Questo protocollo descrive tecniche che possono essere utilizzate dai fisiologi dei piccoli animali per chiarire il ruolo dei neuropeptidi e di altri fattori ormonali che regolano il sistema digestivo e/o escretore. Queste tecniche consentono misurazioni di campioni biologici di dimensioni micro che altrimenti non sarebbero possibili utilizzando tecniche progettate specificamente per modelli animali più grandi, tra cui, ad esempio, roditori e teleus. Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione endocrina dell'intestino, incluso il trasporto epiteliale e la muscolatura liscia associata al tratto gastrointestinale negli insetti e nelle specie non insettiche di dimensioni simili.
A dimostrare le procedure tubariche renali degli insetti sarà Farwa Sajadi, un dottorando del mio laboratorio. Inoltre, un ex studente laureato del mio laboratorio Aryan Lajevardi dimostrerà i protocolli focalizzati sull'intestino posteriore. Inizia preparando i piatti di Ramsay e di contrazione per gli esperimenti.
Utilizzare pipette e riempire pozzi con un massimo di 20 microlitri di soluzione. Per i controlli non stimolati, riempire i pozzetti con 20 microlitri di mezzo Aedes saline Schneider. Una volta riempiti tutti i pozzetti, versare l'olio minerale idratato nel piatto di analisi fino a quando i pozzetti e i perni Minutien sono immersi.
Dopo aver immerso il tubulo nel pozzo, raccogliere l'estremità prossimale del tubulo con una pinza, rimuoverla dalla goccia da bagno e avvolgere l'estremità attorno al perno. Avvolgere il tubulo attorno al perno due volte mantenendo la lunghezza del tubulo rimanente nella goccia da bagno coerente con gli altri tubuli. Per creare un microelettrodo selettivo del sodio, utilizzare una siringa da un millilitro per riempire l'elettrodo con cloruro di sodio da 100 millimolari.
Assicurarsi che la soluzione di riempimento si riempia fino alla punta dell'elettrodo. Se compaiono bolle d'aria, scorrere delicatamente il microelettrodo o rimuovere la soluzione e ricaricare. Immergere una punta di pipetta da 10 microlitri nella soluzione di ionoforo selettivo del sodio.
Allineare l'elettrodo perpendicolarmente alla pipetta, quindi posizionare un dito guantato sul fondo della punta per creare pressione ed espellere una piccola goccia di ionoforo. Toccare con attenzione la goccia di ionoforo sulla punta del microelettrodo, assicurandosi di non romperla. Riempi un piccolo becher a metà strada con cloruro di sodio 100 millimolare e posiziona dell'argilla modellante all'interno nella parte superiore del becher.
Dopo che lo ionoforo è stato assorbito, posizionare la punta dell'elettrodo verso il basso sulla parete del becher, lasciando le punte all'interno del cloruro di sodio. Tenere ISME nel becher fino a quando non è pronto per l'uso. Per realizzare l'elettrodo di riferimento ISME, riempire un elettrodo con cloruro di potassio 500 millimolare e conservarlo in un becher.
Rivestire le punte dell'elettrodo utilizzando una soluzione di circa il 3,5% di cloruro di polivinile, disciolto in tetraidrofurano, per evitare lo spostamento dello ionoforo quando immerso in olio di paraffina. Per calibrare l'elettrodo di sodio, posizionare 10 goccioline di microlitro di cloruro di sodio a concentrazioni standard sul bordo del piatto ramsey con i tubuli malpighiani incubati. Posiziona le goccioline standard a due centimetri di distanza con la maggiore concentrazione in cima.
Inserire sia l'elettrodo di riferimento che l'elettrodo iono-selettivo sopra i fili d'argento cloruro e fissarli saldamente utilizzando portaelettrodi collegati a micropolmulatori. Navigare entrambi gli elettrodi verso la goccia di cloruro di sodio da 200 millimolari utilizzando i micropol manipolatori, assicurandosi che le punte elettriche non tocchino il fondo del piatto. Accendere l'elettrometro per avviare la registrazione e consentire alla lettura di stabilizzarsi.
Registrare la lettura e passare allo standard successivo. Dopo aver acquisito le misurazioni della velocità di secrezione del fluido, spostare con attenzione gli elettrodi selettivi di riferimento e ionici nella goccia secreta utilizzando i micropolmulatori. Attiva la registrazione e consenti alla lettura di stabilizzarsi, quindi registra.
Accendere l'amplificatore ionico/polarografico IPA-2, il microscopio ottico e i computer. Posizionare il microelettrodo selettivo del sodio su un supporto costituito da un filo di cloruro d'argento e collegarlo al jack del connettore femmina. Rimuovere un elettrodo di riferimento dal becher con il cloruro di potassio, posizionando un dito a un'estremità e inclinando il capillare di vetro verso questo dito per evitare che l'agar cada.
Posizionare con attenzione un'estremità nel supporto, assicurandosi che non si formino bolle. Se c'è una bolla, rimuovere l'elettrodo di riferimento, riempire il supporto con tre cloruro di potassio molare e ripetere. Posizionare il supporto dell'elettrodo nel jack del connettore femmina.
Dopo la calibrazione, sezionare l'organo. Posizionare il piatto di poli-L-lisina con il campione sezionato sul palco del microscopio e inserire la punta dell'elettrodo di riferimento all'interno della soluzione salina. Immergere la punta del microelettrodo iono-selettivo nella soluzione salina, facendo attenzione a non rompere la punta.
Utilizzare le manopole di regolazione manuale per regolare la posizione del microelettrodo mentre si guarda al microscopio ottico. Regolare la posizione verticale del microelettrodo in modo che la sua punta si trovi sullo stesso piano dell'organo o del tessuto, quindi ruotare l'interruttore del motore per abilitarlo. Utilizzando i tasti freccia del computer, spostare il microelettrodo orizzontalmente in una posizione a tre millimetri di distanza dal tessuto per misurare le registrazioni in background.
Quando sei pronto, inizia a registrare premendo F5, ottieni cinque misurazioni dell'attività in background. Spostare la punta del microelettrodo vicino al tessuto facendo attenzione a non perforare l'organo. Ridurre la sensibilità al tasto per posizionare la punta del microelettrodo di due micrometri direttamente a destra, perpendicolare al tessuto.
Ottenere tre registrazioni nel sito lungo il pad rettale per identificare il sito di maggiore attività ionica, quindi ottenere misurazioni saline di base nel sito che mostra la maggiore attività. Per registrare le contrazioni dell'intestino posteriore, riempire uno dei pozzetti del piatto con un volume noto di soluzione salina Aedes. Dopo la dissezione, trasferire con cura l'intestino posteriore sezionato attaccato all'intestino medio in un pozzo in un altro piatto, assicurandosi di non pizzicare l'ileo.
Immergere l'intestino nella soluzione salina all'interno del pozzo e posizionare i perni di Minutien nell'intestino medio e nel retto. L'ileo non deve essere sotto tensione e devono essere osservate contrazioni spontanee originate dalla valvola pilorica all'ileo anteriore. Collegare la videocamera al microscopio stereoscopico.
Quindi posizionare il piatto contenente l'organo sezionato sotto il microscopio e registrare un video per due minuti. L'applicazione di DH31 contro i tubuli malpighiani non stimolati provoca un significativo aumento del tasso di secrezione dei liquidi, confermando il suo ruolo di ormone diuretico nelle zanzare Aedes. Quando i tubuli sono trattati con AedaeCAPA-1, si osserva una riduzione del tasso di secrezione nei tubuli malpighiani stimolati da DH31.
Gli elettrodi ionoselettivi sono stati utilizzati per misurare le concentrazioni di sodio nelle goccioline secrete. Il trattamento di DH31 sulle MT non ha avuto alcun effetto sulla concentrazione di sodio nella goccia secreta. Tuttavia, con l'applicazione di AedaeCAPA-1, la concentrazione di sodio nel fluido secreto è stata significativamente aumentata.
Inoltre, rispetto ai controlli non stimolati, DH31 ha portato a un tasso di trasporto del sodio significativamente maggiore, mentre AedaeCAPA-1 ha abolito questo aumento dei tubuli stimolati da DH31. Il SIET è stato utilizzato per valutare i cambiamenti nel trasporto di sodio lungo l'epitelio del cuscinetto rettale delle zanzare femmine adulte. Un analogo della leucochinina è stato utilizzato per esaminare i cambiamenti nell'assorbimento del sodio, che ha comportato una diminuzione di quattro volte dell'assorbimento del sodio rispetto al controllo salino.
Per valutare il ruolo di un neuropeptide pirochinina2 sulla motilità ileale, è stato utilizzato un analogo di Rhodnius prolixus, che in precedenza aveva dimostrato di attivare il recettore A.aegypti PK2 arricchito nell'ileo della zanzara. Rispetto ai livelli basali, PK2 inibisce significativamente le contrazioni ileali. Quando si esegue un test Ramsay con tubuli malpighiani e si misurano i tassi di secrezione di ioni o liquidi, è imperativo che i tubuli non vengano danneggiati durante la dissezione o durante il trasferimento nel piatto del saggio.
Dopo il test di Ramsay, specifici trasportatori di membrana possono essere mirati farmacologicamente o molecolarmente utilizzando tecniche genetiche inverse per discernere il loro contributo specifico al trasporto transepiteliale di soluti nell'epitelio semplice.
