td> Diluire 1:350 (v: v) la concentrazione stock (1,383 mg / ml) di anticorpo monoclonale in PBS da utilizzare in fase concorrenza </td><td> Questa soluzione va preparata di fresco al momento dell&#39;uso. 10 ml di soluzione di anticorpi magazzino in PBS per un volume finale di 3,5 ml, sono sufficienti per analizzare 17 norme e / o campioni. </td></tr><tr><td> Secondaria anticorpo marcato </td><td> Anti-topo IgG (H + L) coniugato con fosfatasi alcalina è diluito 1:100 (v: v) in PBS da utilizzare in fase concorrenza. </td><td> 100 ul soluzione madre di anticorpi in PBS per un volume finale di 10 ml, sono sufficienti per analizzare 25 norme e / o campioni. Questa soluzione va preparata di fresco al momento dell&#39;uso. </td></tr></table> Apparato <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Particelle magnetiche concentratore: MPC ®-S </td><td> Dynal </td><td></td></tr><tr><td> PalmSens strumento </td><td> PalmSens </td><td> Dotato di PalmSens Lite, seriale PC portatile cavo di collegamento e software Mux opzioni </td></tr><tr><td> CH8 PalmSens Multiplexer </td><td> PalmSens </td><td></td></tr><tr><td> Otto canali Mux contatto elettrico </td><td> fatti a mano </td><td></td></tr><tr><td> Striscia con otto elettrodi serigrafati (SPE) </td><td> fatti a mano </td><td></td></tr><tr><td> Supporto appositamente progettato per nastro elettrodi </td><td> fatti a mano </td><td> Comprende 8 magneti al neodimio ciascuno dei quali è posto al di sotto di ogni superficie dell&#39;elettrodo di lavoro della SPE </td></tr><tr><td> Pipette calibrate microlitro </td><td> Gilson </td><td></td></tr><tr><td> Agitatore magnetico e bar mescolare. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bicchieri di vetro (100, 50, 20 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matracci tarati (2 ml). </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 e 2 ml Eppendorf tubi. </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Provette Falcon ™ di 5 ml e 15 ml. </td><td> Falco </td><td></td></tr><tr><td> Laboratorio di Vortex Mixer </td><td></td><td> Non usare vortex per risospendere le sfere magnetiche rivestite con HT2-KLH o legati con catena immunologica ad evitare denaturazione proteica delle parti </td></tr><tr><td> Laboratorio forno o camera termostatati </td><td></td><td> Scegli un forno in grado di mantenere una temperatura di 37 ± 3 ° C. </td></tr></table>

elime (enzyme linked immuno magnetic electrochemical) method for mycotoxin detection

Immunologici sono una valida alternativa al più costoso e richiede tempo quantitativa HPLC o GC 1, 2 metodi di screening per la rilevazione di micotossine pericolose nei prodotti alimentari. In questo protocollo si mostra come fabbricare e interrogare un enzima competitivo elettrochimica alla prova di immunomagnetica basato sull&#39;uso di sfere magnetiche come supporto solido per la catena di immunochimica 3 e elettrodi serigrafati come piattaforma di rilevamento. Il nostro metodo mira a determinare la quantità totale di HT-2 e tossine T-2, micotossine appartenente alla famiglia tricoteceni e di grande preoccupazione per la salute umana 4. L&#39;uso di un clone di anticorpo con una reattività incrociata del 100% verso HT-2 e T-2 consente di rilevare simultaneamente sia le tossine con sensibilità simili 5. Il primo passo della nostra analisi è la fase di rivestimento in cui si immobilizzare HT2-KLH tossina coniugato sulla superficie di sfere magnetiche. Dopo una fase di blocco, necessario per evitare assorbimenti non specifici, l&#39;aggiunta di un anticorpo monoclonale permette la competizione tra immobilizzato HT-2 e liberi presenti HT-2 o T-2 nel campione o disciolte in una soluzione standard. Al termine della fase di concorso, la quantità di anticorpo monoclonale legato alla immobilizzato HT-2 sarà inversamente proporzionale alla quantità di tossina nella soluzione campione. Un anticorpo secondario marcato con fosfatasi alcalina (AP) è usato per rivelare il legame tra l&#39;anticorpo specifico e la immobilizzato HT-2. Il passo finale di misurazione viene eseguita lasciando cadere una aliquota di sospensione magnetica tallone, corrispondente ad uno specifico campione / soluzione standard, sulla superficie di uno schermo-stampa dell&#39;elettrodo di lavoro; sfere magnetiche sono immobilizzati e concentrato per mezzo di un magnete posizionato proprio sotto l&#39; serigrafato elettrodo. Dopo due minuti di incubazione tra sfere magnetiche e un substrato per AP, il prodotto enzimatico viene rilevato da Voltammetria Differential Pulse (DPV) utilizzando uno strumento portatile (PalmSens) anche in grado di avviare automaticamente otto misure in un intervallo di pochi secondi.

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ELIME Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical Method for Mycotoxin Detection

Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.

ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine

Immunoassays are a valid alternative to the more expensive and time consuming quantitative HPLC or GC1, 2 methods for the screening detection of hazardous ...

elime-enzyme-linked-immuno-magnetic-electrochemical-method-for

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ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) Method for Mycotoxin Detection

14.1K Views.  University of Rome, Tor Vergata. Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.

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Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

Rilevamento di proteine ​​Ubiquitinazione

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-chase Analisi di N-linked catene di zuccheri da glicoproteine ​​in cellule di mammifero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioassay Electroantennographic come strumento di screening per Volatili piante ospiti

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.