Questo lavoro è stato finanziato in parte attraverso borse di studio della Regione Veneto (Ricerca Sanitaria Finalizzata n.292/2008 e la Ricerca Sanitaria Finalizzata 2009). Gli autori ringraziano il dottor C. Griffoni per i dati 2009/2010 riassunto sull&#39;uso dei globi oculari umane.

1. Excisione situ della cornea da globi oculari <ol><li> Accendere la cappa a flusso laminare d&#39;aria circa 15 minuti prima dell&#39;uso. Pulire la cappa a flusso laminare con il 70% di alcool isopropilico. Indossare indumenti protettivi, come cappello e maschera chirurgica. Scrub mani e gli avambracci e asciugare con un telo sterile. Indossare guanti sterili e camice o maniche con tecnica asettica. </li><li> Impostare il campo sterile inserendo un vassoio sterile strumento asettico. Verificare che gli strumenti sono sterili. Aprire la confezione sterile strumenti e capovolgere sul campo sterile evitando qualsiasi contaminazione. </li><li> Posizionare tutti i materiali sterili e strumenti (Tabella 2) con bottiglie vasetti oculari) contenenti globi oculari in modo che siano adiacenti al bordo del campo sterile per facilità di utilizzo. </li><li> Etichettare le bottiglie con conservazione precedentemente preparata / supporto di memorizzazione come indicato nella tabella 3 e posizionare l&#39;m sulla superficie della cappa a flusso laminare d&#39;aria con I-PVP (polivinilpirrolidone-iodio), tiosolfato di sodio e soluzione salina sterile PBS (tampone fosfato salino). </li><li> Lasciare i tessuti oculari e le soluzioni a temperatura ambiente normale, in quanto sono conservate in frigorifero a 4 ° C. Evitare il ripetersi di riscaldamento / raffreddamento cicli. Mantenere i coperchi della soluzione e dei vasi dell&#39;occhio con parte interna rivolta verso l&#39;alto accanto ai loro rispettivi vasi. </li><li> Rimuovere garze e spugne dal vaso degli occhi utilizzando pinze sterili. Immergere il globo in sterile I-PVP 0,5% per 2 minuti per decontaminare i globi oculari. Porre le due pinze sul coperchio del vassoio sterile, fuori del campo sterile. Trasferire il mondo in tiosolfato di sodio 0,1% per 1 minuto con un altro paio di pinze sterili. Utilizzando le pinze stesse, trasferire il globo per il flacone contenente una soluzione salina sterile (PBS) e lasciarlo fino a che non viene azionato. Ripetere la stessa procedura per il globo oculare altro da tegli stesso donatore. </li><li> Lavorare sotto la cappa a flusso laminare d&#39;aria, avvolgere il mondo utilizzando una garza sterile (bende), lasciando la cornea e la sclera circa 5 mm dalla cornea scoperto. Il bulbo oculare può essere semplicemente tenuto in mano mantenere la pressione adeguata. Il tessuto deve essere mantenuto umido durante l&#39;intervento chirurgico intero. </li><li> Pinza vengono utilizzati insieme con le forbici per rimuovere tutte le eventuali resti della congiuntiva. Mantenere gli strumenti utilizzati per l&#39;operazione sopra descritta separato da altri strumenti. Utilizzare una lama di bisturi per eseguire una incisione sclerale di 3-4 mm dalla regione limbus, quindi estendere l&#39;incisione di 360 °, evitando di perforare il tessuto sottostante uveale o causare alcuna deformazione della normale curvatura della cornea. Tagliare quattro grandi incisioni che lasciano quattro piccoli spazi evitando la secrezione del corpo vitreo. Tutte e quattro le lacune vengono tagliati garantendo l&#39;assenza di rimozione di qualsiasi altro tessuto. </li><li> Presenza di piccole placche sclerali può ostacolare il taglio, quindi assicuratevi di complete l&#39;escissione sclerale con le forbici microchirurgia. Questa operazione deve essere effettuata senza danneggiare il corpo coroide, retina e vitreo. </li><li> Controllare l&#39;incisione per assicurarsi che sia completa. Se l&#39;incisione è stata eseguita correttamente i corneo-sclerali cerchio aderisce ai corpi ciliari solo nel punto in corrispondenza della cornea. </li><li> Impostare il globo oculare avvolto in basso vicino al centro del campo sterile. Completa la rimozione corneale mediante pinza per tenere il cerchio sclerale stazionaria e la mano utilizzata per escissione per tirare il corpo ciliare-coroide verso il basso e lontano dalla corneo-sclerale pulsante. </li><li> Separare delicatamente le aderenze rimanenti dalla corneo-sclerale pulsante. Né tirare il corneo-sclerale cerchio in modo che potrebbe causare cross-corneale tensione né consentono di cadere giù sulla camera anteriore. </li><li> La densità delle cellule endoteliali della cornea viene controllata utilizzando una soluzione ipotonica e la mortalità cellulare viene controllata mediante un trypuna colorazione blu per circa 1 min e le cellule vengono quindi contate sotto un microscopio ottico e misurato come cellule / mm 2. La camera anteriore deve essere rivolto verso il coperchio, mentre la parte posteriore deve essere rivolto verso il fondo della piastra Petri. La densità delle cellule endoteliali può essere contato manualmente attraverso una griglia in dell&#39;obiettivo sotto ingrandimento 100X. Il conteggio delle cellule minima accettata per il trapianto in Italia è di 2200 cellule endoteliali / mm 2. </li><li> Trasferire la corneo-sclerale cerchione utilizzando un artiglio corneale precedentemente preparato supporto di memorizzazione corneale conservato a RT (temperatura ambiente) come mostrato nella Tabella 3. </li><li> Esaminare la camera posteriore per un cristallino naturale. Se la sclera viene preparato, rimuovere tutti i residui di uvea e l&#39;umore vitreo dal globo. Scartare con cura e restituire il segmento rimanente posteriore al suo barattolo occhio rispettiva, usando una tecnica asettica. Ripetere la procedura per il globo altro utilizzando nuovi strumenti. Fissare l&#39;arguzia corneah artiglio corneale e mantenere sotto il supporto di memorizzazione (organo coltura) a 31 ° C. La cornea asportata, come mostrato in Figura 1a, può quindi essere utilizzato per cheratoplastica o di ricerca. </li><li> Smaltire i materiali inutili e pericolosi bio-rifiuti in cassonetti appropriati. Pulire l&#39;area di lavoro, una volta completato il lavoro con il 70% a spruzzo alcool isopropilico. </li><li> Se, dopo 28 giorni la cornea mantiene tutti i parametri di valutazione [quali la morfologia, conta cellulare, trasparenza, spessori e test microbiologia - batteri e funghi con BACTEC 9240 strumento (Becton Dickinson, Milano, Italia)], esso può essere trasportato gli ospedali, usando il mezzo di trasporto mostrati in Tabella 4. La cornea deve essere rimosso e collocato dallo stoccaggio al trasporto medio sotto cappa a flusso d&#39;aria laminare. </li><li> Come, durante lo stoccaggio, la cornea diventa più spessa rispetto alle dimensioni solito richiesto per il trapianto, le banche degli occhi utilizzare de-gonfiore agenti per ridurre lo spessore. Noiutilizzare il 6% di destrano T500 per ottenere la cornea torna alla sua dimensione normale in un mezzo di trasporto. Sebbene 4-8% destrano T500 potrebbe essere utilizzato, 6% ha servito meglio per noi. Questo rende più facile per i chirurghi al trapianto della cornea, non appena lo ricevono. </li></ol> 2. L&#39;eviscerazione del Retina dal globo oculare dopo ablazione del Cornea <ol><li> Dopo escissione, la cornea viene selezionato per il trapianto o la ricerca in base alla sua morfologia e la densità delle cellule endoteliali e si trova nel mezzo di memorizzazione o di conservazione a 31 ° C. Il rimanente del globo oculare viene quindi elaborato per un ulteriore uso come isolamento sclera fini chirurgici, ecc retina per la ricerca </li><li> Prima di escissione della retina, assicurarsi che il globo oculare è intatto e solo la cornea con una parte della sclera viene rimosso. Se il corpo vitreo gelatinosa è secernendo fuori diventa difficile rimuovere un tessuto retinico. </li><li> Se il donatore è inferiore a 65 anni di età, la sclera èconservati sotto PBS sterile a fini chirurgici dopo test sierologici. In questo caso, la sclera non viene tagliato, solo il corpo vitreo viene rimosso e la sclera tutto viene mantenuto. </li><li> Per escissione della retina, iniziare con un piccolo taglio o incisione della cornea dal lato della sclera verso il nervo ottico, l&#39;uso di pinze e forbici sterili. Tenere la parte della sclera con pinze e tagliare con le forbici dritto verso il nervo ottico di taglio parte per parte evitando di danneggiare il corpo vitreo. </li><li> Placche coroide devono essere separati dalla sclera in quanto sono bloccati insieme. Tagliare la sclera intera per esporre il tessuto coroide. Una volta che la sclera è completamente tagliata, separare la sclera con il resto del corpo vitreo tagliandolo vicino al nervo ottico. Una sfera intero corpo vitreo ricoperto coroide sarà visibile come mostrato in Figura 2a. </li><li> Utilizzando due pinze sterili rimuovere lo strato coroide delicatamente raccoglierlo con unpinza e rimozione con l&#39;altra. In alternativa, lo strato coroide può essere rimossa con le forbici, ma questo dovrebbe idealmente essere evitata in quanto potrebbe causare danni alla retina. Rimuovere lo strato coroide parzialmente e tagliarla a facilitare la rimozione. </li><li> Una volta che lo strato coroide è rimosso, uno strato trasparente di retina si vede chiaramente come mostrato nella Figura 2b. Lo strato coroide membrana ha uno Bruch interna, che può anche essere eliminato, ma è difficile identificare con un occhio nudo. </li><li> Analogamente, utilizzare due pinze per rimuovere lo strato retinico come mostrato in Figura 2c. È facile isolare elevata quantità di retina se escisso vicino al nervo ottico. Tutti gli strati dell&#39;occhio può essere ora visto come mostrato in figura 2d. </li><li> Una volta che il tessuto retinico è stato rimosso, potrebbe essere utilizzata per scopi diversi e quindi le successive fasi e le condizioni utilizzate per la conservazione può variare di conseguenza. Ad esempio,la retina può essere collocato in provette contenenti RNA reagenti stabilizzazione (come RNAlater) o tampone di lisi (per l&#39;estrazione di RNA o DNA), dispasi / tripsina (per l&#39;isolamento di cellule), soluzioni di fissaggio (prima di incorporare tessuti in paraffina o PTOM immunoistochimica). </li><li> Cancella tutto l&#39;area di lavoro e pulire l&#39;area con il 70% a spruzzo alcool isopropilico. </li></ol> 3. Risultati rappresentativi Il corneo-sclerale cerchio come visto nella figura 1a è una cornea propriamente escisso con quantità richiesta di cerchio sclerale e morfologia endoteliale, questo tipo di cornea viene generalmente utilizzato per cheratoplastica penetrante. Se lo stroma anteriore della cornea asportato è danneggiato con presenza di opacità, la cornea potrebbe essere utilizzato per cheratoplastica endoteliale / posteriore cheratoplastica lamellare (endotelio con una parte di stroma). Considerando che, se lo strato endoteliale è danneggiato o se la densità delle cellule endoteliali è &lt;2200 cellule / mm 2 It (alian standard), la cornea potrebbe essere utilizzata per anteriore cheratoplastica lamellare (epitelio con una parte anteriore di stroma). Se il conteggio delle cellule endoteliali è inferiore al desiderato, la cornea potrebbe essere utilizzata per anteriore cheratoplastica lamellare o di ricerca che, se la cornea è danneggiato completamente, potrebbe essere usato per la ricerca come mostrato in Figura 1b, 3b e 3c o scartato. Il danno potrebbe essere una causa della cattiva gestione del tessuto, prima di interventi chirurgici alla cataratta che portano cicatrici endoteliali stromali o Descemet, lo sviluppo di lesioni fisiche, ecc durante la vita del paziente Pertanto, si rende necessario controllare ogni tessuto con lampada a fessura e poi al microscopio ottico per cicatrici sottili pieghe / / distacchi. La cornea è di solito conservata in due diverse condizioni quali la cultura d&#39;organo (circa 31 ° C), di solito utilizzata nei paesi europei o condizioni di ipotermia (circa 4 ° C) di solito utilizzato negli Stati Uniti. Usiamo cultura organistica in quanto aiuta a rigenerare la digaetà cellule epiteliali, per rivitalizzare controllo delle cellule endoteliali, con un elevato tempo di post mortem, un periodo di conservazione di 4 settimane finestra che dà sufficiente per pianificare un intervento chirurgico, dà il tempo sufficiente per i test microbiologici (batteri e funghi) e sierologici ecc cornea può essere ben conservati nel mezzo di trasporto per 7 giorni. La sclera può essere tagliato parte per parte garantendo la rimozione delicata di tutte le placche della coroide. Il liquido vitreo può espellere quando il nervo ottico, coroide o retina viene tagliato bruscamente come mostrato nella Figura 4. Retine se asportati per l&#39;analisi dell&#39;RNA deve essere conservata in RNAlater appena i tessuti sono rimossi. Solitamente 1X1 cm della coroide e retina strato viene asportato e dopo conservazione in RNAlater per 24 ore a 4 ° C viene conservato sotto -80 ° C in provette Eppendorf fresco (Safe-Lock provette da 2 ml) fino utilizzati o trasferiti con secco ghiaccio. Il tessuto retinico deve essere asportato con due pinze in prossimità del nervo ottico lontano da iriso margine ciliare per evitare la contaminazione con altre strutture pigmentati e deve essere trasferito nel contenitore preservare immediatamente come RNA ottiene instabile durante il recupero della retina. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 Confronto tra una buona e una cornea scarsa qualità:. A) una cornea correttamente asportato. Tale cornea viene solitamente conservato sotto coltura organo per 4 settimane. Microbiologica (utilizzando BACTEC 9240 strumento) e morfologiche (colorazione delle cellule con trypan blu per la determinazione delle cellule di mortalità e di osservare le cellule al microscopio ottico con ingrandimento 100X) l&#39;esame viene eseguito prima del trasporto in ospedale (Figura 3a), b) una cornea piegato , che finisce per rigetto dell&#39;innesto a causa pieghe alta Descemet e alta danni alle cellule endoteliali esaminato usando un microscopio lampada a fessura. Tale cornea è di solito utilizzato per la research o viene scartato. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Metodo utilizzato per garantire un accurata asportazione del tessuto retinico. A) Uno sguardo all&#39;interno sclera dal globo oculare con lama di 24 millimetri con 95 millimetri curva o le forbici spuntate finali sterili e 100 11x2 mm retti da 0.70 mm Pinza denti sterili. La sclera dovrebbe essere tagliato tenendo un lato con le pinze che il taglio dritto verso il nervo ottico con le forbici. Lo strato coroide sarà ora facilmente visibili; b) L&#39;uso di due 100 11x2 mm retti da 0.70 mm denti pinze sterili, coroide viene rimosso strapparla a parte, che rivela il sottostante strato trasparente della retina; c) trasparente strato retinico viene asportato con molta attenzione nei pressi di il nervo ottico, senza l&#39;escrezione di fluido vitreale con le pinze stesse. Entrambe le pinze dovrebbe contenere entrambi i lati della retina e del tessuto deve essere rimosso con delicatezza starting vicino al nervo ottico verso la cornea, per ottenere una buona quantità di tessuto retinico. Il tessuto può essere tagliato in diverse dimensioni e utilizzato per esperimenti di analisi; d) diversi strati della cornea dell&#39;occhio dopo la rimozione può essere visualizzato in questa figura. Il corpo coroide viene rimosso prima seguita da retina senza danneggiare le altre parti dell&#39;occhio. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Confronto tra diversi tipi di densità e la morfologia cellulare visti sotto ingrandimento 100X di un microscopio ottico. A) buona densità delle cellule endoteliali (&gt; 2200 cellule / mm 2) e la morfologia (meno polimorfismo, degenerazione bassa, non distrofia e 0% mortalità) in una cornea che è adatto al trapianto; b) scarsa densità delle cellule endoteliali (circa 1200 - 1400 cellule / mm 2) e morfologia (polimorfismo molto elevata e Degenperazione di cellule) con circa il 30-40% di mortalità totale sono stati osservati dopo colorazione blu tripano, c) Una parte di cellule endoteliali sono danneggiati a causa di distacco di un foglio endoteliale della cornea durante il recupero dal globo oculare. Ciò è confermato osservando la mortalità delle cellule nella regione tinto trypan blue, d) pieghe Il Descemet si formano a causa della cattiva gestione cornea mediante piegatura, creando croce tensione corneale, utilizzando gli strumenti intensamente etc al momento di escissione. La figura mostra le spesse pieghe sviluppati iatrogene trovati tra la periferia e zona ottica della cornea. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Danni Figura 4. Alla coroide e retina tessuti mentre escissione della cornea, infine, porta a escrezione di fluido vitreo. La retina viene implicato nel corpo vitreo rendendo difficile accise una buona qualità del tessuto wiThout contaminazione. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765table1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Sintesi della gamma delle attività svolte con globi oculari umani nel corso del 2009 e il 2010 presso la Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italia). Circa il 60% dei tessuti sono stati utilizzati per i trapianti, lasciando così un elevato numero di globi oculari (circa il 40%) per la ricerca scientifica e medica. <img src="/files/ftp_upload/3765/3765fig1sup.jpg" alt="Supplementare Figura 1" /> Supplementare Figura 1. Anatomia dell&#39;occhio umano 5. Varie parti dell&#39;occhio umano sono indicati in questa figura, utilizzata per seguire la posizione esatta dei tessuti.

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

Entrambi, l&#39;escissione e la corretta conservazione dei tessuti corneali e retiniche sono fondamentali come difetti minori come il danno endoteliale o elevato numero di pieghe Descemet può portare al fallimento del trapianto di cornea, mentre alterazioni di temperatura o di maltrattamento può compromettere l&#39;integrità dei tessuti retinici. Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare come i tessuti corneali e retiniche possono essere isolate in modo ottimale, senza indurre danni o alterazioni che possono co...

Materiali per l&#39;asportazione della cornea e della retina. <table border="1"><tbody><tr><td> Descrizione del prodotto </td><td> Dimensioni </td><td> Azienda / Istituto </td></tr><tr><td> Custodito bisturi monouso </td><td> Lama taglia 15 </td><td> Swann-Morton </td></tr><tr><td> Bende sterili </td><td> 5 cm x 5 cm, 8 strati, 5 pezzi </td><td> Artsana </td></tr><tr><td> Sterile asciugamano usa e getta medica </td><td> 35 X 50 cm </td><td> U.Jet </td></tr><tr><td> Forbici sterili </td><td> Lame 24 mm / lunghezza complessiva. 95 mm curvato, smussato </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Pinza sterile </td><td> In acciaio inox -100 mm 11 X 2 governato da 0,70 mm denti </td><td> e.janach </td></tr><tr><td> Corneale claw - dispositivi medici monouso </td><td></td><td> NIIOS (Hippocratech) </td></tr&gt; <tr><td></td><td> Preparativi </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 100 ml di PBS [10x] in 900 ml d / w (acqua distillata) </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Na-tiosolfato </td><td> 1 gm Na-tiosolfato in 1 litro di PBS [1x] </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> I-PVP </td><td> 5 gm I-PVP in 1 litro d / w </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr></tbody></table> Tabella 2. La tabella descrive i materiali utilizzati per escissione della cornea e della retina e la società sono ricevute dal. Materiali per supporto di memorizzazione (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> MEM(1X) di liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1900 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Antibiotico / antimicotico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5955-20ML </td><td> 10 ml / l </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Newborn di siero di vitello </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td><td> 40 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Materiali per supporto di memorizzazione. Preparazione del supporto di memorizzazione Aggiungere tutti gli ingredienti utilizzando le concentrazioni di specifici sopra riportati in un barattolo e mescolare bene. Filtra lorocon dimensione dei pori di 0,2 micron (Millipore, Milano, Italia) con l&#39;aiuto di una pompa peristaltica. Conservare il terreno nelle bottiglie a temperatura ambiente. Materiali per mezzo di trasporto (2000 ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Componenti </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> MEM (1X) di liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 32360-034 </td><td></td><td> 1800 ml </td></tr><tr><td> Sodio piruvato </td><td> Invitrogen </td><td> 11360-039 </td><td> 1mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-032 </td><td> 2 mM (10 ml / l) </td><td> 20ml </td></tr><tr><td> Newborn di siero di vitello </td><td> Invitrogen </td><td> 26010-74 </td><td> 2% (20 ml / l) </td&gt; <td> 40 ml </td></tr><tr><td> Destrano T500 </td><td> Pharmacosmos </td><td> 551005004007 </td><td> 6% (60 g / litro) </td><td> 120 g / l </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Materiale per mezzo di trasporto. Preparazione del mezzo di trasporto Aggiungi Destrano 6% in ~ 1,5 litri di MEM e lasciare tutta la notte. Aggiungere il resto degli ingredienti nei media e filtrare su 0,2 micron (Millipore, Milano, Italia) utilizzando una pompa a vuoto. Conservare il terreno nelle bottiglie a temperatura ambiente.

a simplified technique for in situ excision of cornea and evisceration of retinal tissue from human ocular globe

Enucleazione è il processo di recupero del globo oculare da un donatore cadavere lasciando il resto del globo indisturbata. Escissione si riferisce al recupero dei tessuti oculari, in particolare cornea, tagliandolo separato dal globo oculare. L&#39;eviscerazione è il processo di rimozione degli organi interni di cui qui retina. Il globo oculare consiste nella cornea, sclera, il corpo vitreo, la lente, l&#39;iride, la retina, coroide, etc muscoli (Suppl. Figura 1). Quando un paziente è affetto da danno corneale, la cornea deve essere rimosso e un sano deve essere trapiantato da interventi cheratoplastica. Malattie genetiche o difetti della funzione retinica, può compromettere la visione. Globi oculari umani possono essere utilizzate per varie procedure chirurgiche come banche degli occhi, il trapianto di cornea o la sclera umana e ricerca su tessuti oculari. Tuttavia, vi sono poche informazioni disponibili sulla cornea umana escissione e della retina, probabilmente a causa della Limited accessibilità ai tessuti umani. La maggior parte degli studi che descrivono procedure simili vengono eseguiti su modelli animali. Ricercatori contare sulla disponibilità di tessuti oculari adeguatamente sezionati e ben conservata al fine di estendere la conoscenza sui diritti umani lo sviluppo degli occhi, l&#39;omeostasi e la funzione. Come riceviamo elevata quantità di globi oculari di cui circa il 40% (Tabella 1) di essi sono utilizzati per scopi di ricerca, siamo in grado di eseguire la grande quantità di esperimenti su questi tessuti, la definizione di tecniche per accise e conservare regolarmente. La cornea è un tessuto avascolare che consente la trasmissione della luce sulla retina e per questo scopo deve sempre mantenere un buon grado di trasparenza. All&#39;interno della cornea, la regione limbus, che è un serbatoio delle cellule staminali, aiuta la ricostruzione delle cellule epiteliali e limita la crescita eccessiva della congiuntiva mantenere trasparenza corneale e chiarezza. La dimensione e th<html> ickness della cornea sono essenziali per la visione chiara, come cambiamenti di una di esse potrebbe portare a distrarsi, la visione chiara. La cornea è composto da 5 strati: a) epitelio, b) strato di Bowman, c) stroma, d), della membrana di Descemet e e) endotelio. Tutti i livelli dovrebbe funzionare correttamente per garantire una visione chiara 4,5,6. La coroide è la tunica intermedia tra la sclera e retina, delimitata all&#39;interno dalla membrana del Bruch ed è responsabile del flusso di sangue nell&#39;occhio. Il coroide aiuta anche a regolare la temperatura e fornisce nutrimento per gli strati esterni della retina 5,6. La retina è uno strato di tessuto nervoso che copre la parte posteriore del globo oculare (Suppl. figura 1) e consiste di due parti: una parte fotosensibile e un non-ricettivo dell&#39;articolo. La retina aiuta a ricevere la luce dalla cornea e del cristallino e lo converte in energia chimica eventualmente trasmessa al cervello con l&#39;aiuto del nervo ottico 5,6. ove_content &quot;&gt; Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la dissezione dei tessuti corneali e retiniche da globi oculari umani. Evitare la contaminazione incrociata con i tessuti adiacenti e preservando l&#39;integrità dell&#39;RNA è di fondamentale importanza in quanto tali tessuti sono indispensabili per scopi di ricerca finalizzati a (i) che caratterizza il trascrittoma dei tessuti oculari, (ii) isolare le cellule staminali per i progetti di medicina rigenerativa, e (iii) valutare le differenze istologiche tra i tessuti normali da / soggetti interessati. In questo articolo descriviamo la tecnica attualmente si sta adoperando per rimuovere la cornea, la coroide e dei tessuti retinici da un globo oculare. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la dissezione del globo oculare umana e l&#39;asportazione dei tessuti corneali e retiniche. Il video di accompagnamento aiuterà i ricercatori a imparare una tecnica appropriata per il recupero di preziosi tessuti umani, che sono difficili da trovare regolarmente.

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A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Il documento descrive una tecnica semplificata per corneale accise e di sviscerare i tessuti della retina dal globo oculare di donatori cadaveri umani. La tecnica qui descritta aiuterà a accise tessuti di buona qualità da usare per il trapianto, a fini chirurgici o di ricerca senza danneggiare altri tessuti del globo oculare.

Una tecnica semplificata per<em&gt; In situ</emEscissione&gt; della cornea e l&#39;eviscerazione del tessuto retinico dal globo oculare umano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

20.7K Views.  Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S.. Il documento descrive una tecnica semplificata per corneale accise e di sviscerare i tessuti della retina dal globo oculare di donatori cadaveri umani. La tecnica qui descritta aiuterà a accise tessuti di buona qualità da usare per il trapianto, a fini chirurgici o di ricerca senza danneggiare altri tessuti del globo oculare.

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Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Tecnica per raccogliere fungiformi (Gusto) Papille da lingua umana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Ricerca

Medicina

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work well in non-ischemic wounds may not work in human diabetic wounds because vasculopathy is one major factor that hinders healing of these wounds. We published an article in 2007 describing a rabbit ear ischemic wound model created by a minimally invasive surgical technique. Since then, we have further simplified the procedure for easier operation. On one ear, three small skin incisions were made on the vascular pedicles, 1-2 cm from the ear base. The central artery was ligated and cut along with the nerve. The whole cranial bundle was cut and ligated, leaving only the caudal branch intact. A circumferential subcutaneous tunnel was made through the incisions, to cut subcutaneous tissues, muscles, nerves, and small vessels. The other ear was used as a non-ischemic control. Four wounds were made on the ventral side of each ear. This technique produces 4 ischemic wounds and 4 non-ischemic wounds in one animal for paired comparisons. After surgery, the ischemic ear was cool and cyanotic, and showed reduced movement and a lack of pulse in the ear artery. Skin temperature of the ischemic ear was 1-10 &deg;C lower than that on the normal ear and this difference was maintained for more than one month. Ear tissue high-energy phosphate contents were lower in the ischemic ear than the control ear. Wound healing times were longer in the ischemic ear than in the non-ischemic ear when the same treatment was used. The technique has now been used on more than 80 rabbits in which 23 were diabetic (diabetes time ranging from 2 weeks to 2 years). No single rabbit has developed any surgical complications such as bleeding, infection, or rupture in the skin incisions. The model has many advantages, such as little skin disruption, longer ischemic time, and higher success rate, when compared to many other models. It can be safely used in animals with reduced resistance, and can also be modified to meet different testing requirements.

We have developed a minimally invasive technique to create a rabbit ischemic ear wound model by dividing the central artery and nerve and the cranial neurovascular bundle. A subcutaneous tunnel then cuts all subcutaneous tissues. This procedure causes minimal skin disruption and can be safely used in diabetic animals.

Una tecnica semplificata per produrre un modello di lesione ischemica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-elettrodi array registrazioni di umano Epileptic postoperatoria corticale del tessuto

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Isolamento e Asportazione di Murine Aorta; Una tecnica versatile nello studio delle malattie cardiovascolari

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Effect of Artificial Tear Formulations on the Metabolic Activity of Human Corneal Epithelial Cells after Exposure to Desiccation

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear formulations that prevent cell desiccation will result in ocular surface protection and the maintenance of cell metabolic activity. During dehydration, cells undergo the process of loss of metabolic activity and subsequently cell death. This work describes a method for assessing the efficacy of artificial tear formulations. The metabolic dye (i.e., alamarBlue) changes from a low fluorescent molecule resazurin to a fluorescent molecule resorufin in viable cells. The biological performance of an artificial tear formulation is measured as the ability of the formulation to (a) maintain cell viability and (b) provide cell protection from desiccation. Growth media and saline are used as controls for the cell viability/desiccation tests. Cells are incubated with test solutions for 30 min and then desiccated for 0 or 5 min at 37 &#176;C and 45% relative humidity. Cell metabolic activity after initial exposure and after cell desiccation is then determined. The results show the comparative effects of eye drop formulations on cell metabolic activity and desiccation protection. This method can be used to test dry eye formulations that are designed to treat individuals with evaporative dry eye.

The purpose of this protocol is to evaluate if different artificial tear formulations can protect human corneal epithelial cells from desiccation using an in vitro model. After exposure to artificial tear formulations and desiccation, human corneal epithelial cells are assessed for metabolic activity.

Effetto delle formulazioni lacrimali artificiali sull'attività metabolica delle cellule epiteliali corneali umane dopo l'esposizione all'essiccazione

Artificial lipid-containing tear formulations are developed to reduce tear evaporation by the restoration of a deficient tear lipid layer. Artificial tear ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Human Subcutaneous Adipose Tissue Sampling Using a Mini-Liposuction Technique

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate training and strict adherence to aseptic technique, subcutaneous adipose samples can be safely and efficiently obtained in a non-clinical setting by researchers. Following the administration of local anesthetic lateral to the umbilicus, a 14 G needle attached to a 5 or 10 mL syringe is inserted through the skin into the subcutaneous tissue. Under suction, the syringe is moved in a reciprocating, slicing motion to isolate fragments of adipose tissue. Withdrawing the plunger is enough to ensure that adipose tissue fragments are aspirated through the needle into the syringe. A single biopsy can collect about 200 mg of tissue. This biopsy technique is very safe for both participants and research staff. Following the biopsy, participants can resume most everyday activities, although they should avoid swimming and overly strenuous activities for 48 h to avoid excessive bleeding. Participants can safely undergo 2 biopsies within a single day, meaning that the technique can be applied in before-after acute intervention studies.

The manuscript and associated video demonstrate a percutaneous biopsy technique to obtain samples of subcutaneous adipose tissue from areas surrounding the umbilicus. This method is a low-risk and efficient way to investigate a range of parameters (e.g., gene or protein expression, enzyme activity, lipid content) within adipose tissue.

Campionamento del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando una tecnica di mini-liposuzione

Studies on adipose tissue are useful in understanding metabolic and other conditions. Human subcutaneous adipose tissue is accessible. With appropriate ...