L&#39;autore è un Parkinson UK Research Fellow (borsa F1002). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla fiducia / MRC chiamata Wellcome comune in premio Neurodegenerazione (WT089698) al Consorzio Malattia di Parkinson Regno Unito (UKPDC) i cui membri sono presso l&#39;Istituto UCL di Neurologia, Università di Sheffield e l&#39;unità Proteine ​​MRC fosforilazione a l&#39;Università di Dundee.

Sicurezza Il protocollo descritto di seguito utilizza ATP marcato con 32 P radioattivo nella posizione fosfato γ di seguire l&#39;attività chinasi di LRRK2. Si basa su protocolli standard utilizzati nel nostro laboratorio, e quindi con riguardo a molte delle fasi del processo come la corsa il gel, western blotting et cetera i materiali e le condizioni precise dovrebbero essere presi come riferimento, come le apparecchiature ei protocolli utilizzate per questi processi varia da laboratorio a laboratorio. Composti contenenti isotopi che emettono radiazioni ionizzanti sono potenzialmente dannose per la salute umana e di licenza stretto e regolamenti a un controllo di livello istituzionale e nazionale il loro uso. Gli esperimenti di questo protocollo sono stati effettuati a seguito di formazione in uso aperto fonte di radiazione presso l&#39;University College di Londra e seguendo le linee guida di buona pratica di laboratorio fornite dai servizi di sicurezza presso il collegio (linee guida available a <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ). L&#39;uso di radiazioni open source non dovrebbe essere tentato prima a una formazione adeguata approvazione normativa. All&#39;organismo di regolamentazione competente per le radiazioni open source nella ricerca di laboratorio varia da paese a paese. Esempi di queste sono: nel Regno Unito, la Health and Safety Executive ( <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a> ), negli Stati Uniti, la Nuclear Regulatory Commission ( <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http:// www.nrc.gov / materiali / miagolio / regs-guide-comm.html</a> ), in Canada, la Canadian Nuclear Safety Commission ( <a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ), e in Germania Das Bundesamt für Strahlenschutz ( <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">http : / / www.bfs.de / de / BFS</a> ). Utenti di altri paesi dovrebbero confermare le regole locali, i regolamenti e le autorità di licenza con il loro agente di sicurezza dalle radiazioni. Precauzioni di sicurezza relative a questo protocollo sono stati notati nel testo, evidenziate con il simbolo del trifoglio radioattivo ( <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> ). 1. Preparare le reazioni chinasi <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Tutte le miscele di reazione preparata in provette con 1,5 ml con tappo a vite contenente un O-ring per prevenire la diffusione di radioattività. <ol><li> Proteine ​​disgelo su ghiaccio - LRRK2 wild-type, D1994A, G2019S. </li><li> compongono reazione su ghiaccio - 10nm LRRK2, 0.5μg/μl MBP, 5UL di tampone chinasi 10x, costituito da 50μl con acqua. </li></ol> 2. Esecuzione del test <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Tutte le fasi che utilizza 32 P ATP dovrebbe prendere ppizzo nelle aree designate radiazioni. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Adeguati dispositivi di protezione individuale devono essere indossato - in base alla procedura operativa standard nel nostro laboratorio questi includono camice, guanti e occhiali protettivi doppio. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Campioni contenenti 32 P ATP dovrebbe essere al riparo da 6 millimetri utenti schermi in perspex per minimizzare l&#39;esposizione. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Se del caso, dispositivi di monitoraggio personali devono essere utilizzati - entro UCL, qualsiasi certificato aperto utente radiazioni di origine deve avere un badge pellicola di monitorare l&#39;esposizione alle radiazioni durante gli esperimenti. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Tutte le superfici sperimentali dovrebbero essere valutati per la contaminazione radioattiva prima e dopo l&#39;uso con un Geiger contatore. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Tutti i materiali di consumo potenzialmente contaminati devono essere smaltiti in stretta aderenza alle linee guida istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti radioattivi. <ol><li> Prima di iniziare test, impostare blocchi di riscaldamento a 30 ° C e 100 ° C rispettivamente </li><li> Rimuovere 32 P ATP dal freezer -20 (da notare che le condizioni di conservazione fro 32 P ATP possono variare a seconda fornitore o al tipo di radionucleotides utilizzato). <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> scansione al di fuori del contenitore prima dell&#39;uso, scongelare dietro lo schermo in perspex. </li><li> Con reazioni sul ghiaccio, aggiungere 1ml di 32 P ATP per ogni insieme con 10μM di freddo ATP. </li><li> Mescolare bene con la pipetta. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. </li><li> Rimuovere 15μl aliquota per tempo un punto zerod interrompere la reazione di aliquota con l&#39;aggiunta di 5μl di 4x tampone campione SDS e denaturazione a 100 ° C per 10 minuti. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. </li><li> Campione rimanente posto nel blocco di riscaldamento e incubato a 30 ° C per 60 minuti. </li><li> 15μl rimosso punto a 60 minuti e tempo di reazione terminata con l&#39;aggiunta di 5μl di 4x tampone campione SDS e denaturazione a 100 ° C per 10 minuti. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Centrifuga impulso di portare liquidi a fondo della provetta, riducendo al minimo il rischio di contaminazione. </li></ol> 3. Immunoblotting i campioni e analisi dei risultati <ol><li> I campioni eseguiti su SDS-PAGE <ol><li> 10 e 4-12% Bis-tris gel per l&#39;elettroforesi polyacrilamide preparato utilizzando tampone MOPS esecuzione. </li><li> 20μl di ciascun campione caricati su gel insieme 7μl di diesismantenere scala delle proteine ​​standard. </li><li> Gel funzionare a 160V per 90 minuti, o fino a fronte del colorante ha raggiunto la fine del gel. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Tutto il liquido a contatto con radioisotopi devono essere trattati come rifiuti radioattivi e smaltiti secondo le linee guida istituzionali. Regolamenti UCL affermare che i rifiuti liquidi radioattivi deve essere eliminata versando giù designato affonda disposizione radioattivo con acqua abbondante. </li></ol></li><li> Proteine ​​di membrana PVDF trasferiti tramite Western Blot. <ol><li> Buffer di trasferimento preparato, 1x Tris Glicina più il 20% di metanolo. PVDF membrana e carta da filtro tagliata a dimensioni corrette per il gel e attivato con metanolo glaciale nel caso della membrana o pre-umido con buffer di trasferimento nel caso della carta da filtro. La membrana deve essere pre-etichettati con inchiostro a sfera per consentire l&#39;identificazione di orientamento. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="Simbolo 1" /> Gel rimosso dal plastic involucro e acrilamide in eccesso rimossi e smaltiti come rifiuti radioattivi. </li><li> Il gel deve essere formato in un panino con la membrana e carta da filtro, assicurando che non bolle esistono tra la membrana e il gel, e poi disposte in dell&#39;apparato Western Blot con la membrana tra il gel e l&#39;anodo. </li><li> Trasferimento effettuato a 25V per 16 ore. </li></ol></li><li> In seguito al trasferimento di PVDF proteine, la membrana deve essere essiccata a temperatura ambiente. Infine, la membrana a secco dovrebbe essere isolato tra fogli di acetato di cellulosa e esposti a uno schermo al fosforo o pellicola di raggi X per permettere il rilevamento di proteine ​​radiomarcato. Tempo di esposizione può essere eseguito da diverse ore a più di una settimana a seconda della specifica attività del radioisotopo utilizzato e la cinetica enzimatica della reazione. </li><li> Phosphoscreen scansione / pellicola sviluppata. Se si utilizza uno schermo al fosforo, l&#39;immagine deve essere salvato come ad alta risoluzione TIFF o file bitmap, se si utilizza pellicola poi la risultante transparency sottoporre a scansione utilizzando uno scanner desktop e salvate come TIFF ad alta risoluzione o file bitmap. L&#39;immagine può quindi essere analizzato in ImageJ, un programma freeware disponibile sul sito web del National Institutes of Health ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati La figura 1 mostra i risultati di rappresentanza per un test effettuato con wild-type, G2019S e LRRK2 D1994A con proteina basica della mielina come substrato generico accettore di fosfato. Autofosforilazione di LRRK2 è visibile a ≈ 200kDa, con bande multiple rappresentano MBP fosforilata visibile dal 20-40kDa. Si noti l&#39;assenza di autofosforilazione nella (chinasi morti) corsia D1994A, e una maggiore fosforilazione a causa della mutazione G2019S. Nota fosforilazione anche residua del MBP nella corsia chinasi morti. Ciò può essere dovuto ad ablazione incompleta dell&#39;attività chinasi di LRRK2 dal mutante D1994A o riflettere la presenza of traccia contaminanti chinasi nella reazione. <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. 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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo documento descrive un protocollo di base per saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 utilizzando un sistema in vitro. Per motivi di brevità, questo è stato limitato ad una durata di un&#39;ora modello punto di arrivo utilizzando un substrato generico, ma il protocollo generale è applicabile a una vasta gamma di substrati potenziale e suscettibili di analisi più sofisticate esaminando la cinetica dell&#39;attività chinasi di LRRK2 . Questo evidenzia uno dei vantaggi principali dell&#39;utilizzo di un sistema in vitro per esaminare il comportamento di una proteina chinasi come questa: perché c&#39;è il controllo completo sulle concentrazioni di enzima e substrato, è possibile generare dati cinetici e calcolare K m e V valori massimi per la reazione. Per le valutazioni cinetiche più dettagliate o per valutare l&#39;impatto degli inibitori putativo, un sistema di throughput più elevato (come ad esempio quello offerto dalla utilizzando il substrato LRRKtide, disponibile da Invitrogen) è un superiore alternative per l&#39;approccio descritto qui. E &#39;importante, tuttavia, riconoscere che il sistema modello riduzionista fornite da test in vitro chinasi è solo uno strumento per esaminare la biologia di una chinasi e dei suoi rapporti con i substrati potenziale. I dati di test come questo deve essere usato in combinazione con altri approcci per ottenere un quadro completo di come si comporta una chinasi in vitro e in un contesto cellulare. Per esempio, un substrato putativo fosforilato in vitro possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per identificare phosphosites possibili che possono poi essere manipolati da mutagenesi mirata (ad es. Serina la conversione o la treonina residui accettore di fosfato a nessuno-phosphorylatable residui come l&#39;alanina) per esaminare il funzionale conseguenze di fosforilazione ex vivo. Una considerazione chiave per interpretare i dati da un sistema di analisi in vitro come questo sarebbe il rischio di either tipo I o tipo II (falsi positivi o falsi negativi) errori. La natura riduzionista di questo sistema dispone purtroppo di entrambi - nel caso della prima, avendo un substrato purificato putativo e purificata chinasi artificialmente nelle immediate vicinanze e ad alta concentrazione (rispetto al milieu cellulare) può causare eventi fosforilazione artefatti. Al contrario, molte chinasi funzionare come parte di un complesso all&#39;interno del contesto della cellula, e richiedono co-fattori per la fosforilazione di un substrato dato che si verifichi. Come notato sopra, un risultato positivo da fosforilazione di un substrato putativo utilizzando un sistema di dosaggio in vitro dovrebbe poi essere testato in un sistema cellulare per convalidare il risultato, e un risultato negativo devono essere interpretati con cautela. Alla luce di questo, è fondamentale dove è possibile avere controlli sia positivi che negativi per consentire uno studio comparativo delle attività della vostra chinasi di interesse. L&#39;attenta selezione di un Contro positivol che ha un&#39;attività conosciuta verso la vostra proteina di interesse, insieme a un controllo negativo che è improbabile che fosforilare il tuo substrato putativo, è estremamente prezioso. Un controllo candidato LRRK2 è Receptor interagire chinasi 3, che ha una sequenza strettamente legata primario al dominio della chinasi di LRRK2, ma ha una struttura molto diversa dominio totale 18. Questo è disponibile come proteina ricombinante da Invitrogen e viene utilizzato come controllo standard nel nostro laboratorio. Va inoltre notato che la forma commercialmente disponibile di LRRK2 manca l&#39;N-terminale della proteina ed è etichettato con il glutatione-s-transferasi, e questo dovrebbe essere preso in considerazione come potenziale fattore di confondimento nello svolgimento di test con questa proteina chinasi, come non si sa quale ruolo l&#39;N-terminale di LRRK2 può giocare nella funzione normale di questa proteina. Se, per esempio, la porzione N-terminale di LRRK2, che è assente nella proteina utilizzata nel presente protocolloè fondamentale per l&#39;assunzione di un substrato specifico per il dominio della chinasi di LRRK2 allora questo avrà un impatto importante sulla fosforilazione osservato di tale substrato nel sistema in vitro sopra descritto. Anche con queste riserve, tuttavia, l&#39;importanza attribuita alla biologia di LRRK2 nella ricerca di Parkinson mette in evidenza l&#39;utilità di questo protocollo come uno strumento prezioso per indagare il comportamento di questa proteina in un ambiente in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commento </td></tr><tr><td> LRRK2 tipo selvatico </td><td> Invitrogen </td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 G2019S </td><td> Invitrogen </td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td> Invitrogen </td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td> Chinasi tampone </td><td> Cellula di segnalazione </td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td> Sigma </td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> G 32P ATP </td><td> Perkin Elmer </td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi, 30Ci / mMole </td></tr><tr><td> 4x LDS campione tampone </td><td> Invitrogen </td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Sigma </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Proteina standard </td><td> Invitrogen </td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td> MOPS buffer di esecuzione </td><td> InvitrOgen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td> Bis-tris gel di acrilamide </td><td> Invitrogen </td><td> NP0321 </td><td> 4-12% 1 millimetro 10well </td></tr><tr><td> Membrana PVDF </td><td> Millipore </td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td> Trasferimento di buffer </td><td> Invitrogen </td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti Distillata e acqua deionizzata è stato utilizzato per tutte le fasi di diluizione <table border="1"><tbody><tr><td> Apparecchiature di tipo </td><td> Azienda </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Contatore Geiger </td><td> Mini Instruments </td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGE serbatoio </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Trasferimento del serbatoio </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Blocchi di calore (2) </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Fosfori dello schermo </td><td> GE </td><td> X-ray film può essere sostituito </td></tr><tr><td> I fosforimager </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Esposizione cassetta </td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td></td></tr><tr><td> Perspex schermatura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubi di 1,5 ml </td><td> VWR </td><td> Tappo a vite con O-Ring </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Attrezzatura

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

Chinasi Ripetere leucina Rich 2 (LRRK2) è un aminoacido 2527 membro della famiglia ROCO di proteine, in possesso di una struttura complessa, multidominio tra cui un dominio GTPasi (chiamato ROC, per Ras di proteine ​​complesse) e un dominio chinasi 1. La scoperta nel 2004 di mutazioni LRRK2 che causano la malattia di Parkinson (PD) ha portato ad LRRK2 essere al centro di un enorme volume di ricerca nella sua normale funzione e come la proteina va storto nello stato di malattia 2,3. Prime indagini nella funzione di LRRK2 concentrata sulla sua attività enzimatiche 4-6. Nonostante un quadro chiaro deve ancora emergere di una consistente alterazione di questi a causa di mutazioni, i dati di un certo numero di gruppi ha evidenziato l&#39;importanza dell&#39;attività della chinasi di LRRK2 nella morte cellulare legata a mutazioni 7,8. Recenti pubblicazioni hanno riportato inibitori intese a promuovere l&#39;attività chinasica di LRRK2, fornendo uno strumento chiave sperimentale 9-11. Alla luce di questi dati,È probabile che le proprietà enzimatiche di LRRK2 ci offrono una finestra importante sulla biologia di questa proteina, anche se sono potenziali bersagli farmacologici per il Parkinson è aperta al dibattito. Un certo numero di approcci diversi sono stati usati per il saggio di attività chinasica di LRRK2. Inizialmente, le analisi sono state effettuate utilizzando epitopo proteico tag sovra-espresso in linee cellulari di mammiferi e immunoprecipitato, con il test effettuato utilizzando questa proteina immobilizzato su perline agarosio 4,5,7. Successivamente, ricombinante purificata frammenti di LRRK2 in soluzione sono stati utilizzati anche, per esempio un frammento GST tag purificato da cellule di insetto contenenti residui 970-2527 di LRRK2 12. Recentemente, Daniels et al. Riferito l&#39;isolamento di LRRK2 a figura intera in soluzione da cellule di rene embrionale, tuttavia questa proteina non è ampiamente disponibile 13. Al contrario, la fusione GST forma troncata di LRRK2 è commercialmente dispone (da Invitrogen, si veda la tabella 1 per i dettagli), e fornisce un comodo strumento per dimostrare un test per LRRK2 attività chinasi. Più uscite per LRRK2 attività chinasi sono stati segnalati. Autofosforilazione di LRRK2 stesso, la fosforilazione della proteina basica della mielina (MBP) come substrato generico chinasi e fosforilazione di un substrato artificiale - LRRKtide chiamato, sulla base fosforilazione della treonina 558 in Moesin - sono stati tutti utilizzati, così come una serie di putativi substrati fisiologici tra cui α-sinucleina, Moesin e 4-EBP 14-17. Lo stato di queste proteine ​​come substrato per LRRK2 rimane poco chiaro, e come tale il protocollo descritto di seguito si concentrerà sull&#39;utilizzo di MBP come substrato generico, sottolineando l&#39;utilità di questo sistema di dosaggio LRRK2 attività chinasi diretto contro una vasta gamma di substrati potenziale.

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo lavoro,<em&gt; In vitro</em&gt; Dosaggio dell&#39;attività chinasica di LRRK2 e una selezione di suoi mutanti è descritto, fornendo un sistema sperimentale per esaminare la fosforilazione di substrati putativi e disfunzione potenziale di LRRK2 nella malattia.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.4K Views.  UCL Institute of Neurology. Chinasi Ripetere leucina Rich 2 è una chinasi multidominio grande, le cui mutazioni sono la causa genetica più comune della malattia di Parkinson. Analisi delle attività di questa proteina chinasi ha dimostrato di essere uno strumento fondamentale per comprendere la biologia e la disfunzione di questa proteina. In questo lavoro, In vitro Dosaggio dell'attività chinasica di LRRK2 e una selezione di suoi mutanti è descritto, fornendo un sistema speri...

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Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

Capacità di analizzare il diffusibili molecole di segnalazione per l&#39;orientamento embrionali assoni spinali commissurali

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

Ricerca

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

Rilevazione diretta della acetato di formazione Attività di acetato enzima chinasi

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Saggio del proteasoma degradazione in un sistema di libero-Cell nelle piante

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Misura della larvali attività nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.