Esta pesquisa foi financiada por uma bolsa Wellcome Senior confiança atribuído ao Dr. Ian Goodfellow.

1. Geração de linhas celulares: pMEP4 transfecção / expressão <ol><li> Transfectar células com o vetor de expressão pMEP4 e selecione com 100 mg de higromicina B / ml (Roche), até que todas as células transfectadas simulados foram mortos fora. O plasmídeo pMEP4 é mantida episomally portanto, não há necessidade de isolar clones específicos. </li><li> As células contendo o vector pMEP4 pode ser induzida por tratamento com 10 uM CdCl 2 durante 16 horas. Expressão e indutibilidade deve ser confirmado, em pequena escala antes da amplificação das linhas de células. A proteína TAP-etiquetados pode ser prontamente detectada como os domínios de proteína G se ligam a anticorpos a partir de quase todas as espécies. Para grande escala purificações normalmente 10 confluentes 175 cm 2 frascos de células são necessários. Isso equivale a cerca de 2 X10 8 células que expressam. </li></ol> 2. Preparação lisado celular <ol><li> Raspe as células em PBS e combinam em um único tubo ml 50. Spin 1200X gfou 5 minutos (isto deve resultar em 2-3 ml de eritrócitos para começar, o que reduz a cerca de 1,5 ml, após lavagem). </li><li> Lave as células três vezes em PBS gelado (50 ml de cada vez). </li><li> Lisar as células em 5 ml de tampão de lise (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, glicerol 5%, 0,2% de NP-40, 1,5 mM de MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM de Na 3 VO 4 e inibidor de protease ). Nota: NaF, Na 3 VO 4 e inibidores da protease devem ser adicionados fresco. Pipetar cima e para baixo 10 vezes antes de sair durante 5 minutos em gelo. Seringas cima e para baixo 5-10 vezes usando uma agulha romba antes de sair novamente em gelo durante 5 minutos em gelo. Repita syringing e deixar durante mais 5 minutos em gelo. </li><li> Freeze-descongelar o lisado duas vezes (gelo N2 líquido / ou seca e etanol). Não permitir amostra para alcançar uma maior do que 4 ° C. Nota: você pode armazenar esta amostra a -80 ° C até que você tenha tempo para processar. </li><li> Alíquota de amostra em tubos de 1,5 ml e remover as células unlysed edebris por centrifugação (10 minutos a 4 ° C, 16.000 X g). </li><li> Recuperar o sobrenadante, combinar num tubo Falcon 15 ml e (opcionalmente) passar através de um filtro de 0,45 antes de tomar uma amostra de 20 uL para a quantificação produção de proteína. Remover uma alíquota de 50 ul adicionais para análise subsequente (Amostra 1). </li></ol> 3. A ligação a IgG de coelho-agarose (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Suavemente ressuspender o IgG de coelho-agarose solução (Sigma-Aldrich) por agitação do frasco. Tome 380 uL de IgG de agarose (usando um corte ponta de pipeta de 1 ml) e remover o transporte / solução conservante por centrifugação durante 1 minuto. Lavar os agarose três vezes em tampão de lise refrigerados (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. O rendimento final de agarose deve ser de cerca de 250 uL de pérolas de embalados. </li><li> Adicionar o lisado celular eliminado 2,6 (em uma cuba 15 ml Falcone) para o lavada-coelho IgG de agarose e incubar durante 3 horas (ou durante a noite) a 4 ° C usando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de agarose durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para análise subsequente (Amostra 2). Nota: O TAP etiquetados com proteína deve agora ser associada com as esferas. </li></ol> 4. TEV clivagem protease (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Lavar os grânulos de coelho IgG de agarose três vezes em tampão de lise refrigerados (4 ° C) usando centrifugação para clarificar (nota: o tampão de lise não deve conter inibidores de protease). Cuidados devem ser tomados para não remover ou perder todas as pérolas durante as etapas de lavagem. </li><li> Lavar os grânulos mais duas vezes, com TEV protease-tampão de clivagem (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, e 0,2% de NP-40) usando a centrifugação para clarificar. Após a última lavagem cuidadosamente remover todo o liquid a partir dos grânulos. </li><li> Prepara-se uma mistura de clivagem de TEV protease; para cada amostra incluem 467,5 uL de H2O, 25 uL de 20x tampão TEV (Invitrogen), 5 ul 0,1 M DTT e 2,5 ul (25 U) TEV Protease (Invitrogen). Adicionar 500 uL desta mistura de clivagem de TEV para cada amostra de grânulos compactados e transferir toda a mistura para um tubo de 1,7 ml de pré-lubrificado (Costar). Antes da incubação remover uma alíquota 30 ul para análise subsequente (Amostra 3). </li><li> Incubar a reacção protease de TEV durante a noite a 4 ° C utilizando um misturador rotativo. Note-se que tempos mais curtos incubações podem ser utilizadas dependendo da natureza da proteína isco e da acessibilidade do sítio de clivagem da protease de TEV, mas o tempo de incubação mínima deve ser determinado empiricamente. </li></ol> 5. A ligação às ULTRALINK estreptavidina imobilizada Além disso contas (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) </p&gt; <ol><li> Centrifugar a reacção de clivagem de TEV contendo os grânulos de coelho IgG de agarose durante 5 minutos a 1200X g (4 ° C). Remover uma alíquota de 20 ul do sobrenadante clarificado para análise (Exemplo 4) </li><li> Transferir o sobrenadante remanescente (cerca de 480 uL) a uma ml 1,5 fresca pré-lubrificado tubo (Costar) e deixar em gelo. Não jogue fora este sobrenadante - contém sua proteína isca TEV clivados e as proteínas associadas vinculativos. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lise gelada (Seção 2.3) para os restantes coelho IgG contas de agarose e ressuspender. Centrifugar esta mistura a clarificar as esferas antes de remover o sobrenadante e combinando-o com que a partir do passo 5.2. Deixar este tubo em gelo (deve conter agora ~ ul de amostra 980). </li><li> Guarde as contas de IgG de coelho de agarose para análise posterior (amostra 5). Nota: se executar esta amostra num gel de SDS-PAGE (ou Western blot) que irá dar um lote de fundo devido à presença da cadeia pesada de IgG e de luzcadeias. </li><li> Enquanto isso delicadamente ressuspender o Ultralink Imobilizado contas estreptavidina Plus agarose (Pierce) agitando o frasco. Usando uma ponteira 200 ul com o corte final, alíquota de 70 ul de contas estreptavidina por amostra em pré-lubrificadas tubos de 1,5 ml e remover transporte / solução conservante por centrifugação. Nota: estas contas são muito pequenas e por isso &quot;duck-billed&quot; ou apartamento / narrow-ended dicas podem ser usadas para minimizar a perda de talão durante a lavagem. </li><li> Lave as esferas de estreptavidina três vezes em tampão de lise frio (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. Isso deve deixar cerca de 45-50 ul de contas embalados por tubo. </li><li> Transferir o sobrenadante de clivagem de protease-TEV (isto é, o uL de amostra 980 a partir do passo 5.3) para o tubo contendo as esferas de estreptavidina lavadas e incubar durante 3 horas (ou durante a noite) a 4 ° C usando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de estreptavidina durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para análise subsequente (Samplo 6). Lave as esferas de estreptavidina três vezes em tampão de lise frio (4 ° C) usando centrifugação para clarificar. Após a lavagem final, cuidadosamente remover todo o tampão de lavagem restante. </li></ol> 6. Biotina eluição do péptido de ligação a estreptavidina e proteína isco (Nota: Todos os spins deve ser realizado a 1200X g numa centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que indicado de outra forma) <ol><li> Eluir proteínas marcadas a partir das pérolas de estreptavidina por adição de 500 ul de PBS: Biotina (1 mM D-biotina) e incubando a 4 ° C durante 3 horas (ou durante a noite), utilizando um misturador rotativo. </li><li> Girar para baixo as esferas de estreptavidina durante 5 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml de pré-lubrificado (Nota: esta é a sua amostra final / eluição (Exemplo 7). </li><li> Adicionar outra Biotina 500 uL: PBS para as esferas de estreptavidina restantes e incubar a 4 ° C durante 2-3 horas (ou durante a noite), utilizando um misturador rotativo. </li><li> Returfa passo 6,2 e combinar as duas eluições (Exemplo 7). Este eluição final pode ser armazenado a -80 ° C. </li><li> Para avaliar a eficiência da eluição biotina, congelar as esferas de estreptavidina restantes e ferver mais tarde, em tampão de amostra SDS (Exemplo 8) (recomendações: LaneMarker tampão de amostra de 5x reduzindo a partir de Fisher). </li></ol> 7. A concentração de proteína <ol><li> O eluato final (Amostra 7) tem de ser concentrada antes da análise por causa da concentração de proteína de baixo e de volume relativamente elevado. Isto pode conseguido usando baixo peso molecular (&lt;5 kDa) colunas spin Vivaspin (Vivascience). Destinam-se a concentrar-se o volume até menos de 100 uL. Esta amostra final pode ser fervido e armazenado em tampão de amostra de proteína (recomendações: LaneMarker tampão de amostra de 5x reduzindo a partir de Fisher). </li></ol> 8. Análise <ol><li> As amostras 1-8 pode ser analisada por Western blot para determinar a eficiência de puxar para baixo. Nota: A maioria dos anticorpos secundários vontadereagem de forma cruzada com os domínios da proteína G da proteína de fusão, mas este é removido após a clivagem protease de TEV. </li><li> Exemplo 7 pode ser analisada por 1D e 2D SDS-PAGE. Coloração pode ser realizada usando prata ou de Coomassie (recomendações: SilverQuest coloração de prata e coloidais Blue kits coloração com Coomassie de Invitrogen). Identificação de proteínas pode ser realizada utilizando espectrometria de massa. </li></ol> 9. Os resultados representativos Um exemplo de análise de SDS-PAGE 1D da eluição final (Amostra 7) a partir de este protocolo para identificar parceiros de ligação de eIF4E TAP etiquetados é fornecido na Figura 2. Este gel representante reflecte a natureza complexa e abundante de interacções com outras proteínas eIF4E na célula. A comparação com o controlo negativo também mostrada na Figura 2, gerada a partir de uma linha celular expressando somente a marca TAP, ilustra a especificidade deste eIF4E iscado pull-down. Neste exemplo 15% da eluição concentrado final (Amostra7) foi analisada por 1D SDS-PAGE utilizando disponíveis comercialmente géis pré-moldados de gradiente antes de serem coradas utilizando o kit de coloração de prata Silverquest a partir de Invitrogen. Tipicamente 50-85% da eluição concentrado restante final (Amostra 7) é analisado com Coomassie coloidal mancha (Invitrogen). As amostras (fatias de gel / bandas) a partir da pista inteira foram então extraídos e analisados ​​por espectrometria de massa. Proteínas identificadas no eIF4E pull-down foram filtrados contra os parceiros de ligação a partir do controlo negativo para identificar não-específicos parceiros de ligação. As proteínas finais identificados usando este processo de etiquetagem eIF4E TAP pode ser visto na Figura 2, que é representativo das proteínas normais identificados usando esta técnica. Além disso, um certo número de subunidades eIF3 também foram identificados (dados não mostrados). <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="A Figura 1" /> Figura 1. Esquemática doParalelamente processo de purificação de afinidade. O conjunto de seis passos afinidade purificação protocolo (TAP) envolve a geração linha celular, a lise celular, coelho IgG agarose imuno-precipitação, TEV clivagem protease, estreptavidina purificação por afinidade talão e eluição finalmente biotina. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Tandem purificação por afinidade da proteína de murino eIF4E. Interagindo parceiros do N terminal TAP etiquetados eIF4E foram purificados a partir de células HEK293 eucarióticas, utilizando o protocolo em anexo. Uma fracção de 20% da eluição final (Amostra 7) foi analisado por SDS-PAGE num gel de gradiente pré-fundido 4-12% (TAP-eIF4E pista). Uma análise foi realizada equivalente para a marca de sozinho (pista TAP). As proteínas foram identificadas usando coloração com prata. Proteínas subsequentemente identificadas por espectrometria de massa da mesma amostra são destacadas sobre este gel. Abreviaturas: eIF4G; eucariótico de iniciação da tradução fgama ator 4, PABP; polyA proteína de ligação, eIF4A: fator de iniciação eucariótico tradução 4 alpha, SBP-eIF4E; a proteína isca restante TAP contendo o peptídeo estreptavidina ligação fundida ao eucariótica 4E fator de iniciação da tradução, 4EBPs; tradução eucariótica 4E fator de iniciação de ligação proteínas, eIF4eNiF1l eucariótico de iniciação da tradução fator 4E fator de importação nuclear 1, SBP, o peptídeo estreptavidina restante ligação do peptídeo TAP TEV não fundido.

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Não há conflitos de interesse declarados.

A técnica de marcação TAP ilustrado aqui demonstra um método altamente específico e rigoroso para isolar os parceiros de ligação de proteínas isca em células eucarióticas. Esta abordagem pode ser aplicada a ambas as proteínas celulares e virais. Para o nosso conhecimento, este é a primeira vez que uma tal técnica tem sido aplicada à eIF4E factor de iniciação da tradução. Identificação do conhecido eIF4G proteínas eIF4E vinculativa e os 4EBPs usando esta técnica confirma a validade de tal abordagem. Além disso, a identificação do componente restante do complexo eIF4F, a saber, eIF4A, e PABP confirma que a interacção indirecta e complexos terciárias permanecer intacto durante o processo de purificação. A identificação de múltiplas isoformas dos canónicos eIF4E proteínas de ligação também era evidente. Estes são descritos em mais detalhe na Figura 2. Com relação às limitações da abordagem, certos cuidados devem ser tomadas medidas em relação à escolhade proteína isco e se ou não a colocar a etiqueta de TAG na extremidade N-ou C-terminal. Pode ser aconselhável realizar um ensaio funcional ou examinar a localização da proteína de fusão por microscopia antes da purificação escala completa para assegurar o derivado marcado é funcional. Membrana Integral ou proteínas nucleares não podem necessariamente ser liberado pelas condições relativamente suaves detergente descritos na etapa de lise. Como com todas as imunoprecipitações e semelhantes pull-down ensaios, as modificações podem ser feitas com a natureza e as concentrações do detergente no tampão de lise para aumentar a eficiência de lise. A concentração iónica dos buffers de lise e de lavagem pode também ser modificado para aumentar ou diminuir o rigor da purificação. É também possível realizar a purificação inicial sob condições padrão suaves (descrito acima), mas posteriormente dividir as esferas de estreptavidina (secção 5.8) em alíquotas 4-5, que podem posteriormente ser lavados sob crescente con iónicoções. Isso pode permitir que o usuário a identificar as condições ideais que removem não-específicas proteínas que interagem. Todo o processo pode também ser realizada usando transfecção transiente em que os parceiros que interagem são conhecidos ea sua presença ou ausência determinada por Western blot subsequente apenas. Neste caso, sugiro dois 100cm 2 pratos de cada células transfectadas com 8 mg de plasmídeo de expressão. Este procedimento modificado é de particular utilidade quando se examina a capacidade de derivados de mutantes da proteína de fusão TAP-para interagir com parceiros de ligação conhecidos. Análise de amostras de 1 a 8 em corado com prata de SDS-PAGE (gel ou por western blot se um anticorpo está disponível) é um excelente meio de resolução de problemas, se a técnica de falhar para gerar os resultados aceitáveis. A eficiência de cada precipitação afinidade baseada e eluição específico podem ser analisados ​​usando esta abordagem sistemática de amostragem. As amostras de um a oito deve ser tomado durante optimização do protocolo para cada nova isca. A técnica de marcação TAP fornece uma alternativa poderosa e robusta para outras abordagens, tais como GST pull-baixos, de levedura dois ensaios híbridos etc A purificação por afinidade dupla e os passos de eluição específicos (de clivagem de TEV e eluição biotina) fornecer especificidade e rigor que ser mantido a uma elevado nível durante todo o procedimento de purificação. Criticamente esta técnica pode ser aplicada a qualquer proteína e, portanto, representa um excelente método para identificar parceiros de ligação para um alvo da proteína de interesse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Higromicina B </td><td> Roche </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> IgG de coelho Agarose </td><td> Sigma </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> Cocktail inibidor de protease </td><td> Calbiochem </td><td> 539134 </td></tr><tr><td> Ultralink Imobilizado contas estreptavidina Plus </td><td> Perfurar </td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin concentrador de 500 centrífugas (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest kit coloração com prata </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex coloidal Azul kit de coloração de Coomassie </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml tubos previamente lubrificados</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> Microcapilar ponteiras </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4-12% gradiente de Bis-Tris géis </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> Sigma </td><td> 202908 </td></tr><tr><td> Tampão de amostra SDS 5x </td><td> Pescador </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

Um passo crítico e, muitas vezes limitante na compreensão da função do hospedeiro e proteínas virais é a identificação de interagir parceiros de proteínas celulares ou virais. Existem muitas abordagens que permitem a identificação de parceiros que interagem, incluindo o sistema de levedura duas híbrido, bem como puxar para baixo, utilizando ensaios de proteínas recombinantes e imunoprecipitação de proteínas endógenas seguidos por espectrometria de massa de identificação 1. Estudos recentes revelaram a utilidade de duplo afinidade purificação mediada tag, juntamente com dois passos de eluição específicos na identificação de proteínas que interagem. Esta abordagem, denominado Tandem purificação por afinidade (TAP), foi inicialmente utilizado em levedura 2,3 mas mais recentemente foi adaptado para usar em células de mamíferos 4-8. Como prova de conceito, criámos uma purificação por afinidade tandem (TAP) usando o método do bem caracterizada eucariótico de iniciação da tradução factor eIF4E 9,10. O eIF4E fator celular de tradução é um componente crítico do complexo eIF4F celular envolvido na cap-dependente de início da tradução 10. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) sequência de clivagem de protease. A etiqueta de TAP utilizado no presente estudo é composto de duas unidades de proteína G e um péptido de ligação a estreptavidina separados por um vírus de Tabaco Etch (TEV) a sequência de clivagem de protease 8. Para renunciar a necessidade para a geração de linhas de células clonais, foi desenvolvido um sistema rápido que depende da expressão da proteína TAP-etiquetados com isco de um plasmídeo episomally mantida com base em pMEP4 (Invitrogen). Expressão de etiquetados eIF4E murino a partir deste plasmídeo foi controlado usando o cádmio cloreto de promotor de metalotioneina indutível. Lise das células que expressam e subsequente purificação por afinidade através de ligação a rabbit IgG agarose, TEV clivagem protease, a ligação a estreptavidina agarose ligada e eluição biotina subseqüente identificaram proteínas numerosas aparentemente específicos para o eIF4E pull-down (quando comparado ao grupo controle linhas de células que expressam a marca TAP sozinho). As identidades das proteínas foram obtidos por excisão das bandas de espectrometria de massa de SDS-PAGE e subsequente em tandem 1D. Os componentes identificados incluído as proteínas de ligação conhecidos eIF4E eIF4G e 4EBP-1. Além disso, outros componentes do complexo eIF4F, dos quais eIF4E é um componente foram identificados, ou seja, eIF4A e Poly-A proteína de ligação. A capacidade de identificar não apenas conhecidos diretos parceiros de ligação, bem como secundárias proteínas interagem entre si, acentua ainda mais a utilidade desta abordagem para a caracterização de proteínas de função desconhecida.

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

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Research

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Biology

37.4K visualizações.  Imperial College London. Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Purificação da Hsp104, um Disaggregase Protein

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Purificação de Proteínas ortogonais Facilitado por um Tag Affinity Pequenas Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

De alto rendimento de purificação de afinidade com tag Proteínas Recombinantes

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Sua purificação: A Two-step Affinity Purification Protocolo Cedendo Full-length proteínas purificadas

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

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