Questo lavoro è stato sostenuto da Marie Curie internazionale reinserimento sovvenzione.

1. Dispositivo Fabrication <ol><li> Acquistato DTPA-D SU-8 stampo controllo e SPR220-7 flusso stampo dal Microfluidica Stanford Fonderia ( <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / group / fonderia</a> ). </li><li> Esporre gli stampi in silicone per clorotrimetilsilano (TMCS) vapore per 10 minuti per promuovere il rilascio elastomero dopo i passi di cottura 9. </li><li> Preparare una miscela a base di elastomeri di silicone e l&#39;agente reticolante (mescolare bene) in due diversi rapporti 5:1 e 20:1 per il controllo di flusso e stampi, rispettivamente. I diversi rapporti sono necessari per il legame corretto di strati multipli. </li><li> Versare il 05:01 PDMS sul livello di controllo (circa 5 mm di altezza). Degassare il livello di controllo e cuocere per 30 min a 80 ° C. Coat Spin (Laurell, USA) la miscela 20:01 PDMS sullo strato flusso a 2.600 rpm per 60 sec e poi cuocere a 80 ° C per 30 min. La velocità rivestitore a rotazione è ottimizzata per l&#39;azionamento della valvola a pressionedi 15 psi. Veloci filatura si tradurrà in uno strato sottile con pressione di attivazione inferiore e viceversa. I dispositivi che utilizziamo hanno un limite di 25 psi nel controllo e 10 psi nel flusso, sopra il quale distacco dal substrato. </li><li> Separare il livello di controllo dallo stampo. Fallo lentamente e fare attenzione a non sbucciare il modello SU8. Poi tagliare il dispositivo attorno al suo perimetro e fori di perforazione per accedere ai canali di controllo. </li><li> Allineare il flusso e livelli di controllo manualmente in uno stereoscopio. Avviare allineando l&#39;angolo superiore sinistro, il pulsante di valvola (livello di controllo) deve essere al centro della camera di reazione (strato di flusso). Quindi, allineare la prima fila e delicatamente rilasciare il livello di controllo riga per riga. Assicurarsi che tutte le valvole di pulsante sono al centro delle camere di reazione e che le valvole di ingresso e di indirizzo attraversare i canali di flusso nella posizione corretta. Il processo può essere ripetuto fino localmente tutte le righe sono allineate. Alla fine, decontratturante nel b PDMSy sollevandolo con cura dai lati e gli angoli. Non sollevare troppo o disallineamento possono verificarsi. </li><li> Cuocere per 2 ore a 80 ° C. </li><li> Tagliare lungo il perimetro del dispositivo e il dispositivo buccia due strati (chip) dallo stampo flusso. Perforare per accedere ai canali di flusso (Figura 1). </li></ol> 2. DNA formare gli array e allineamento del dispositivo <ol><li> Produrre geni sintetici di gruppo del PCR. I geni sintetici sono comporre di promotore T7, sito di legame di ribosoma (RBS), ORF con due tag epitopi (uno ad ogni estremità), e terminatore T7 4. I geni possono variare in lunghezza da 100 bp a, almeno, 5000 bp. </li><li> Preparare i geni sintetici per formare gli array: preparare una miscela di etilene glicole poli (1,25%) e D-trealosio diidrato (125 mg / ml) ed erogare 2 microlitri per reazione in 384 pozzetti della piastra. Questa soluzione ridurrà legame irreversibile del DNA per il vetro e per visualizzazione durante allineamento 10. </li&gt; <li> Trasferire i geni sintetici alla piastra a 384 pozzetti. Solitamente concentrazioni di DNA può variare da 10 ng / pl a 100 ng / pl concentrazione finale. Aggiungi dH 2 O ad un volume finale di 20 microlitri (dipende dal tipo di micro-distributore e pin). </li><li> Spot di una serie di geni sintetici su substrati di vetro con rivestimento epossidico con un micro-distributore. Usiamo microgrid 610 (Bio Robotica) con SMT-S75 perni in silicone (sintesi parallela, USA). Contattare la stampa del DNA, con questi pin specifici, i risultati in macchie con diametro di circa 100 micron sulla superficie del vetro. Ogni carico pin è sufficiente per circa 100 posti auto. Assicurarsi che i campi riga e di colonna coincidere con il dispositivo utilizzato. Il dispositivo che usiamo contiene 16 colonne e 40 righe con un passo di 680 micron per 320 micron, rispettivamente. </li><li> Manualmente allineare il dispositivo a microfluidi alla matrice gene sotto uno stereoscopio. Lo spot DNA dovrebbe essere al centro delle camere di DNA. Avviare l&#39;allineamento individuando la prima fila di punti below la prima fila di camere di DNA. Poi, ravvicinare il resto delle righe finitura con regolazione fine dell&#39;intero dispositivo. Una volta che l&#39;array è allineato occorre prestare attenzione per alleviare qualsiasi stress nel PDMS, sollevandola localmente. Se vi è tensione lasciato nel PDMS non possono legarsi bene al microarray. </li><li> Infine, il dispositivo di vincolo al vetrino da incubazione per una notte su una piastra calda a 80 ° C. </li></ol> 3. Adescamento e attivazione del dispositivo <ol><li> Le valvole del livello di controllo sono azionati dal computer utilizzando LabVIEW. Lo script LabVIEW controlla una serie di elettrovalvole micro tramite una centralina elettronica (acquistato da Stanford Microfluidica Foundry). Il collettore elettrovalvola è collegata ad aria compressa, che controllano il flusso d&#39;aria e la pressione nelle valvole di controllo del dispositivo. </li><li> Collegare il dispositivo al collettore elettrovalvole utilizzando un tubo flessibile di plastica con diametro interno di 0,02 &quot;(Tygon) E spillo in acciaio inox (New England piccoli tubi Corporation). </li><li> Riempire i tubi con DDW e inserire il perno nei fori di accesso del livello di controllo. Assicurarsi che ogni tubo è collegato al suo canale di controllo corrispondente. </li><li> Eseguire l&#39;applicazione LabVIEW sul computer per attivare i canali di controllo. Attivando la valvola dallo script LabVIEW, si applica pressione dell&#39;aria, che a sua volta spingere l&#39;acqua nei canali di controllo PDMS. Impostare la pressione dell&#39;aria a 5 psi. Si raccomanda di riempire il &#39;sandwich&#39; e le valvole primo indirizzo, al fine di individuare incrociati colloqui tra canali di controllo di dispositivi difettosi. In caso di cross-colloqui, attuazione della linea di &#39;sandwich&#39; di controllo comporterà l&#39;azionamento o al collo o linee di controllo pulsante. Questo è simile a un corto in un circuito elettrico. Un dispositivo con cross-talk è difettoso e non può essere utilizzato. </li><li> Dopo che tutti i canali di controllo e le valvole sono pieni di DDW, le valvole sono preparati e Ready per bloccare i canali di flusso sotto di loro. Aumentare la pressione dell&#39;aria a 15 psi. Attivazione della valvola è controllata da un programma LabVIEW attraverso una serie di on / off switch collegati a singole elettrovalvole. Ogni interruttore controlla una specifica linea di comando attraverso la elettrovalvola corrispondente. Accendere l&#39;interruttore (nello script) si applica pressione dell&#39;aria nel tubo corrispondente. La pressione dell&#39;aria spingerà la DDW nella linea di comando e provocherà espansione delle valvole microfluidica, bloccando il canale sottostante. Spegnere una valvola di controllo, riduce la pressione dell&#39;aria e successivamente rilasciare il blocco del canale rispettivo flusso. </li><li> Per garantire che tutte le valvole sono aperte, collegare un tubo ad uno degli ingressi di flusso e il flusso d&#39;aria nel dispositivo al 4-5 psi. Questo rilascerà le eventuali valvole appiccicose dal vetrino. </li><li> Infine, il dispositivo è innescata e pronta. Chiudere tutti gli input e &#39;collo&#39; valvole, per avviare la chimica di superficie. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Superficie Chimica <ol><li> Per facilitare l&#39;auto-assemblaggio di una matrice proteica sulla superficie e prevenire adsorbimento non specifico all&#39;interno del dispositivo microfluidico, la superficie è modificata chimicamente: </li><li> Un componente di fluire attraverso il dispositivo, collegare un tubo nuovo con la soluzione richiesta ad uno dei canali di flusso del dispositivo. Collegare il lato libero del tubo al collettore manuale e aprire il flusso di pressione dell&#39;aria (5 psi). </li><li> 40 pl di caricare biotinilato-BSA (1 mg / mL) in una nuova provetta e flusso di circa la metà per 20 min attraverso il dispositivo, la BSA si legano alla superficie epossidica. </li><li> Utilizzare Hepes (50 mM) per il lavaggio del substrato non reagito tra ciascuna delle diverse fasi chimica di superficie. </li><li> Flusso 25 Strepavidin pl (0,5 pg / pl) per 20 min in cima alla biotinilato-BSA. </li><li> Lavare con Hepes per 5 min. </li><li> Chiudere la valvola di &#39;pulsante&#39; e scorrere il resto del biotinilato-BSA (come descrittoletto sopra), la passivazione della superficie intorno al pulsante. </li><li> Lavare con Hepes per 5 min. </li><li> Rilasciare la valvola &#39;pulsante&#39; e flusso 30 ml di penta-His-biotina (0,16 mg / mL) per 20 min. L&#39;anticorpo si legherà alla strepavidin esposta; specificamente per l&#39;area sotto il &#39;pulsante&#39; la creazione di un anti His-tag matrice. </li></ol> 5. L&#39;espressione della proteina <ol><li> Esprimere le proteine ​​sul dispositivo utilizzando coniglio reticolociti rapida trascrizione accoppiata e la reazione di traduzione. L&#39;espressione proteica dai geni maculate sintetiche sul dispositivo crea una matrice di proteine ​​pronte per l&#39;uso. Per esempio, un tale uso è per uno schermo legame proteico. </li><li> Aprire il &#39;collo&#39; valvole e coniglio trascrizione flusso reticolociti rapido accoppiato e la reazione di traduzione attraverso il dispositivo nella camera di DNA. Quindi, chiudere le valvole di &quot;sandwich&quot; e separare ogni gene dal suo ambiente. Incubare il dispositivo su una piastra calda per 2,5 ore a 30 ° C. Espresso proteins diffonderà dalla camera di DNA alla reazione spontanea camera (collo valvola è aperta) e si legano al suo anticorpo anti-sotto la valvola &#39;pulsante&#39; immobilizzare la proteina attraverso il suo C-terminale tag. </li><li> Etichettare le proteine ​​con C-myc anticorpo Cy3. L&#39;anticorpo si lega al suo epitopo corrispondente trova alla proteina N-terminale. </li><li> Determinare i livelli di espressione della proteina con un scanner per microarray (LS Reloaded, Tecan) utilizzando un laser a 532 nm e 575 nm di emissione del filtro. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi 1. Dispositivo Fabrication Disegno grafico del dispositivo è stato creato da AutoCAD in base alle nostre esigenze sperimentali. Il disegno è stato stampato su una pellicola trasparente da una alta risoluzione setter immagine. Questa trasparenza serve come fotomaschera in contatto fotolitografia. Una tecnica di surface micromachining stato usato per creare modelli 3-D su un wafer di silicio determinato dai modelli incisi su tegli maschere utilizzate. Il dispositivo microfluidico è stato fabbricato in silicone stampo di colata elastomero siliconico polidimetilsilossano (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, USA) (Figura 1). Ogni dispositivo è costituito da due strati allineati PDMS, il flusso e lo strato di controllo. Lo stampo è stato mostrato clorotrimetilsilano (TMCS, Aldrich) vapore per 10 min per promuovere il rilascio elastomero dopo le fasi di cottura. Una miscela di elastomero a base di silicone e catalizzatore è stato preparato in due diverso rapporto 5:1 e 20:1 per il controllo di flusso e stampi, rispettivamente. Lo strato di controllo è stata degassata e cotto per 30 min a 80 ° C. Lo strato flusso inizialmente rivestita per centrifugazione (Laurell, USA) a 2.600 rpm per 60 sec e cotto a 80 ° C per 30 min. Lo strato di controllo è stato separato dal suo stampo e di controllo di accesso al canale fori sono stati perforati. Successivamente, gli strati di flusso e di controllo sono stati allineati manualmente in uno stereoscopio e cotto per 2 ore a 80 ° C. I due dispositivo di strato è stato pelato from lo stampo flusso e canali di flusso di accesso fori sono stati perforati. 2. Descrizione periferica La capacità del dispositivo può variare da 500 fino a 10.000 celle unitarie (Figura 2). Il dispositivo è costituito da due strati: strato di flusso (grigio) e lo strato di controllo (colore). Lo strato di controllo contiene una serie di valvole con funzione diversa. Ciascuna cella unitaria, nello strato di flusso, è composto da un DNA e una camera di reazione e viene controllata da tre tipi di valvole micromeccanici; &#39;collo&#39;, &#39;pulsante&#39;, e &#39;sandwich&#39; (Figura 2A). &#39;Gene sintetico&#39; A maculato depositato all&#39;interno della camera di DNA è bloccato dalla camera di reazione dalla valvola &#39;collo&#39; (verde). Lavaggio cattura e meccanica di proteine ​​di superficie associati in camera di reazione viene eseguita dalla valvola &#39;pulsante&#39; (blu). La valvola di &#39;sandwich&#39; permette ad ogni reazione avvenga in una cella propria unità (rosso). Le valvole di indirizzo può dividere il dispositivo fino a 8 sezioni indipendenti, per different condizione di test. Inoltre, il livello di controllo contengono valvole di ingresso che permettono il flusso di fluido selezionato nello strato flusso. I canali di controllo PDMS sono pieni di DDW. Quando una valvola viene azionata l&#39;aumento di pressione (15 psi) provoca l&#39;espansione del PDMS. In luoghi dove la membrana è sufficientemente sottile (cioè attraversamento di comando e linee di flusso) è sufficiente a bloccare completamente la linea di flusso. Media altezza cella unitaria è di 10 micron, e il volume medio cella unitaria è inferiore a 1 nl. 3. Proteine ​​Espressione e di rilevamento Le proteine ​​sono state espresse sul dispositivo utilizzando coniglio reticolociti rapida trascrizione accoppiati e reazione traduzione (Promega). L&#39;espressione delle proteine ​​creato un array di proteine ​​pronti per l&#39;uso in una schermata vincolante (Figura 3). Un mix di espressione (12,5 pl) è stato caricato nel dispositivo e quindi allagato nelle camere di DNA aprendo le valvole di &#39;collo&#39;. Poi, i &quot;sandwich&quot; valvole eranochiusa lasciando ciascuna cella unitaria separato dalle cellule vicine e il dispositivo è stato incubato su una piastra calda per 2,5 ore a 30 ° C. Proteine ​​espresse diffusi attraverso la camera gene nella camera di reazione, dove il loro C-terminale His potrebbe impegnare la sua anti-anticorpo (Qiagen) localizzata sotto la valvola &#39;pulsante&#39; immobilizzare la proteina alla superficie. Le proteine ​​sono state marcate con un C-myc Cy3 (Sigma), che legato al suo epitopo corrispondente trova alla proteina N-terminale ed etichettato esso. Livelli di espressione di proteine ​​sono state determinate con uno scanner microarray (LS Reloaded, Tecan) utilizzando un laser a 532 nm e 575 nm filtro. La matrice risultante proteina consiste di diversi livelli di espressione della proteina. Solitamente, circa il 20% di una libreria genica non esprimono a livelli rilevabili. Alcuna correlazione con dimensioni proteina è stata osservata 3. Livelli di fondo sono stati determinati utilizzando camere che non sono stati macchiati con il DNA. Pertanto, i segnali dalle camere proteine ​​corrispondenti sono dovuti a noise o adsorbimento non specifico degli anticorpi etichettatura. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fabbricazione di chip. (A) stampi sono stati trattati con vapori TMCS per 10 min. (B) PDMS è colato sul controllo e stampi in silicone flusso. (C) Sia il controllo di flusso e stampi, cotta a 80 ° C per 30 min. (D) Il livello di controllo dello stampo pelati, tagliati a misura e ingressi di controllo sono un pugno. (E) Il livello di controllo è allineato al livello del flusso sotto uno stereoscopio e poi cotto in 80 ° C per 2 h. In parallelo alla fabbricazione del dispositivo PDMS, una serie di geni sintetici sono microarrayed su substrati di vetro rivestita epossidica (Associates CEL). (F) Il dispositivo viene quindi allineato al DNA microarray intrappolando i geni &quot;sintetici&quot; all&#39;interno delle camere di DNA. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Una foto del dispositivo PING. (A) Il dispositivo consist di due strati allineati PDMS (controllo e di flusso). Lo strato di flusso contiene parallele camere di DNA e reazione (grigio) controllati da valvole micromeccanici (&quot;bottone&quot;, &quot;panino&quot; e &quot;collo&quot;) nel livello di controllo. (B) Gli strati sono allineati ad un microarray stampati, quali programmi ciascuna camera di DNA con un singolo punto. Ciò elimina qualsiasi potenziale contaminazione. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Le immagini fluorescenti di una matrice di proteina creata con un chip. Microfluidic I geni in loco stampate sono state espresse le proteine ​​all&#39;interno del dispositivo (nella camera di DNA) e sono stati tirati fino alla superficie (sotto la valvola &quot;bottone&quot; nella camera di reazione), attraverso la loro C-terminale la sua tag. Espressione della proteina è stata rilevata utilizzando il loro C-myc N-terminale tag e uno specifico anticorpo fluorescente. Intensità di segnale diverse indicano diversi livelli di espressione della proteina. Un-spotted camere servito come controlli per sfondo levels.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo presentiamo un metodo per la generazione di matrici proteiche ad alto rendimento che utilizzano una piattaforma microfluidica. La generazione matrice si basa sulla stampa microarray di DNA e modelli in vitro espressione della proteina dal DNA nel dispositivo microfluidico. La nostra nuova piattaforma microfluidica ha diversi importanti vantaggi rispetto ai metodi attualmente in uso, che lo rendono uno strumento promettente e generale per la proteomica. Un vantaggi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Clorotrimetilsilano (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Substrati di vetro con vernice epossidica </td><td> CEL Associates USA </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poli etilene glicole (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trealosio diidrato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinilato-BSA </td><td> Perforare </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidina </td><td> Perforare </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> penta-His-biotina </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Industrie biologici</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc Cy3 anticorpo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Scatola di comando </td><td> Stanford microfluidica Fonderia </td><td></td></tr><tr><td> Stampo </td><td> Stanford microfluidica Fonderia </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England piccoli tubi Corporation </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore tubo </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Micro-distributore </td><td> Bio Robotica </td><td> Microgrid 610 </td></tr><tr><td> Silicone pin </td><td> Parallel Syntesi </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Campi in rapida crescita, come la biologia dei sistemi, richiedono lo sviluppo e l&#39;applicazione di nuove tecnologie, per misure ad elevata capacità e ad alta fedeltà dei sistemi di grandi dimensioni. Microfluidica promette di soddisfare molte di queste esigenze, ad esempio per eseguire esperimenti di high-throughput screening di on-chip, che comprende saggi biochimici, biofisici, e cellulare 1. Poiché i primi giorni di dispositivi microfluidici, questo campo è drasticamente evoluta, portando allo sviluppo di microfluidica larga scala di integrazione 2,3. Questa tecnologia consente l&#39;integrazione di migliaia di valvole micromeccanici su un unico dispositivo con una affrancatura dimensioni footprint (Figura 1). Abbiamo sviluppato un high-throughput piattaforma microfluidica per la generazione di espressione in vitro di allineamenti della proteina (Figura 2) nome PING (Protein Interaction Network Generator). Queste matrici possono servire come modello per molti esperimenticome proteina-proteina 4, proteina-RNA 5 o proteina-DNA 6 interazioni. Il sistema consiste di migliaia di camere di reazione, che sono individualmente programmati utilizzando un micro-distributore. Allineamento di questi microarray stampati a dispositivi di microfluidica programmi di ciascuna camera con un solo punto eliminando potenziale contaminazione o cross-reattività, inoltre, la generazione di microarray utilizzando tecniche standard di microarray avvistamento è molto modulare, che consente di formare gli array di proteine ​​DNA 7, 8, piccole molecole, e anche sospensioni colloidali. Il potenziale impatto di microfluidica nel campo delle scienze biologiche è significativo. Un certo numero di saggi basati microfluidica già fornito intuizioni nuove nella struttura e funzione dei sistemi biologici, e il campo di microfluidica continueranno a incidere biologia.

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High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Presentiamo un approccio microfluidica per l&#39;espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all&#39;uso sperimentale.

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  Bar-Ilan University. Presentiamo un approccio microfluidica per l'espressione di proteine ​​array. Il dispositivo consiste di migliaia di camere di reazione controllati da micro-valvole meccaniche. Il dispositivo microfluidica è accoppiato ad un microarray stampata libreria genetica. Questi geni sono poi trascritta e tradotta on-chip, risultante in un array proteico pronto all'uso sperimentale.

Video: High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: A High-throughput di 96-Well Piattaforma per la misurazione dei danni cagionati DNA in cellule umane Microarrayed

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Ricerca

Bioingegneria

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

High Throughput Microfluidic rapido ed economico prototipazione metodi a basso Packaging

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Spremere cellulare come un robusto, Microfluidic intracellulare Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

L&#39;uso di un high-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic sistema per sviluppare orale biofilm Multi-specie

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una piattaforma Microfluidic per l&#39;isolamento Single-cell high-throughput e cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Una piattaforma microfluidica multistrato per la conduzione di un'espressione genica prolungata senza cellule

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Una piattaforma microfluidica per stimolare i condrociti con la compressione dinamica

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

High-throughput generatore di espressione delle proteine ​​Utilizzando una piattaforma microfluidica

High-throughput generatore di espressione delle proteine Utilizzando una piattaforma microfluidica