La ricerca oculare nei primi tempi si basava principalmente sul tessuto oculare di individui deceduti. Tuttavia, nel corso degli anni, sono stati sviluppati molti modelli oftalmici di roditori e la necessità di tessuto oculare umano è diminuita. A causa delle piccole dimensioni e della limitata area di operazioni nell'occhio del roditore, l'accesso effettivo alle sottoparti oculari è severamente limitato.
Tipicamente, per operare sull'occhio di un roditore, l'occhio viene immobilizzato attraverso il nervo ottico e viene eseguita la dissezione. Questa pratica è ardua e può danneggiare il tessuto fragile mentre l'occhio sferico continua a muoversi durante la dissezione. Nonostante sia utile nell'isolare le varie sezioni degli strati retinici, questa tecnica non può delimitare l'orientamento spaziale del tessuto dopo la dissezione del tessuto.
Inoltre, un intervento mirato è difficile da individuare dopo la dissezione a causa dell'assemblaggio cellulare omogeneo della coppa oculare posteriore e anteriore. In questo video viene dimostrato un metodo chirurgico modificato per la microdissezione. La presenza della membrana nittitante attaccata, o della terza palpebra, presenta vantaggi unici e significativi.
In questo metodo, prima il bulbo oculare viene enucleato con la terza palpebra, quindi la terza palpebra viene utilizzata per immobilizzare l'occhio. È seguito dal perforamento del bulbo oculare attraverso il limbus corneale e l'incisione viene utilizzata come punto di ingresso. Quindi, tagliando lungo la circonferenza, le coppe oculari anteriori e posteriori vengono separate.
Sezionando ulteriormente la coppa oculare posteriore, lo strato traslucido della retina neurale viene identificato e rimosso delicatamente. I livelli neurale e RPE sono così ottenuti per ulteriori elaborazioni. La terza palpebra ci permetterà di demarcare l'orientamento spaziale dell'occhio dopo l'enucleazione.
Seguiamo ora una procedura dettagliata passo dopo passo. Dilatare gli occhi dei roditori usando una goccia di 0,8% di tropicamide e 5% di soluzioni oftalmiche di fenilefrina e posizionare l'animale in una zona buia per 30 minuti prima della procedura. Eutanasia l'animale somministrando per via intraperitoneale cinque volte dosi di anestesia.
Una dose tipica è di 200 microlitri di PBS contenente 10 mg di ketamina e un mg di xilazina. Confermare la completa mancanza di risposta allo stimolo esaminando il riflesso del pedale. Posizionare il mouse in posizione sdraiata laterale per consentire l'accesso completo all'occhio.
Tenere una pinza da sutura Colibri, una pinza curva, una micro-lama di 15 gradi di tre millimetri, micro-forbici a molla e una micro-forbice a molla angolata pronta per la procedura. Posizionare una pinza curva intorno al bulbo oculare e pizzicare per liberare l'occhio da attacchi estranei. La terza palpebra, nota anche come membrana nittitante, si trova verso l'angolo superiore della tangente nasale e può essere identificata come una protuberanza traslucida minore con bordi pigmentati.
Quindi, utilizzare un micro-forbice a molla e tagliare intorno al bulbo oculare. Piccoli tagli continui liberano il bulbo oculare dagli attacchi sclerali. Posizionare un micro-forbice a molla curva sotto il bulbo oculare per liberare l'occhio tagliando il nervo ottico.
Posizionare l'occhio enucleato in una capsula di Petri contenente tampone PBS in modo tale che il bulbo oculare sia immerso in PBS. Alcuni muscoli o tessuti extraoculari inizieranno a galleggiare lontano dal bulbo oculare. Rimuovili tagliandoli dal bulbo oculare usando micro-forbici a molla.
Quindi, rimuovere il nervo ottico dalla base del bulbo oculare per consentire una migliore separazione della retina per i preparati wholemount. Non è necessario rimuovere il nervo ottico per il sezionamento dei tessuti. Trasferire il bulbo oculare in un tubo da 1,5 ml contenente un ml di paraformaldeide o PFA al 4%.
Tenerlo per due ore a quattro gradi Celsius per la fissazione dei tessuti. È possibile mettere in pausa in questa fase lasciando il tessuto in PFA per un massimo di 12 ore a quattro gradi Celsius. Tuttavia, per l'isolamento delle cellule vive, le fasi di fissazione non devono essere eseguite e l'intera procedura deve essere eseguita in continuo.
Dopo la fissazione del PFA, trasferire il bulbo oculare in una capsula di Petri contenente PBS e metterlo sotto un microscopio da dissezione per eseguire la procedura successiva. Immobilizzare il bulbo oculare tenendo saldamente la terza palpebra con una pinza da sutura Colibri. Il limbus è la giunzione sclertale corneale.
Fai una piccola incisione al limbus perforandolo usando una microlama. L'incisione è fatta preferibilmente di fronte alla terza palpebra. Successivamente, usando questa incisione come punto di partenza, con la micro-forbice fai piccoli e continui tagli lungo questa circonferenza del limbus scleral corneale.
Per prima cosa, completa un semicerchio di tagli a partire dal punto di incisione fino alla terza palpebra. Quindi completare il semicerchio rimanente di tagli sull'altro lato. Infine, fai un taglio intorno alla terza palpebra per separare la coppa posteriore e quella anteriore.
Rimuovere la lente dalla coppa posteriore usando una pinza per ottenere la coppa posteriore composta da retina neurale e strato RPE e la coppa anteriore corneale. Se si lavora con tessuti non fissi, le coppe anteriore e posteriore possono ora essere digerite enzimaticamente per ottenere la sospensione unicellulare corneale o retinica. Per fissare i fazzoletti, trasferire queste coppette in un tubo da 1,5 ml contenente 1 ml di 4% di PFA per 12 ore a quattro gradi Celsius.
Dopo la fissazione, il tessuto può essere incorporato in un mezzo appropriato e la criosezione o il sezionamento di paraffina possono essere eseguiti per ottenere sezioni corneali o retiniche. Reintrodurre la coppa posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS. Uno strato opaco sullo strato RPE pigmentato è la retina neurale.
Staccare la retina neurale usando una seconda pinza. Un movimento della mano molto delicato e leggero è altamente raccomandato per non danneggiare il tessuto. Al nervo ottico, uscita, le forbici a molla curve possono essere inserite sotto la retina neurale e un taglio può essere fatto per liberare completamente gli strati se la retina neurale rimane attaccata.
La retina può anche essere liberata o staccata accarezzandola delicatamente con una spazzola morbida. Reintrodurre le coppe anteriore e posteriore nella capsula di Petri contenente tampone PBS. Utilizzare un micro-forbice a molla angolato per effettuare un taglio vicino alla terza palpebra dalla periferia perpendicolarmente verso il centro ottico.
Mantenere una presa della terza palpebra e fare un taglio accanto al primo taglio. Fai un taglio simile tra il secondo taglio e la terza palpebra. Tre o quattro tagli equidistanti aprono le coppe emisferiche in una forma di fiore, che cade piatta e può essere facilmente montata.
Non effettuare tagli molto profondi fino al centro della tazza, in quanto ciò potrebbe far sì che le sezioni fogliari si sfaldino o si separino facilmente. Il mezzo liquido consente alla coppa oculare anteriore di raggiungere una struttura curva. Seguire gli stessi passaggi indicati per effettuare tagli sulla coppa posteriore per effettuare tre o quattro tagli equidistanti sulla coppa anteriore.
I tessuti sono ora pronti per un'ulteriore colorazione. In questa figura viene mostrato l'intero monte della coppa anteriore. Il tessuto corneale è stato microdissezionato come descritto per rivelare i vasi linfatici nel tessuto congiuntivale attaccato del foglietto corneale.
In questa figura viene mostrato l'intero monte della retina neurale. La vascolarizzazione retinica della retina neurale è stata colorata con isolectina ed è visibile come vasi verdi. In questo metodo, il bulbo oculare enucleato dei topi è ottenuto con la terza palpebra attaccata per una manipolazione efficace e facile.
La terza palpebra immobilizza completamente il bulbo oculare e consente alla dissezione di procedere con facilità e minimi errori. Questo metodo è vantaggioso per il sezionamento specifico del tessuto oculare, l'analisi di singole cellule e interi. Tuttavia, la necessità di una fissazione ripetitiva del tessuto rende il tessuto non vitale per la coltura cellulare o tali necessità di cellule vive.
Quindi, la procedura deve essere eseguita in continuo per l'isolamento delle cellule vive.
