Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal NIH RO3-EB007299-02 e NSF Award EPSCoR First.

1. Preparazione del tessuto Construct Il tessuto costrutto processo di preparazione consiste di tre fasi principali: espansione della popolazione cellulare, la semina di cellule su un&#39;impalcatura biomateriale, e differenziazione attraverso l&#39;uso di molecole chimiche di segnalazione. La procedura per la preparazione costrutto è basato su metodi condotti da Dennis et al., Hong et al., E Marion e Mao 8,9,10. <ol><li> Dopo la coltura e l&#39;espansione della linea cellulare, seme le cellule staminali mesenchimali (MSC h) su una spugna di gelatina (4 mm, spessore 3,5 mm) ad una densità di 1x10 6 cellule / ml per ossa e 3x10 6 cellule / ml adiposo formazione. </li><li> Per la differenziazione di cellule staminali mesenchimali h in adiposo, applicare i mezzi di induzione adiposi composti da 1 desametasone pM, 0,5 pM isobutil-metilxantina, 10 ug / ml di insulina umana ricombinante-, indometacina e 200 pM in mezzo cellulare espansionevolta che le cellule appaiono confluenti sul patibolo. Dopo tre giorni, sostituire il supporto con 10 ug / ml di insulina umana ricombinante, in supporti di espansione per 24 ore poi tornare a supporti induzione. Ripetere il ciclo di tre volte e poi scambiare solo in terreno di mantenimento ogni due giorni. </li><li> Per indurre osteogenesi, preparare supporti induzione osteogeniche facendo una concentrazione finale di 0,1 pM desametasone, 50 pM di acido L-ascorbico-2phosphate, e 10 mM β-glicerofosfato in mezzo cellulare espansione. Sostituire con mezzi freschi osteogeniche ogni due giorni. </li></ol> 2. Attuatore Caratterizzazione Caratterizzazione dell&#39;attuatore è un passo fondamentale per l&#39;esperimento MRE. MRE si basa sulla propagazione di onde di taglio meccanici per valutare i valori locali di proprietà meccaniche, pertanto, queste vibrazioni meccaniche devono essere generato e caratterizzato all&#39;interno del tessuto di interesse utilizzando un attuatore piezoelettrico. Un illustrato exaservite ad esempio del processo di caratterizzazione viene mostrato nella Figura 3. Lo scopo di questa procedura è di ottimizzare il movimento dell&#39;attuatore per generare innocui onde di taglio con ampiezze significativi (~ 250 micron). <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, applicare 0,5% gel di agarosio per racchiudere il costrutto in una provetta 10 mm. La temperatura del gel deve essere di circa 37 ° C per minimizzare i danni alla costruzione. </li><li> Dopo aver lasciato i gel di agarosio cinque minuti per impostare a temperatura ambiente, inserire la punta del motore piezoelettrico piegatura nella superficie del gel. </li><li> Fissare la provetta contenente il campione e l&#39;attuatore di un supporto rigido, ed orientare il fascio del vibrometro laser Doppler verso la punta dell&#39;attuatore meccanico. Regolare il posizionamento del sistema per ottimizzare il segnale riflesso, utilizzare nastro riflettente, se necessario. </li><li> Sulla base della frequenza di risonanza prevista l&#39;attuatore meccanico, impostare il generatore di funzioni per spazzare la dGamma di frequenza esired (cioè 20 a 2000 Hz in questo esperimento) utilizzando una tensione di funzionamento di 20 Vpp con un segnale di rumore bianco. </li><li> Mostra lo spettro caratterizzato sul programma Polytec Vibrosoft per identificare la frequenza di risonanza del sistema e impostare il programma di FFT e velocità come l&#39;asse y. </li><li> Per la misura di spostamento, impostare l&#39;attuatore di fornire una sinusoide continuo alla frequenza di risonanza indicato utilizzando una tensione di 200 Vpp, e notare lo spostamento generato essere consegnato alla superficie del gel. Impostare Vibrosoft per visualizzare la FFT con spostamento come l&#39;asse y. </li></ol> 3. Acquisizione di immagini <ol><li> Dopo aver completato caratterizzazione attuatore, posizionare il campione e attuatore nel centro dello scanner MRI. Per gli esperimenti costrutto tessuto, utilizzare una piccola bobina RF e più sensibile (cioè 10 mm in questo esperimento) per la trasmissione e ricezione del segnale RF. (La procedura illustrata utilizza uno 9,4 Tmagnete foro verticale dotato di gradienti tre assi, 100 g / cm). </li><li> Acquisire una immagine scout per l&#39;identificazione della posizione costrutto. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;acquisizione. Un tipico in vitro sagittale scansione avrà un tempo di ripetizione di 1000 ms, tempo di eco di 20-40 ms, spessore di strato di 0,5-1,0 mm, e campo di vista 12x10 mm 2 con una matrice di dimensione 128x128 pixel. </li><li> Per i parametri elastografia, impostare la frequenza attuatore al valore determinato dalla caratterizzazione vibrometro laser Doppler. In questo studio, una coppia bipolare è stato necessario, con un gradiente di ampiezza di 50 g / cm. Altri parametri per regolare includono il ritardo che deve essere impostato a zero millisecondi per l&#39;acquisto iniziale. </li><li> Modificare la funzione di generatore di modalità burst e regolare i parametri del generatore di funzioni affinché corrispondano a quelle dei parametri di acquisizione elastografia tra cui la frequenza e il numero di cicli. Inoltre, impostare la funzionezione del generatore da indurre dall&#39;esterno. </li><li> Per una immagine sagittale, impostare la sensibilizzazione moto sia nella direzione positiva fetta e avviare la scansione. A seguito dell&#39;acquisizione, controllare l&#39;immagine e cambiare la sensibilizzazione alla direzione fetta negativa. </li><li> Eseguire il programma MATLAB che eseguirà la divisione complessa per la generazione delle immagini delle onde di taglio. </li><li> Valutare l&#39;immagine per la presenza di onde di taglio e oggetti possibili, come il confezionamento di fase. </li><li> Se non regolazioni dell&#39;immagine sono necessari, regolare la dimensione matrice parametro per otto valori equispaziati che vanno da zero secondi a un intero periodo della frequenza di risonanza caratterizzato. </li><li> Acquisire una scansione in entrambi gli orientamenti slice positivi e negativi. </li><li> Una volta che le immagini sono acquisite, utilizzare un programma MATLAB progettato per la generazione dei dati delle onde di taglio da una serie di immagini. </li></ol> 4. MRE Experiment Image Processing <ol><li> Thfase e finale di MRE è calcolare la rigidezza a taglio dalle immagini onda di taglio. Inserimento dei dati nel programma MATLAB che valuterà il dataset tridimensionale (2 spaziale, uno temporale). </li></ol> Nota: Assumendo un&#39;onda planare taglio, le equazioni del moto permettendo disaccoppiare la stima del valore complesso modulo di taglio in funzione dello spostamento e del suo laplaciano. L&#39;algoritmo approssima spaziali derivate seconde con differenze finite e calcola il modulo di taglio su un pixel-per-pixel. Da questo numero complesso, molti parametri meccanici può dedurre come la velocità delle onde di taglio, attenuazione dell&#39;onda, rigidezza a taglio, elasticità taglio, viscosità di taglio, ecc L&#39;algoritmo permette inoltre la selezione di regioni di interesse per cui la deviazione media e standard di ciascun parametro viene calcolato. <ol start="2"><li> I parametri di imaging devono essere specificate all&#39;inizio del programma. Inoltre, the il limite superiore della elastogramma può essere regolata per ottimizzare contrasto nel campione. </li></ol> Nota: Il programma fornisce i risultati intermedi (onda dopo filtri passa-basso, onda dopo il filtraggio direzionali, temporali FFT, profili di linea, ecc) che aiutano l&#39;utente stimare la fedeltà della ripresa. <ol start="3"><li> Alcuni parametri possono essere regolati in base a questa informazione, come i livelli di filtri passa-basso, la frequenza temporale del moto, la direzione di propagazione dell&#39;onda, ecc La deviazione standard di un parametro in una specifica regione di interesse sia anche un indicatore della qualità del calcolo. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Figura 4 note la modifica delle proprietà meccaniche in tutto quattro settimane di sviluppo costrutto osteogenico e adipogenico. MRE è stata condotta a 730-820 Hz. Mentre entrambe le spugne teste di serie iniziata circa 3 kPa, osteogenic tessuti dirette portato ad una rigidità di 22 kPa e che, diretto tessuti adiposi sono diminuiti in rigidità a 1 kPa. Inoltre, i costrutti osteogeniche mostrato una notevole diminuzione delle dimensioni rispetto dall&#39;inizio alla fine dello studio. Ulteriori oggetti derivate da elastografia studio sono mostrati nella Tabella 1. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Il processo di acquisizione di immagini per risonanza magnetica elastografia. Durante l&#39;acquisizione delle immagini, una sequenza di impulsi (a) controlla la sincronizzazione (b) del generatore di funzione con la gradienti impulsi bipolari dello scanner MRI. Dopo l&#39;acquisizione di gradienti bipolare attivata in orientamenti positivi e negativi, (c) una immagine delle onde di taglio è prodotto utilizzando complessa divisione. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Diagramma di flusso del processo per MRE motore tessutocostrutti Luin. In primo luogo, le cellule (a) vengono dapprima coltivate ed espanse a quelle della popolazione essenziale per il progetto ideato. Quindi le cellule sono seminate (b) su un&#39;impalcatura biomateriale e reagenti chimici vengono applicati per segnalare differenziazione. Le impalcature sono caratterizzati con MRE, il cui primo stadio (c) è la determinazione della frequenza di risonanza del attuatore accoppiato al costrutto. Successivamente, immagini MRI (d) sono acquisiti per generare una immagine delle onde di taglio (e). Infine, viene applicato un algoritmo per ottenere un elastogramma (f) che mappa la rigidità del costrutto. Allo stesso tempo, costrutti sono sezionate per la valutazione istologica (g) al fine di convalidare la differenziazione. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Procedura di caratterizzazione attuatore. L&#39;impalcatura gelatina è racchiuso da un gel di agarosio 0,5%. Per caratterizzare il moto viene trasferito nel campione un rumore bianco viene inizialmente inviato nel sistema(1a) e il moto risultante viene rilevato utilizzando un vibrometro laser Doppler (1b). Una volta che la frequenza di risonanza viene determinata, un segnale continuo sinusoide a risonanza (2a) viene inviato per determinare lo spostamento (2b) trasferita all&#39;ambiente gelatina. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Costruire la mappa dello sviluppo nel periodo di quattro settimane. Adipogenica (A) e osteogenica (O) costrutti sono mostrati da sinistra a destra con grandezza corrispondente e le immagini delle onde di taglio, elastogramma, e rigidità taglio media. La mappa di colori per le corrisponde elastogramma con lo schema dei colori del grafico a barre e le barre di errore rappresentano la deviazione standard all&#39;interno della regione di ogni costrutto di interesse. <img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabella 1"/&gt; Tabella 1. Proprietà meccaniche dei costrutti osteo adipose e per un periodo di quattro settimane di crescita.

<ol>
	<li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging.">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li><li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro.">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li><li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+magnetic+resonance+elastography+(microMRE.">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li><li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves.">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li><li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs.">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , (2011).</li><li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation.">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li><li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shear+wave:+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test.">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li><li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge.">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li><li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously:+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression.">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li><li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering.">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li><li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+spin-echo+magnetic+resonance+elastography+of+the+brain.">Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain.</a> , 1647-1647 (2001).</li><li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+EPI+based+3D+MR+elastography+of+the+brain.">Fast EPI based 3D MR elastography of the brain.</a> , 3385-3385 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

In questa procedura, il processo di MRE per costrutti di ingegneria tessutale è dimostrata dalla preparazione cella alla generazione di un elastogramma. Applicando un metodo non distruttivo valutazione meccanica alla conduttura di ingegneria tissutale, è ora possibile per valutare le variazioni costrutti artificiali tutto diversi stadi di sviluppo. Inoltre, integra MRE altri metodi di RM per il monitoraggio dei tessuti ingegnerizzati costrutti come la diffusione, il trasferimento di magnetizzazione, e lo spostamento a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> MSCGM-Bullet Kit </td><td> Reagente </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> 21600-010 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% tripsina-EDTA </td><td> Reagente </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Desametasone </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D2915 </td><td></td></tr><tr><td> 3-isobutil-1-metilxantina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I5879 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Insulino-pancreas bovino </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6634 </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Indomethacin </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7378 </td><td></td></tr><tr><td> Β-glicerofosfato </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9891 </td><td></td></tr><tr><td> L-ascorbico 2-fosfato </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A8960 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Ponteggio </td><td> Pharmacia &amp; Upjohn Co. </td><td> 09-0315-08 </td><td></td></tr><tr><td> Cellule staminali mesenchimali umane </td><td> Cella linea </td><td> Lonza </td><td> PT-2501 </td><td></td></tr><tr><td> 9.4T MR Scanner </td><td> Attrezzatura </td><td> Agilent </td><td></td><td> 400MHz WB </td></tr><tr><td> 10 millimetri Litz Coil </td><td> Attrezzatura </td><td> Doty Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser Doppler Vibrometro </td><td> Attrezzatura </td><td> Polytec </td><td> PDV-100 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrosoft (20) </td><td> Software </td><td> Polytec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Generatore di funzioni </td><td> Attrezzatura </td><td> Agilent </td><td> AFG 3022B </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore </td><td> Attrezzatura </td><td> Piezo inc </td><td> EPA-104-115 </td><td></td></tr><tr><td> Piezo flessione del motore </td><td> Attrezzatura </td><td> Piezo inc. </td><td> T234-A4Cl-203X </td><td></td></tr><tr><td> Computer-Linux </td><td> Attrezzatura </td><td> Processore: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Computer-Windows </td><td> Attrezzatura </td><td> Processore: Intel Core 2 Duo E8400 Memoria: 2G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> Software </td><td> The MathWorks, inc </td><td></td><td> 2009b </td></tr></tbody></table>

magnetic resonance elastography methodology for the evaluation of tissue engineered construct growth

Tradizionale test meccanico comporta spesso la distruzione del campione, e in caso di lungo termine ingegneria tessutale costruire studi, l&#39;uso di valutazione distruttivo non è accettabile. Un&#39;alternativa proposta è l&#39;uso di un processo di imaging chiamata elastografia risonanza magnetica. Elastografia è un metodo non distruttivo per determinare l&#39;esito ingegnerizzato misurando locali valori delle proprietà meccaniche (ad esempio, complesso modulo di taglio), che sono essenziali per identificare marcatori la struttura e la funzionalità di un tessuto. Come mezzo non invasive per la valutazione, il monitoraggio dei costrutti ingegnerizzati con modalità di imaging come la risonanza magnetica (MRI) ha visto un crescente interesse negli ultimi dieci anni 1. Ad esempio, i risonanza magnetica (MR) tecniche di diffusione e rilassometria sono stati in grado di caratterizzare le variazioni chimiche e fisiche durante lo sviluppo tessutale 2. Il metodo proposto inil protocollo seguente utilizza microscopico elastografia risonanza magnetica (μMRE) come una tecnica non invasiva MR base per misurare le proprietà meccaniche di piccole tessuti molli 3. MRE è ottenuta mediante accoppiamento di un attuatore meccanico sonora con il tessuto di interesse e registrare la propagazione delle onde di taglio con uno scanner MR 4. Recentemente, è stato applicato μMRE nell&#39;ingegneria dei tessuti per acquisire informazioni essenziali crescita che viene tradizionalmente misurata utilizzando tecniche meccaniche distruttive macroscopici 5. Nella procedura seguente, elastografia è ottenuta attraverso l&#39;imaging di costrutti ingegnerizzati con Hahn modificato spin-echo sequenza accoppiato con un attuatore meccanico. Come mostrato in figura 1, la sequenza modificata sincronizza acquisizione delle immagini con la trasmissione di onde di taglio esterni, successivamente, il movimento è sensibilizzato attraverso l&#39;uso di oscillante coppie bipolari. Dopo raccolta di immagini con moto sensibi positive e negativezione, complessa divisione dei dati produrre un&#39;immagine delle onde di taglio. Poi, l&#39;immagine è valutata utilizzando un algoritmo di inversione per generare una mappa di taglio rigidità 6. Le misure ottenute in ciascun voxel hanno mostrato di forte correlazione (R 2&gt; 0,9914) con i dati raccolti usando analisi meccanica dinamica 7. In questo studio, elastografia è integrata nel processo di sviluppo per monitorare tessuto umano cellule staminali mesenchimali (MSC h) differenziazione in costrutti adipogenica e osteogenica come mostrato in Figura 2.

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

La procedura dimostra la metodologia di elastografia risonanza magnetica per monitorare l&#39;esito di ingegneria del tessuto adiposo e costrutti osteogeniche ingegneria non invasiva attraverso la valutazione locale delle proprietà meccaniche utilizzando microscopici elastografia risonanza magnetica (μMRE).

Metodologia Elastografia risonanza magnetica per la valutazione dei Tissue Engineered Construct crescita

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Views.  University of Nebraska-Lincoln. La procedura dimostra la metodologia di elastografia risonanza magnetica per monitorare l'esito di ingegneria del tessuto adiposo e costrutti osteogeniche ingegneria non invasiva attraverso la valutazione locale delle proprietà meccaniche utilizzando microscopici elastografia risonanza magnetica (μMRE).

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Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of tri-leaflet polymer valve prostheses. However, identification of a protocol for initial assessment of polymer valve hydrodynamic functionality is paramount during the early stages of the design process. Traditional in vitro pulse duplicator systems are not configured to accommodate flexible tri-leaflet materials; in addition, assessment of polymer valve functionality needs to be made in a relative context to native and prosthetic heart valves under identical test conditions so that variability in measurements from different instruments can be avoided. Accordingly, we conducted hydrodynamic assessment of i) native (n = 4, mean diameter, D = 20 mm), ii) bi-leaflet mechanical (n= 2, D = 23 mm) and iii) polymer valves (n = 5, D = 22 mm) via the use of a commercially available pulse duplicator system (ViVitro Labs Inc, Victoria, BC) that was modified to accommodate tri-leaflet valve geometries. Tri-leaflet silicone valves developed at the University of Florida comprised the polymer valve group. A mixture in the ratio of 35:65 glycerin to water was used to mimic blood physical properties. Instantaneous flow rate was measured at the interface of the left ventricle and aortic units while pressure was recorded at the ventricular and aortic positions. Bi-leaflet and native valve data from the literature was used to validate flow and pressure readings. The following hydrodynamic metrics were reported: forward flow pressure drop, aortic root mean square forward flow rate, aortic closing, leakage&#160;and regurgitant volume, transaortic closing, leakage, and total energy losses. Representative results indicated that hydrodynamic metrics from the three valve groups could be successfully obtained by incorporating a custom-built assembly into a commercially available pulse duplicator system and subsequently, objectively compared to provide insights on functional aspects of polymer valve design.

There has been renewed interest in developing polymer valves. Here, the objectives are to demonstrate the feasibility of modifying a commercial pulse duplicator to accommodate tri-leaflet geometries and to define a protocol to present polymer valve hydrodynamic data in comparison to native and prosthetic valve data collected under near-identical conditions.

Protocollo per la relativa valutazione idrodinamica del Tri-volantino Polymer Valvole

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Ricerca

Bioingegneria

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large animal model. A step by-step protocol for inter-positional placement of the TEV and real-time digital assessment of the TEV and native carotid arteries is described here. In vivo monitoring is made possible by the implantation of flow probes, catheters and ultrasonic crystals (capable of recording dynamic diameter changes of implanted TEVs and native carotid arteries) at the time of surgery. Once implanted, researchers can calculate arterial blood flow patterns, invasive blood pressure and artery diameter yielding parameters such as pulse wave velocity, augmentation index, pulse pressures and compliance. Data acquisition is accomplished using a single computer program for analysis throughout the duration of the experiment. Such invaluable data provides insight into TEV matrix remodeling, its resemblance to native/sham controls and overall TEV performance in vivo.

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

A step-by-step protocol for the inter-positional placement of Tissue Engineered Vessels (TEVs) into the carotid artery of a sheep using end-to-end anastomosis and real-time digital assessment in vivo until animal sacrifice.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atimico Rat modello per la valutazione di Engineered legamento crociato anteriore Innesti

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

Polielettrolita complesso per eparina vincolante fattore di crescita Osteogenica dominio di consegna

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

Automated Analysis Contrazione di ingegneria dei tessuti umani Cuore per lo screening cardiaco Drug Safety

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Supporto metabolico di asportato, tessuti di cervello viventi durante l'acquisizione di microscopia a risonanza magnetica

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue shape. Manipulating tissue shape on the micrometer to centimeter scale can direct cell alignment, alter effective mechanical properties, and address limitations related to nutrient diffusion. In addition, the vessel in which a tissue is prepared can impart mechanical constraints on the tissue, resulting in stress fields that can further influence both the cell and matrix structure. Shaped tissues with highly reproducible dimensions also have utility for in vitro assays in which sample dimensions are critical, such as whole tissue mechanical analysis.
This manuscript describes an alternative fabrication method utilizing negative master molds prepared from laser etched acrylic: these molds perform well with polydimethylsiloxane (PDMS), permit designs with dimensions on the centimeter scale and feature sizes smaller than 25 &#181;m, and can be rapidly designed and fabricated at a low cost and with minimal expertise. The minimal time and cost requirements allow for laser etched molds to be rapidly iterated upon until an optimal design is determined, and to be easily adapted to suit any assay of interest, including those beyond the field of tissue engineering.

Herein we present a rapid, facile, and low-cost method for fabricating custom polydimethylsiloxane molds that can be used for producing hydrogel-based engineered tissues with complex geometries. We additionally describe results from mechanical and histological assessments conducted on engineered cardiac tissues produced using this technique.

Abitudine costruita stampi di coltura del tessuto da maestri inciso al Laser

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Manufacturing Abdominal Aorta Hydrogel Tissue-Mimicking Phantoms for Ultrasound Elastography Validation

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the tissue motion and infer or quantify the underlying biomechanical characteristics. For abdominal aortic aneurysms (AAA), biomechanical properties such as changes in the tissue's elastic modulus and estimates of the tissue stress may be essential for assessing the need for the surgical intervention. Abdominal aortic aneurysms US elastography could be a useful tool to monitor AAA progression and identify changes in biomechanical properties characteristic of high-risk patients.
A preliminary goal in the development of an AAA US elastography technique is the validation of the method using a physically relevant model with known material properties. Here we present a process for the production of AAA tissue-mimicking phantoms with physically relevant geometries and spatially modulated material properties. These tissue phantoms aim to mimic the US properties, material modulus, and geometry of the abdominal aortic aneurysms. Tissue phantoms are made using a polyvinyl alcohol cryogel (PVA-c) and molded using 3D printed parts created using computer aided design (CAD) software. The modulus of the phantoms is controlled by altering the concentration of PVA-c and by changing the number of freeze-thaw cycles used to polymerize the cryogel. The AAA phantoms are connected to a hemodynamic pump, designed to deform the phantoms with the physiologic cyclic pressure and flows. Ultra sound image sequences of the deforming phantoms allowed for the spatial calculation of the pressure normalized strain and the identification of mechanical properties of the vessel wall. Representative results of the pressure normalized strain are presented.

Here we describe a method to manufacture aneurysmal, aortic tissue-mimicking phantoms for the use in testing ultrasound elastography. The combined use of computer-aided design (CAD) and 3-dimensional (3D) printing techniques produce aortic phantoms with predictable, complex geometries to validate the elastographic imaging algorithms with controlled experiments.

Aorta addominale idrogel che imita tessuto di fabbricazione fantocci per convalida Elastografia ad ultrasuoni

Ultrasound (US) elastography, or elasticity imaging, is an adjunct imaging technique that utilizes sequential US images of soft tissues to measure the ...

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional tissue. Tissue engineering holds great promise as a potential solution with its ability to integrate cells and signaling molecules into a 3-dimensional scaffold. Recent work with tissue engineered tracheal grafts (TETGs) has seen some success but their translation has been limited by graft stenosis, graft collapse, and delayed epithelialization. In order to investigate the mechanisms driving these issues, we have developed a mouse model for tissue engineered tracheal graft implantation. TETGs were constructed using electrospun polymers polyethylene terephthalate (PET) and polyurethane (PU) in a mixture of PET and PU (20:80 percent weight). Scaffolds were then seeded using bone marrow mononuclear cells isolated from 6-8 week-old C57BL/6 mice by gradient centrifugation. Ten million cells per graft were seeded onto the lumen of the scaffold and allowed to incubate overnight before implantation between the third and seventh tracheal rings. These grafts were able to recapitulate the findings of stenosis and delayed epithelialization as demonstrated by histological analysis and lack of Keratin 5 and Keratin 14 basal epithelial cells on immunofluorescence. This model will serve as a tool for investigating cellular and molecular mechanisms involved in host remodeling.

Graft stenosis poses a critical obstacle in tissue engineered airway replacement. To investigate cellular mechanisms underlying stenosis, we utilize a murine model of tissue engineered tracheal replacement with seeded bone marrow mononuclear cells (BM-MNC). Here, we detail our protocol, including scaffold manufacturing, BM-MNC isolation, graft seeding, and implantation.

Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...