Ringraziamo la condivisione open-source di MATLAB codice particella di monitoraggio fornito da Maria Kilfoil ( <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), insieme al codice precedente IDL e ampia documentazione fornita da John C. Crocker e Eric R. settimane. Questo lavoro è stato reso possibile da un finanziamento dal National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 e R00CA155045 (PI: JPC).

1. Spheroids Culturing tumorali <ol><li> Miscelare 10 ml di acqua di grado coltura cellulare con 0,1 g di agarosio per ottenere una soluzione di agarosio all&#39;1%. </li><li> Soluzione di agarosio calore sopra 70 ° C (circa 14 secondi in un forno a microonde standard o mediante una piastra riscaldante) prima aliquotando 40 ml di soluzione di agarosio in un pozzo su una piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C per almeno 1 ora mentre la raccolta delle cellule usando tecniche standard. </li><li> Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione di cellule in sospensione. </li><li> Diluire sospensione cellulare a 1000 cellule / ml e aggiungere 100 ml di tale diluizione al pozzetto contenente il letto di agarosio guarito. </li><li> Porre il campione in un agitatore durante la notte in un incubatore a 37 ° 5% di CO 2 C e. </li><li> Rimuovere il campione dal shaker e aggiungere 100 ml di coltura cellulare multimediale. </li><li> Incubare sferoidi fino al raggiungimento del diametro desiderato. Ad esempio, dopo 9 giorni, una spheroid saranno circa 450 micron di diametro. Durante questo tempo, mezzi di crescita fresco può essere aggiunto ai pozzetti ma l&#39;aspirazione deve essere evitata poiché questo provocherà rimozione dello sferoide. </li></ol> 2. Preparazione Spheroids tumorali 3D incorporati in ECM <ol><li> Preparare una stazione di lavoro con materiali necessari all&#39;interno di una cappa a flusso laminare. </li><li> Preparare una miscela diluita di 1 micron di diametro sonde traccianti fluorescenti carbossilato modificato con l&#39;aggiunta di sonde 2 parti di riserva (2% solidi) a 25 parti di acqua sterile. </li><li> Rimuovere una bottiglia di 3,1 mg / ml di collagene bovino dal frigorifero e posizionarlo sul ghiaccio. </li><li> Aliquota 125 ml di collagene in un vuoto flaconcino da 2 ml. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione della sonda tracciante diluito al flaconcino contenente il collagene e vortice brevemente per distribuire le sonde. </li><li> Aggiungere 235 ml di appropriati mezzi di coltura cellulare contenente rosso fenolo (che diventa giallo) per un volume totale di 410 ml e vortex brevemente prima di togliere 205 ml (metà del volume totale) e l&#39;immissione in un nuovo flaconcino da 2 ml. Vial 1 conterrà sferoide tumore e Vial 2 sarà un misto di controllo. </li><li> Aggiungi ~ 2 ml di 1 M NaOH al flaconcino 1 per portare nuovamente la soluzione a pH neutro (terreni di coltura contenente rosso fenolo dovrebbe tornare al rosso). Si noti che questo causerà la miscela per iniziare curare se non è tenuta in ghiaccio. Vortex brevemente per mescolare, per poi tornare a cremagliera ghiaccio immediatamente. NOTA: Il sferoide è appena visibile ad occhio nudo, dopo 9 giorni di cultura e la sua rimozione dal letto agarosio è un compito delicato. L&#39;uso di un microscopio dissezione può essere utile per alcuni utenti. Mantenendo l&#39;integrità dello sferoide durante il trasferimento è fondamentale. </li><li> Usando una pipetta a bocca larga, rimuovere delicatamente 40 ml di supporto dal pozzetto contenente il sferoide tumore. Conservare questo 40 microlitri mentre conduceva il passo successivo. </li><li> Controllare il bene per vedere se sferoideè stato rimosso nel passaggio precedente. Se fosse, aggiungere 40 microlitri contenenti sferoide a Fiala 1. Caso contrario, posizionare i 40 microlitri di nuovo nel bene e ripetere il passaggio precedente. </li><li> Mescolare delicatamente Vial 1 (non rischiare vortex, può danneggiare la sferoide) prima di trasferire il composto in 60 porzioni microlitri in tre pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Ispezionare ciascun pozzetto con un microscopio dopo l&#39;aggiunta di miscela per determinare quale contiene ben sferoide. </li><li> Aggiungere 2 microlitri ~ 1 M NaOH e 40 ml di coltura cellulare multimediale a fiala 2 e vortex prima aliquotting 60 ml di questa miscela in un pozzo vuoto nella piastra a 96 pozzetti e l&#39;etichettatura come controllo. </li><li> Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per la cura per almeno 1 ora. </li></ol> 3. Costruire Rete di Punti di campionamento e di prendere un video in ogni punto <ol><li> Trasferire la piastra campione dal incubatrice al palco microscopio. Lasciare 10 minuti per il campione EQUILibrate con la temperatura ambiente se una fase riscaldata non è disponibile. </li><li> Osservare il campione con bassi lenti dell&#39;obiettivo alimentati per assicurarsi che sia integro e pronto per l&#39;imaging. Determinare la posizione del tumore all&#39;interno del pozzo. </li><li> Decidere quanti punti di campionamento per prendere. Tipicamente, 20 punti di campionamento in ciascun pozzetto, distribuiti in anelli concentrici intorno alla sferoide produrranno risultati sufficientemente dettagliati. </li><li> Spostare il palco per ciascuna posizione desiderata e utilizzare il microscopio interfacciamento software per registrare le coordinate xey (o le coordinate registrare manualmente se interfacciare il software non è disponibile). </li><li> Passare il microscopio per una lente obiettivo alta potenza (tipicamente 100X), e selezionare il cubo filtro appropriato per la lunghezza d&#39;onda di eccitazione delle sonde traccianti. Utilizzare l&#39;elenco dei punti creati nel passaggio 3.4 per passare al primo punto nella griglia. </li><li> Regolare il fuoco per trovare il fondo del pozzo, poi passare a trovare un campo di vista (FOV) contenente vari trac a fuocoer sonde. </li><li> Osservare l&#39;istogramma intensità e regolare l&#39;intensità di esposizione e il tempo per dare possibile la più ampia gamma dinamica, garantendo nel contempo che l&#39;immagine non diventa satura. </li><li> Ottenere una sequenza video con un frame rate di 20-30 msec per fotogramma (circa 800 fotogrammi o 16-24 sec di lunghezza si raccomanda di fornire statistiche sufficienti per robusto calcolo MSD bilanciato con la necessità di ridurre al minimo il tempo di acquisizione in ogni punto della griglia spaziale) e salvare con una apposita convenzione. Durante la registrazione, non toccare il microscopio o un tavolo. </li><li> Ripetere i passaggi 3,6-3,9 per ogni punto campione nella griglia. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,10 per ogni bene per l&#39;esperimento. </li></ol> 4. Analisi Video dati per calcolare le proprietà reologiche in ogni punto del campione <ol><li> Copiare tutti i dati video a una cartella di analisi (possibilmente su un computer diverso). </li><li> Importazione di dati immagine in MATLAB o altri software di analisi. NOTE: Ampia documentazione riguardante la serie di MATLAB particelle routine di rilevamento adottato qui è disponibile a <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Si raccomanda l&#39;uso di una funzione telefonica personalizzata per automatizzare l&#39;elaborazione di più file in posizioni diverse. </li><li> Calibrare il software analizzando diversi fotogrammi del video per determinare adeguatamente selezione e rifiuto parametri (dimensioni, passa-banda, ecc) per individuare posizioni centrali della sonda. Sfondo esteso per questi passaggi cruciali è descritto da Crocker e Grier. </li><li> Utilizzare il software per determinare automaticamente ogni posizione della sonda per tutti i fotogrammi e quindi collegare queste posizioni in traiettorie. </li><li> Utilizzare i dati di traiettoria per calcolare lo spostamento quadratico medio (MSD) in funzione del tempo di ritardo, avendo cura di applicare il fattore di calibrazione spaziale appropriata (micron per pixel) per la lente obiettivo specifico, ogni pixel binning, ecc (normalmente effettuatenel meta-dati). </li><li> Calcola G * (utilizzando il generalizzato relazione di Stokes-Einstein presi in considerazione i limiti di applicabilità di GSER per un particolare campione 24,28,43. In alternativa, gli utenti potrebbero voler interpretare le proprietà ECM direttamente da MSD, semplicemente confrontando legge di potenza di scala, plateau valori, indici di eterogeneità o di altri parametri. </li><li> Ripetere i passaggi da 4.2 tramite 4.6 per ogni FOV nell&#39;esperimento. </li><li> Co-registrati i dati di posizione dal punto 3.4 con modulii viscoelastico ad una particolare frequenza di interesse. A seconda del produttore del microscopio utilizzato, questo passo può essere facilitato da una routine personalizzata che legge i metadati microscopio o posizione dati possono essere tabulati manualmente. </li><li> Utilizzare le funzioni di interpolazione 3D per generare una reologia mappa spaziale della ECM. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In questo protocollo si introduce una strategia robusta e ampiamente applicabile per longitudinalmente rilevamento delle modifiche locali in ECM rigidità nei modelli tumorali 3D. Prevediamo che questa metodologia possa essere adottato da biologi cancro e biofisici interessati nel comportamento meccanosensibili implicati nel rimodellamento della matrice durante la crescita del tumore e dei processi di invasione. Quantificazione precisa di matrice cinetica di degradazione possa essere particolarmente utile a coloro che s...

E &#39;chiaro da una crescente evidenza nella letteratura che le cellule tumorali, come con le cellule epiteliali di mammifero non maligne, sono molto sensibili alle proprietà meccaniche e biofisiche della matrice extracellulare circostante (ECM) e altri componenti del microambiente 1-9. Studi meccanicistici eleganti hanno fornito informazioni sul ruolo di rigidità extracellulare come partner segnalazione meccanosensibili complesso che regola il comportamento crescita maligna e la morfogenesi 2,3,10,11. Questo lavoro è stato facilitato in particolare dallo sviluppo del 3D in modelli tumorali in vitro che ripristinano biologicamente architettura dei tessuti rilevante e possono essere coltivate in materiali impalcatura con la meccanica accordabili e ripreso da microscopia ottica 12-19. Tuttavia, l&#39;altro lato di questa finestra mechanoregulatory tra tumore e microambiente, attraverso il quale le cellule tumorali a sua volta modificare la reologia del loro ambiente, rimane alquantopiù difficile da studiare. Ad esempio, durante i processi di invasione, cellule alla periferia di un tumore possono subire la transizione epitelio mesenchimale (EMT) e aumentare l&#39;espressione delle metalloproteasi della matrice (MMPs) che causano degradazione locale di ECM 20-22, che a sua volta influenza il comportamento di crescita di meccanosensibili altre cellule tumorali prossimali. Attraverso una serie di processi biochimici, cellule tumorali continuamente comporre la rigidità locale del loro ambiente su e giù secondo processi differenti in momenti diversi. La metodologia qui descritta è motivata dalla necessità di strumenti analitici che segnalano variazioni locali nella rigidità e la conformità della ECM durante la crescita, che possono essere integrati con i modelli tumorali in 3D e correlati longitudinalmente con i cambiamenti biochimici e fenotipiche senza terminare la cultura. Alla ricerca di una tecnica appropriata per l&#39;attuazione in questo contesto, microrheology particella-tracking (PTM) emerge come un candidato forte.Questo metodo, sperimentato originariamente da Mason e Weitz 23,24, utilizza il movimento delle sonde traccianti incorporati in un fluido complesso per segnalare il modulo complesso dipendente dalla frequenza viscoelastico taglio, G * (ω) su scale micron. Questo approccio generale è stato sviluppato con diverse variazioni adatti per diverse applicazioni in morbidi Materia Condensata, colloidi, biofisica e fisica dei polimeri 25-31. PTM presenta alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi, poiché letture di viscoelasticità locale sono ottenute dalla non distruttiva immagini video di sonde traccianti biochimicamente inattivi che sono incorporati al momento della preparazione cultura e rimangono sul posto per periodi prolungati di crescita. Questo è in contrasto con misure standard oro con un taglio oscillante rinfusa reometro, che richiede necessariamente la cessazione della cultura e riporta la reologia macroscopico massa del campione piuttosto che misurazioni di punti all&#39;interno del complesso microenvir tumore 3Dbiente. Infatti numerosi studi hanno dimostrato l&#39;utilità di interpretazione delle misure di movimenti sonda tracciante ao vicino cellule tumorali o non tumorali per misurare deformazioni associati migrazione cellulare 32, stress meccanico indotto da uno sferoide espansione 33, reologia intracellulare 34,35, e per mappare sollecitazioni meccaniche nei tessuti ingegnerizzati 36, e della relazione tra dimensione dei pori e la velocità dell&#39;invasione 37. Altre tecniche adatte per microrheology, quali microscopia a forza atomica (AFM) possono essere realizzate, ma soprattutto per sondare punti alla superficie del campione, oppure possono rappresentare coltura problemi di sterilità che complicano misurazioni longitudinali 38. Qui, descriviamo un protocollo completo che comprende metodi per la crescita di sferoidi tumorali 3D adatti per il trasferimento in ECM con sonde fluorescenti embedded per il video di particelle di tracciamento e di analisi per la mappatura attendibile spazialecambiamenti nella microrheology nel tempo nella cultura. Nel presente di attuazione, modelli tumorali 3D sono coltivate in formato più pozzetti con vista verso l&#39;incorporazione di misure microrheology con altri metodi tradizionali (ad esempio, citotossicità), che questo formato è favorevole al. In questa illustrazione rappresentativo di questa metodologia che coltura in vitro sferoidi 3D in Uso PANC-1 le cellule, una linea cellulare di cancro del pancreas stabilito noto per formare sferoidi 39, ma tutte le misurazioni qui descritti sono largamente applicabile per studiare di tumori solidi utilizzando una varietà di linee cellulari adatto per la cultura 3D. Poiché si basa Imaging-questo metodo intrinsecamente è ideale per la co-registrazione dei dati microrheology ad alta risoluzione con grandi campi a luce trasmessa di vista che segnalano cambiamenti nella crescita delle cellule, la migrazione e fenotipo. L&#39;attuazione del PTM integrato con microscopia ottica trasmessa in questo modo assume un posizionamento riproducibile dei wh palco microscopioich è in genere disponibile sul motorizzati commerciale epifluorescenza widefield microscopi biologici. Il protocollo messo a punto sotto può essere realizzata con qualsiasi fluorescenza automatizzato microscopio biologico ragionevolmente attrezzata. Questo è un metodo ad alta intensità di dati intrinsecamente, che richiede l&#39;acquisizione di gigabyte di dati microscopia video digitale per l&#39;elaborazione offline. Nella seguente protocollo, protocollo 1 riguarda la preparazione iniziale di sferoidi tumorali che viene descritto qui utilizzando overlay su agarosio ma potrebbero essere sostituiti con una varietà di altri metodi come appendere goccia 40, o coltura rotante 41 tecniche. Protocollo 2 descrive il processo di inserimento sferoidi in un&#39;impalcatura di collagene però in alternativa, in vitro tumori 3D in potessero essere coltivate da incapsulamento o incorporamento di cellule risospese in ECM 12,15, piuttosto che singoli sferoidi non aderenti pre-formate. Protocolli successivi descrivono le procedure per OOME OTTENERE misurazioni microrheology risolta in tempo per l&#39;acquisizione e l&#39;elaborazione dei dati di microscopia video, rispettivamente. Il trattamento dei dati è descritta utilizzando MATLAB, facendo uso di routine open source per PTM costruita su algoritmi originariamente descritti da Crocker e Grier 42, che sono anche stati ampiamente sviluppati per piattaforme software differenti (vedi http://www.physics.emory.edu/ ~ settimane / idl /).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="779">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:177px;">Bovine type 1 collagen</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences, San Jose, California</td>
			<td style="width:100px;">354231</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PANC-1</td>
			<td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td>
			<td>CRL1469</td>
			<td>or other appropriate cell type</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microspheres</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, California</td>
			<td>906906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences, Bedford MA</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>C12H18O9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td>
			<td>NC0480985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-well Imaging plates</td>
			<td>Corning Inc., Corning, NY</td>
			<td>3904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Hyclone, Waltham, MA</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>or appropriate&#160; cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Zeiss AxioObsever Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>includes high-speed camera and imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MATLAB software</td>
			<td>The Mathworks, Natick, MA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

longitudinal measurement of extracellular matrix rigidity in 3d tumor models using particle-tracking microrheology

Il microambiente meccanico ha dimostrato di agire come un regolatore cruciale del comportamento di crescita tumorale e di segnalazione, che è a sua rinnovato e modificato come parte di una serie di complesse interazioni bidirezionale mechanosensitive. Mentre lo sviluppo di biologicamente rilevanti modelli tumorali 3D hanno facilitato studi meccanicistici sull&#39;impatto della reologia matrice sulla crescita del tumore, il problema inverso dei cambiamenti di mappatura dell&#39;ambiente meccanica indotta da tumori rimane difficile. Qui, descriviamo l&#39;attuazione di particella inseguimento microrheology (PTM) in combinazione con i modelli 3D di cancro pancreatico come parte di un approccio efficaci e validi per monitorare longitudinalmente cambiamenti fisici nel microambiente tumorale, in situ. La metodologia qui descritta integra un sistema di preparazione di modelli in vitro 3D incorporato in un modello di matrice extracellulare (ECM) scaffold di collagene di tipo I con sonde fluorescente distribuiti uniformemente per Po-zione e tempo-dipendenti misurazioni microrheology in tutto il campione. tumori in vitro sono placcati e sondate in condizioni parallele utilizzando lastrine pozzetti. Basandosi su metodi stabiliti, i video dei movimenti della sonda traccianti vengono trasformati tramite il Relation Generalized Stokes Einstein (GSER) per segnalare il complesso dipendente dalla frequenza viscoelastica modulo di taglio, G * (ω). Poiché questo approccio è l&#39;imaging-based, caratterizzazione meccanica è anche mappato su grandi campi spazio-luce trasmessa per segnalare contemporaneamente i cambiamenti qualitativi in ​​termini di dimensioni e fenotipo tumorale 3D. Risultati rappresentativi mostrano contrastanti risposta meccanica in sottoregioni associati localizzata degradazione della matrice invasione indotta e calibrazione del sistema, dati di convalida sono presentati. Esiti indesiderati da errori sperimentali comuni e la risoluzione dei problemi di questi problemi sono anche presentati. Il formato da 96 pozzetti placcatura cultura 3D realizzato in questo protocollo è conducive alla correlazione delle misure microrheology con test di screening terapeutici o imaging molecolare per acquisire nuove intuizioni impatto dei trattamenti o stimoli biochimici sul microambiente meccanico.

Per verificare la validità di G * (ω) misurazioni in posizioni localizzate all&#39;interno di un complesso microambiente modello di tumore, sono stati condotti due esperimenti di validazione iniziali. In primo luogo, abbiamo cercato di validare le nostre misure contro il &quot;gold standard&quot; della massa oscillante taglio reometria. Abbiamo preparato campioni identici di matrice di collagene (senza cellule) ad una concentrazione di 1,0 mg / ml di collagene. Questi campioni sono stati sondati con un reomet...

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Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.4K Views.  University of Massachusetts Boston.  Microrheology-particella di monitoraggio può essere utilizzato per non distruttivo quantificare e spazialmente mappare i cambiamenti nella matrice extracellulare proprietà meccaniche in modelli tumorali 3D. 

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Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Ricerca

Bioingegneria

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Microtubules are cytoskeletal polymers which play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires microtubules that are stiff and straight enough to span a significant fraction of the cell diameter. As a result, the microtubule persistence length, a measure of stiffness, has been actively studied for the past two decades1. Nonetheless, open questions remain: short microtubules are 10-50 times less stiff than long microtubules2-4, and even long microtubules have measured persistence lengths which vary by an order of magnitude5-9.
	Here, we present a method to measure microtubule persistence length. The method is based on a kinesin-driven microtubule gliding assay10. By combining sparse fluorescent labeling of individual microtubules with single particle tracking of individual fluorophores attached to the microtubule, the gliding trajectories of single microtubules are tracked with nanometer-level precision. The persistence length of the trajectories is the same as the persistence length of the microtubule under the conditions used11. An automated tracking routine is used to create microtubule trajectories from fluorophores attached to individual microtubules, and the persistence length of this trajectory is calculated using routines written in IDL.
	This technique is rapidly implementable, and capable of measuring the persistence length of 100 microtubules in one day of experimentation. The method can be extended to measure persistence length under a variety of conditions, including persistence length as a function of length along microtubules. Moreover, the analysis routines used can be extended to myosin-based acting gliding assays, to measure the persistence length of actin filaments as well.

A method to measure the persistence length or flexural rigidity of biopolymers is described. The method uses a kinesin-driven microtubule gliding assay to experimentally determine the persistence length of individual microtubules and is adaptable to actin-based gliding assays.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Migliorare 2D e 3D della pelle<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli con Macromolecole affollamento

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Hydrogel Arrays Enable Increased Throughput for Screening Effects of Matrix Components and Therapeutics in 3D Tumor Models

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes and therapeutic responses. Accounting for matrix effects earlier in the drug development pipeline is expected to increase the likelihood of clinical success of novel therapeutics. Biomaterial-based strategies recapitulating specific tissue microenvironments in 3D cell culture exist but integrating these with the 2D culture methods primarily used for drug screening has been challenging. Thus, the protocol presented here details the development of methods for 3D culture within miniaturized biomaterial matrices in a multi-well plate format to facilitate integration with existing drug screening pipelines and conventional assays for cell viability. Since the matrix features critical for preserving clinically relevant phenotypes in cultured cells are expected to be highly tissue- and disease-specific, combinatorial screening of matrix parameters will be necessary to identify appropriate conditions for specific applications. The methods described here use a miniaturized culture format to assess cancer cell responses to orthogonal variation of matrix mechanics and ligand presentation. Specifically, this study demonstrates the use of this platform to investigate the effects of matrix parameters on the responses of patient-derived glioblastoma (GBM) cells to chemotherapy.

The present protocol describes an experimental platform to assess the effects of mechanical and biochemical cues on chemotherapeutic responses of patient-derived glioblastoma cells in 3D matrix-mimetic cultures using a custom-made UV illumination device facilitating high-throughput photocrosslinking of hydrogels with tunable mechanical features.

Gli array di idrogel consentono una maggiore produttività per gli effetti di screening dei componenti della matrice e delle terapie nei modelli tumorali 3D

Cell-matrix interactions mediate complex physiological processes through biochemical, mechanical, and geometrical cues, influencing pathological changes ...