Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di studio Wellcome Trust senior assegnato al Dr. Ian Goodfellow.

1. Generazione di linee cellulari: pMEP4 trasfezione / espressione <ol><li> Trasfezione delle cellule con il vettore di espressione pMEP4 e selezionare con 100 microgrammi di igromicina B / ml (Roche) fino a quando tutte le cellule mock trasfettate sono state uccise. Il plasmide viene mantenuta pMEP4 episomally quindi non è necessario isolare cloni specifici. </li><li> Le cellule contenenti il vettore pMEP4 può essere indotta mediante trattamento con 10 pM CDCl 2 per 16 ore. Espressione e inducibilità dovrebbe essere confermato su piccola scala prima amplificazione delle linee cellulari. Il TAP-tag proteina può essere facilmente rilevato come i domini della proteina G si legano agli anticorpi da quasi tutte le specie. Per grandi purificazioni tipicamente 10 confluenti 175 cm 2 flaconi di cellule sono obbligatori. Ciò equivale a circa 2 X10 8 cellule che esprimono. </li></ol> 2. Cella lisati <ol><li> Raschiare le cellule in PBS e combinare in un unico tubo da 50 ml. Spin 1200X gfo 5 minuti (questo dovrebbe tradursi in 2-3 ml di emazie concentrate per cominciare, che si riduce a circa 1,5 ml dopo il lavaggio). </li><li> Lavare le cellule per tre volte in PBS ghiacciato (50 ml ogni volta). </li><li> Lisare le cellule in 5 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl 2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 e inibitore della proteasi ). Nota: NaF, Na 3 VO 4 e inibitori di proteasi dovrebbero essere aggiunti fresco. Pipettare su e giù per 10 volte prima di partire per 5 minuti su ghiaccio. Siringa volte su e giù per 5-10 con un ago senza punta prima di ripartire in ghiaccio per 5 minuti su ghiaccio. Ripetere siringare e lasciare per altri 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Freeze-scongelare il lisato due volte (ghiaccio liquido N 2 / o secco e etanolo). Non permettere che il campione raggiunga la maggiore di 4 ° C. Nota: è possibile memorizzare il campione a -80 ° C fino a quando non ha il tempo di elaborare. </li><li> Cellule aliquote del campione in provette da 1,5 ml e rimuovere non lisate e debris per centrifugazione (10 minuti a 4 ° C, X 16.000 g). </li><li> Recuperare il surnatante, si fondono in un tubo di 15 ml Falcon e (opzionalmente) passano attraverso un filtro da 0,45 micron prima di prendere un campione di 20 microlitri per la quantificazione delle proteine ​​rendimento. Rimuovere una ulteriore aliquota 50 microlitri per successiva analisi (Campione 1). </li></ol> 3. Associazione a coniglio IgG-agarosio (Nota: Tutti i giri deve essere effettuata a 1200X g in una centrifuga refrigerata a 4 ° C per 1 minuto, se non diversamente indicato) <ol><li> Risospendere delicatamente il IgG-agarosio coniglio soluzione (Sigma-Aldrich) agitando bottiglia. Prendete 380 microlitri di IgG agarosio (con un taglio 1ml punta della pipetta) e rimuovere la distribuzione / soluzione conservante per centrifugazione per 1 minuto. Lavare le tre volte agarosio in tampone di lisi freddo (4 ° C) mediante centrifugazione per chiarire. La resa finale di agarosio dovrebbe essere di circa 250 pl di perline confezionati. </li><li> Aggiungere il lisato cellulare eliminato dal 2,6 (in una vasca da 15 ml Falcone) la lavata-IgG di coniglio agarosio ed incubare per 3 ore (o per una notte) a 4 ° C usando un miscelatore rotante. </li><li> Centrifugare le perline di agarosio per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il supernatante per la successiva analisi (Campione 2). Nota: Il TAP tag proteine ​​dovrebbe essere associato con le sfere. </li></ol> 4. Proteasi TEV cleavage (Nota: Tutti i giri deve essere effettuata a 1200X g in una centrifuga refrigerata a 4 ° C per 1 minuto, se non diversamente indicato) <ol><li> Lavate il coniglio IgG perle di agarosio tre volte in tampone di lisi freddo (4 ° C) mediante centrifugazione per chiarire (nota: il buffer di lisi non deve contenere inibitori della proteasi). Si deve prestare attenzione a non rimuovere o perdere eventuali microsfere durante le fasi di lavaggio. </li><li> Lavare le perline altre due volte con tampone TEV-proteasi clivaggio (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, e 0,2% NP-40) mediante centrifugazione per chiarire. Dopo l&#39;ultimo lavaggio rimuovere con attenzione tutti i liquid dalle perline. </li><li> Preparare una TEV mix clivaggio della proteasi, per ogni campione sono 467,5 ul H 2 O, 25 pl 20x TEV Buffer (Invitrogen), 5 pl 0,1 M DTT e 2,5 microlitri (25 U) proteasi TEV (Invitrogen). Aggiungere 500 microlitri di questo mix scissione TEV ad ogni campione di perline confezionati e trasferire l&#39;intero mix da ml 1,7 pre-lubrificati tubo (Costar). Prima di rimuovere incubazione un&#39;aliquota di 30 microlitri per successiva analisi (campione 3). </li><li> Incubare la reazione TEV proteasi notte a 4 ° C usando un miscelatore rotante. Si noti che i tempi più brevi incubazioni possono essere utilizzate a seconda della natura della proteina esca e l&#39;accessibilità del sito di clivaggio TEV proteasi, ma il tempo di incubazione minimo dovrebbero essere determinate empiricamente. </li></ol> 5. Associazione a Ultralink Streptavidina immobilizzata Plus. perline (Nota: Tutti i giri deve essere effettuata a 1200X g in una centrifuga refrigerata a 4 ° C per 1 minuto, se non diversamente indicato) </p&gt; <ol><li> Centrifugare la reazione di scissione TEV contenente le IgG di coniglio perline di agarosio per 5 minuti a 1200X g (4 ° C). Rimuovere un&#39;aliquota da 20 pl del supernatante chiarito per analisi (Campione 4) </li><li> Trasferire il surnatante rimanente (circa 480 pl) in una nuova 1,5 ml pre-lubrificati tubo (Costar) e lasciarlo su ghiaccio. Non buttare via questo surnatante - questo contiene la proteina esca TEV spaccati e le eventuali proteine ​​associate vincolanti. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi refrigerati (sezione 2.3) per i restanti coniglio IgG perle di agarosio e risospendere. Centrifugare questa miscela di chiarire le perline prima di rimuovere il surnatante e combinandolo con quello dal punto 5.2. Lasciare la provetta in ghiaccio (dovrebbe ora contenere ~ 980 pl di campione). </li><li> Conservare le IgG di coniglio perle di agarosio per l&#39;analisi successiva (campione 5). Nota: se si esegue questo esempio su un gel SDS-PAGE (o Western Blot) darà un sacco di fondo dovuto alla presenza di IgG pesante e leggeracatene. </li><li> Nel frattempo Risospendere delicatamente il Ultralink immobilizzata streptavidina Plus perle di agarosio (Pierce) agitando la bottiglia. Utilizzando una punta di 200 microlitri pipetta con il taglio finale, aliquota 70 microlitri di perle streptavidina per campione in pre-lubrificati provette da 1,5 ml e rimuovere la distribuzione / soluzione conservante per centrifugazione. Nota: queste perle sono molto piccole e quindi &quot;becco d&#39;anatra&quot; o appartamento / narrow-ended suggerimenti possono essere utilizzati per ridurre al minimo la perdita di tallone durante il lavaggio. </li><li> Lavare le perle streptavidina tre volte in tampone di lisi freddo (4 ° C) mediante centrifugazione per chiarire. Ciò dovrebbe lasciare circa il 45-50 microlitri di perle confezionate per tubo. </li><li> Trasferire la TEV-proteasi supernatante clivaggio (cioè il 980 microlitri di campione dalla fase 5.3) per il tubo contenente le microsfere streptavidina lavate e incubare per 3 ore (o per una notte) a 4 ° C usando un miscelatore rotante. </li><li> Centrifugare le perline streptavidina per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il supernatante per successiva analisi (Sampio 6). Lavare le perle streptavidina tre volte in tampone di lisi freddo (4 ° C) mediante centrifugazione per chiarire. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere con cura tutti i buffer residuo di lavaggio. </li></ol> 6. Eluizione del peptide biotina streptavidina vincolante e proteina esca (Nota: Tutti i giri deve essere effettuata a 1200X g in una centrifuga refrigerata a 4 ° C per 1 minuto, se non diversamente indicato) <ol><li> Eluire proteine ​​marcate dalle perline streptavidina aggiunta di 500 pl di PBS: Biotina (1 mM D-biotina) e incubando a 4 ° C per 3 ore (o tutta la notte) utilizzando un miscelatore rotante. </li><li> Spin le perline streptavidina per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante in una provetta 1,5 ml pre-lubrificati (Nota: questo è il tuo campione finale / eluizione (Sample 7). </li><li> Aggiungere 500 pl altro Biotina: PBS alle perle streptavidina rimanenti e incubare a 4 ° C per 2-3 ore (o tutta la notte) utilizzando un miscelatore rotante. </li><li> Retorba punto 6.2 e combinare i due eluizioni (campione 7). Tale eluizione finale può essere conservato a -80 ° C. </li><li> Per valutare l&#39;efficienza del eluizione biotina, streptavidina congelare le perle restanti e far bollire poi in tampone campione SDS (Sample 8) (raccomandazioni: LaneMarker buffer 5x campione di ridurre da Fisher). </li></ol> 7. La concentrazione di proteine <ol><li> L&#39;eluato finale (Campione 7) deve essere concentrato prima dell&#39;analisi causa della bassa concentrazione di proteine ​​e volume relativamente elevato. Ciò può ottenere utilizzando a basso peso molecolare (&lt;5 KDa) colonne spin Vivaspin (Vivascience). Intende concentrare il volume a meno di 100 ul. Il campione finale può essere bollito e conservato in tampone proteine ​​campione (raccomandazioni: LaneMarker buffer 5x campione di ridurre da Fisher). </li></ol> 8. Analisi <ol><li> 1-8 I campioni possono essere analizzati mediante western blot per determinare l&#39;efficienza di tirare verso il basso. Nota: La maggior parte degli anticorpi secondaricross-reagiscono con le proteine ​​G domini della proteina di fusione, ma questo viene rimosso dopo clivaggio proteasi TEV. </li><li> Campione 7 possono essere analizzati mediante 1D o 2D SDS-PAGE. La colorazione può essere eseguita utilizzando argento o Coomassie (raccomandazioni: colorazione argento colloidale SilverQuest e colorazione con Coomassie Blue kit da Invitrogen). L&#39;identificazione di proteine ​​può essere effettuata utilizzando la spettrometria di massa. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi Un esempio di 1D analisi SDS-PAGE di eluizione finale (Campione 7) da questo protocollo per individuare partner di legame di eIF4E TAP marcato viene fornita in Figura 2. Questo gel rappresentante riflette la natura complessa e ricca di interazioni eIF4E con altre proteine ​​all&#39;interno della cellula. Il confronto con il controllo negativo anche illustrato nella figura 2, generato da una linea cellulare che esprime solo il tag TAP, illustra la specificità di questa eIF4E esca pull-down. In questo caso 15% del concentrato finale eluizione (Sample7) è stata analizzata mediante 1D SDS-PAGE usando commercialmente disponibili prefabbricati gel gradiente prima di essere colorati con il kit di colorazione d&#39;argento Silverquest da Invitrogen. Tipicamente 50-85% del restante eluizione concentrato finale (Campione 7) viene analizzata con Coomassie colloidale macchia (Invitrogen). Campioni (fette di gel / bande) dalla corsia intero sono stati poi estratti e analizzati mediante spettrometria di massa. Proteine ​​identificate nel eIF4E pull-down sono stati filtrati contro i partner di legame dal controllo negativo per individuare partner di legame non specifici. Le proteine ​​finali identificate utilizzando questo processo di eIF4E TAP tagging può essere visto in figura 2, che è rappresentativo delle normali proteine ​​identificate utilizzando questa tecnica. Inoltre, un certo numero di eIF3 subunità sono state anche identificate (dati non mostrati). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schematica dellatandem procedura di purificazione per affinità. I sei tandem passo affinità di purificazione (TAP) il protocollo prevede la linea di generazione delle cellule, lisi cellulare, Rabbit IgG agarosio immuno-precipitazione, clivaggio della proteasi TEV, streptavidina purificazione per affinità tallone e infine eluizione biotina. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Tandem purificazione per affinità della proteina eIF4E murina. Interagire partner del terminale N TAP tag eIF4E sono stati purificati da cellule eucariotiche HEK293 che utilizzano il protocollo allegato. Una frazione del 20% della eluizione finale (Campione 7) è stata analizzata mediante SDS-PAGE su un gel pre-cast gradiente 4-12% (TAP-eIF4E corsia). L&#39;analisi è stata effettuata equivalente per il tag da solo (corsia TAP). Le proteine ​​sono state identificate usando colorazione argentica. Proteine ​​successivamente identificati mediante spettrometria di massa del campione stesso sono evidenziati in questo gel. Abbreviazioni: eIF4G; eucariotica traduzione apertura f4 attore gamma, PABP; proteine ​​polyA vincolante, eIF4A: fattore di inizio eucariotico traduzione 4 alpha, SBP-eIF4E, il restante proteina esca TAP contenente il peptide streptavidina vincolante fusa alla eucariotico 4E fattore di inizio della traduzione, 4EBPs; inizio eucariotico 4E traduzione fattore vincolante proteine, eIF4eNiF1l eucariotico di inizio della traduzione fattore 4E fattore nucleare di importazione 1, SBP, il peptide streptavidina rimane vincolante dal peptide TEV TAP non fusa.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La tecnica di codifica TAP illustrata qui viene illustrato un metodo altamente specifico e rigoroso per isolare i partner di legame delle proteine ​​esca in cellule eucariotiche. Questo approccio può essere applicato sia alle proteine ​​cellulari e virali. A nostra conoscenza, questa è la prima volta una tale tecnica è stata applicata alla eIF4E fattore di iniziazione traduzione. Identificazione del noto eIF4G proteine ​​di legame eIF4E e le 4EBPs utilizzando questa tecnica conferma la validità di tale approccio. Inoltre, l&#39;identificazione del restante componente del complesso eIF4F, cioè eIF4A, e PABP conferma che interazione indiretta e complessi terziari rimanere intatto durante il processo di purificazione. L&#39;identificazione di isoforme multiple dei canonici eIF4E proteine ​​di legame era anche evidente. Questi sono descritti in maggiore dettaglio nella figura 2. Per quanto riguarda i limiti del metodo, certa attenzione dovrebbe essere presa per quanto riguarda la sceltadi proteine ​​e se esca o meno per posizionare l&#39;etichetta TAG alla N-o C-terminale. Potrebbe essere consigliabile effettuare un saggio funzionale o esaminare la localizzazione della proteina di fusione mediante microscopia prima della purificazione scala per garantire il derivato etichettato è funzionale. Integrali di membrana o proteine ​​nucleari non possono necessariamente essere rilasciato dalle condizioni relativamente blande detergenti descritte nella fase di lisi. Come con tutti immunoprecipitazioni e simili pull-down saggi, modifiche possono essere apportate alla natura e concentrazione del detersivo nel tampone di lisi per aumentare l&#39;efficienza di lisi. La concentrazione ionica dei buffer di lisi e lavaggio possono anche essere modificati per aumentare o ridurre la severità della purificazione. E &#39;anche possibile eseguire la purificazione iniziale in normali condizioni blande (sopra descritto), ma successivamente dividere i talloni sezione streptavidina (5,8) in aliquote 4-5, che possono successivamente essere lavate sotto crescente con ionicazioni. Ciò può consentire all&#39;utente di identificare le condizioni ottimali per la rimozione di proteine ​​interagenti non-specifici. L&#39;intero processo può essere effettuata anche mediante trasfezione transiente in cui sono note le parti interagenti e la loro presenza o assenza determinata dalla successiva western blot solo. In questo caso vi suggeriamo due 100cm due piatti di cellule trasfettate ciascuna con 8 microgrammi di plasmide di espressione. Questa procedura modificata è particolarmente utile quando esaminando la capacità dei derivati ​​mutanti del TAP-proteina di fusione per interagire con i noti partner di legame. Analizzando i campioni da 1 a 8 su Silver macchiati SDS-PAGE gel (o western blot se un anticorpo è disponibile) è un ottimo modo di risoluzione dei problemi, se la tecnica non riescono a produrre risultati accettabili. L&#39;efficienza di ciascuna precipitazione affinità basata e eluizione specifica possono essere analizzati utilizzando questo approccio sistematico campionamento. I campioni da uno a otto deve essere assunto durante Optimzazione del protocollo per ogni nuova esca. La tecnica di tagging TAP offre un&#39;alternativa potente e robusto per altre vie, come GST pull-down, lievito due saggi ibridi ecc purificazione per affinità doppia e specifiche fasi di eluizione (TEV cleavage eluizione e biotina) forniscono specificità e rigore deve essere mantenuta ad un livello alto durante la procedura di purificazione. Criticamente questa tecnica può essere applicata a qualsiasi proteina e rappresenta quindi un metodo eccellente per individuare partner di legame per una proteina bersaglio di interesse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> IgG di agarosio </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-proteasi TEV </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Cocktail di inibitori della proteasi </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink immobilizzato streptavidina perline Plus </td><td> Perforare </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 concentratore centrifugo (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest silver Kit di colorazione </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex Blu Coomassie colloidale Kit di colorazione </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml tubi prelubrificati</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapillare puntali </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% Bis-Tris gradiente di gel </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CDCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5x SDS Sample Buffer </td><td> Pescatore </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

Un punto critico e spesso limitante comprendere la funzione di host e proteine ​​virali è l&#39;identificazione di parti interagenti proteine ​​cellulari o virali. Ci sono molti approcci che permettono l&#39;identificazione di partner interagenti, compreso il sistema del doppio ibrido di lievito, nonché abbassarle saggi utilizzando proteine ​​ricombinanti e di immunoprecipitazione di proteine ​​endogene seguita dalla identificazione spettrometria di massa 1. Recenti studi hanno evidenziato l&#39;utilità del doppio affinità purificazione tag mediata, accoppiato con due passi di eluizione specifici l&#39;identificazione di proteine ​​che interagiscono. Questo approccio, definito Tandem purificazione per affinità (TAP), è stata inizialmente utilizzata nel lievito 2,3 ma più recentemente è stato adattato da utilizzare in cellule di mammifero 4-8. Come proof-of-concept che abbiamo stabilito una purificazione per affinità tandem (TAP) il metodo con il ben caratterizzato eucariotica traduzione iniziazione factor eIF4E 9,10. il cellulare eIF4E fattore di traslazione è una componente critica del complesso eIF4F cellulari coinvolti nella cap-dipendente inizio della traduzione 10. Il tag TAP utilizzato in questo studio si compone di due unità proteina G e un peptide streptavidina vincolante separati da un virus Tobacco Etch (TEV) clivaggio sequenza proteasi. Il tag TAP utilizzato in questo studio si compone di due unità proteina G e un peptide streptavidina vincolante separati da un virus Tobacco Etch (TEV) clivaggio sequenza proteasi 8. Per rinunciare la necessità per la generazione di linee cellulari clonali, abbiamo sviluppato un sistema rapido che si basa sull&#39;espressione del TAP-tag proteina esca da un plasmide episomally mantenuto base pMEP4 (Invitrogen). Espressione di targhetta eIF4E murino da questo plasmide è stato controllato mediante il cloruro di cadmio promotore inducibile metallotioneina. Lisi delle cellule esprimenti e successiva purificazione per affinità tramite legame rabbit IgG agarosio, clivaggio della proteasi TEV, l&#39;associazione a streptavidina legata agarosio e successiva eluizione biotina identificato numerose proteine ​​apparentemente specifiche per il eIF4E pull-down (rispetto ai controlli linee cellulari che esprimono il tag TAP solo). Le identità delle proteine ​​sono stati ottenuti mediante escissione delle bande da 1D spettrometria di SDS-PAGE e successiva massa. I componenti individuati incluse le proteine ​​eIF4E note vincolanti eIF4G e 4EBP-1. In aggiunta, altri componenti del complesso eIF4F, di eIF4E che è un componente sono stati identificati, cioè eIF4A e Poly-A proteina legante. La capacità di identificare non solo i noti partner diretti vincolanti così come secondari proteine ​​interagenti, evidenzia ulteriormente l&#39;utilità di questo approccio nella caratterizzazione di proteine ​​di funzione sconosciuta.

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l&#39;individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.3K Views.  Imperial College London. Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

La colorazione delle proteine ​​in gel con Coomassie G-250, senza solventi organici acido acetico e

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

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Biologia

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificazione e caratterizzazione di glicosilazione delle proteine ​​con specifiche endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Un protocollo per Phage Display e affinità selezione con esche proteina ricombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Individuazione di partner proteine interagenti mediante Tandem Affinity Purification